叶绿体基因组微卫星标记(cpSSR)研究进展

随着测序技术的发展,叶绿体基因组微卫星标记(cpSSRs)的开发和应用越来越普遍。该研究介绍了叶绿体基因组分子标记的特点、用途、开发方法以及已开发的cpSSRs所具有的特点。随着cpSSRs开发成本的降低及研究技术的成熟,新的cpSSRs不断开发,将会有越来越多的叶绿体基因组SSR分子标记应用于群体遗传学、生物地理学和杂交育种的研究。其在野生植物进化过程研究中所具备的潜力在不久的将来将被充分认识和利用。

黄瓜叶绿体基因组全序列微卫星分布特征与标记开发

对黄瓜叶绿体基因组(chloroplast genomic DNA,cpDNA)全序列中微卫星(chloroplast simple sequence repeat,cpSSR)的分布特征进行了全面分析。结果发现,cpSSR主要分布在25～40kb和100～130kb两个区域,主要以完全重复和间隔重复为主。单碱基重复最多,占总数的79.3%,二碱基重复占10.1%,三碱基和三碱基以上重复仅占10.6%。单碱基重复主要以(A)n和(T)n为主,二者共占总数的78.8%,二碱基重复主要是(AT)n,占总数的9.3%。在重复次数分布上,完全重复的(A)n和(T)n均以最低重复次数为主,而间隔重复的(A)n和(T)n以14次或15次为多。设计了6对引物,对7份黄瓜自交系cpDNA进行扩增。结果发现,6对引物均有扩增产物,每对引物平均能检测到2.2个等位基因。几乎所有引物都能在甜瓜、西瓜、葫芦和栝楼中通用,5对引物在1～4种远缘种中有扩增产物。上述结果表明,从黄瓜cpDNA中发掘cpSSR标记是一条可行的途径。

田葛缕子叶绿体基因组微卫星特征分析

以田葛缕子幼嫩叶片为试材,采用CTAB法提取叶绿体DNA,测定并分析田葛缕子叶绿体全基因组序列(153697 bp),旨在研究田葛缕子叶绿体基因组微卫星(cpSSR)特征,为田葛缕子资源分子鉴定及遗传多样性研究提供参考依据。结果表明:MISA软件在田葛缕子叶绿体基因组序列中共识别出183个SSR位点,位点间平均分布距离为839.90 bp。其中109个cpSSR(占SSR位点总数的59.60%)主要集中于大单拷贝区(LSC),57.69%的SSR位点的重复序列主要以单碱基重复序列为主,且主要由A、T碱基组成。cpSSR长度主要为8~15 bp(占78.69%),大于15 bp的cpSSR共有31个,田葛缕子叶绿体基因组上的cpSSR位点具有多态性潜能。

叶绿体微卫星在植物种质资源研究中的应用

叶绿体微卫星(chloroplastsimplesequencerepeat,cpSSR)是近年来发展起来的一种新型高效的分子标记技术,由于具有微卫星标记共显性、高多态性、分布广泛性等优点又兼顾到叶绿体基因组结构简单、相对保守、单亲遗传等特点,目前广泛用于植物群体遗传分析及系统发育分析研究,在更高分类水平和自然植物群体间基因漂移研究上特别有用。本文就cpSSR分析技术的原理、特点、引物开发等方面进行了介绍,并针对其在群体遗传结构、基因流动进化、物种演化、胞质遗传特性、种群分类等方面的研究进展进行了综述,并据此提出问题和展望。

珍稀濒危飘带兜兰叶绿体全基因组种内变异研究

飘带兜兰(Paphiopedilum parishii)分布范围狭窄,仅在中国、缅甸、泰国以及老挝有少量分布。近年来,因生境破坏和人为滥采而导致飘带兜兰野生种群极度缩减。为开发种内多态性的分子标记用于保护生物学研究,该研究对飘带兜兰4个野生个体经测序、组装、注释获得的叶绿体基因组序列,与已公布的飘带兜兰2个个体的叶绿体全基因组序列进行比对,分析飘带兜兰叶绿体基因组的种内差异。结果表明:(1)飘带兜兰叶绿体基因组具有典型被子植物叶绿体基因组环状四分体结构,基因组长度为154 403~154 809 bp,共编码129个基因,包括78个蛋白质编码基因、39个tRNA基因、8个rRNA基因,以及4个假基因。(2)在飘带兜兰6个个体叶绿体基因组中检测到103~107个简单重复序列(simple sequence repeats, SSRs)位点,其中21个SSR位点具有多态性。此外,在6个个体叶绿体基因组中还检测到60个长序列重复,包括17~21个正向重复、18~29个反向重复、9~16个回文重复、4~9个互补重复。(3)通过比较6个个体叶绿体基因组序列的核苷酸多样性,共发现70处变异,包括10个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNPs)、60个插入缺失(InDels)。其中,有3个SNP位点发生了非同义替换,导致编码功能基因的氨基酸发生改变;19个插入缺失多态性较高,具有开发为分子标记的潜力。(4)通过计算核苷酸多样性值(Pi)共发现8个有变异的区域,Pi值为0~0.006 32,其中变异度较大的是rps3-rpl22、trnL-UAC-rpl32、rpoB-trnC-GCA以及ycf4,这些高变区可开发为分子标记用于评估飘带兜兰遗传多样性。(5)系统发生分析结果表明,飘带兜兰6个个体叶绿体基因组序列聚在一起,与长瓣兜兰互为姐妹群。综上表明,飘带兜兰叶绿体基因组的SSRs、长序列重复、SNPs、InDels以及核苷酸序列呈现了足够的种内多样性,可开发成分子标记用于该种的系统演化及保护生物学研究。

利用叶绿体微卫星标记分析东亚柳杉群体的谱系地理结构

柳杉(Cryptomeria japonica)是东亚特有孑遗植物,分为中国柳杉(C.japonica var.sinensis)和日本柳杉(C.japonica var.japonica)两个地理变种,但其谱系空间格局与形成机制仍不清楚。本研究利用叶绿体微卫星(cpSSR)标记,研究东亚柳杉群体的遗传多样性及其谱系地理结构,分析空间分布与现有谱系之间的关联。结果表明,11个cpSSR多态性位点共检测到127个单倍型,各群体的单倍型数(A)从4到16不等,不同群体私有单倍型数(P)为1~11个。在物种水平,柳杉遗传多样性高(H=0.890),且遗传分化显著(FST=0.594,P<0.001)。与其空间分布一致,基于cpSSR标记的STRUCTURE分析将柳杉分为中国柳杉和日本柳杉两大群体,群体间存在明显谱系地理结构(G_(ST)=0.102<R_(ST)=0.702)。结合气候变化资料,推测第四纪气候变化和长期地理隔离是东亚柳杉谱系地理格局形成的主要原因。研究结果可为东亚植物区系演化和柳杉遗传资源保护提供科学依据。

山核桃属叶绿体基因组微卫星特征分析及分子标记开发

本研究利用山核桃属6个不同物种的叶绿体基因组(chloroplast genome DNA, cpDNA)序列信息,分析其简单重复序列(chloroplast simple sequence repeat, cpSSR)特征及开发分子标记。结果表明,山核桃属各物种叶绿体平均长度为163 048 bp,每个基因组平均有224个微卫星,cpSSR分布频率平均约为1.37个/kb。山核桃属cpSSR以A/T类型的单核苷酸重复基序为主,占微卫星总数的85.79%,各物种碱基重复基序类型较为一致;cpSSR在叶绿体基因组上的分布主要集中在大单拷贝区(large single copy, LSC)和小单拷贝区(small single copy, SSC),在两个反向重复序列(inverted repeat sequence, IRa和IRb)分布最少;山核桃属各物种cpSSR主要分布于cpDNA的非编码区。以薄壳山核桃的cpSSR为基准,其他物种与其进行BLAST比对,结果发现共有62种cpSSR (包括34种完全型,28种复合型cpSSR)具有种间差异,对具有种间差异的cpSSR进行引物设计,共成功设计出61对引物。以山核桃属5个物种共9个样品的DNA为模板,对这61对引物进行PCR扩增。选用的61对引物中有49对引物扩增出的产物有目的条带,其中6对引物扩增良好,在种间具有明显的多态性。本研究为山核桃属植物的遗传多样性、系统发育、种质资源鉴定等研究提供理论基础。

蒙古莸叶绿体基因组微卫星位点分析及引物筛选

本研究旨在为蒙古莸在分子水平上提供理论依据,以便对濒危稀有种制定科学的保护策略。本研究下载GenBank数据库公布的蒙古莸叶绿体基因组信息,利用生物信息学对蒙古莸叶绿体基因组进行cpSSR分析。利用MISA软件全面搜索蒙古莸叶绿体基因组SSR分子标记,并对其分析;运用Primer Premier 3.0设计并筛选多态性较好的引物用于后续研究。在全长151 707 bp的蒙古莸叶绿体基因组中,共鉴定出31个cpSSR位点,位点间平均分布距离为4 893.77 bp,其中以单核苷酸重复为主,且主要分布于LSC区,占SSR位点总数的74.19%;其次是四核苷酸重复,分布于LSC及SSC两区,占SSR位点总数的19.35%,分布最少为三核苷酸,仅占总位点数的3.23%。将所有31个位点合成31对叶绿体微卫星引物,通过毛细管电泳检测,最终筛选出8对多态性引物。此外,挑选多态性好的马鞭草EST-SSR引物,扩增结果产生非特异性条带,且与马鞭草扩增片段范围相差较大。基于软件的参数设置,单核苷酸重复数量占比最多,三核苷酸重复占比最少;从31对引物筛选出8对多态性引物,扩增率达100%,多态率为26%;此外,马鞭草与蒙古莸的扩增条带范围相差较大,说明二者有较大差异的遗传背景。在此基础上,本研究为后续蒙古莸的种质鉴定、系统发育、群体遗传进化分析提供理论依据。

柑橘体细胞胞质遗传及叶绿体SSR引物开发

以38个组合的柑橘体细胞杂种（或胞质杂种）为试验材料,综合应用RFLP、CAPS和cpSSR分子标记技术,对这些杂种的线粒体和叶绿体遗传组成进行了分析;同时对试验技术体系进行了完善与拓展,开发了柑橘叶绿体SSR标记;并对柑橘愈伤组织长期继代保存过程中胞质基因组遗传变异进行了分析,主要结果如下：

山茶属叶绿体全基因组微卫星特征分析及标记开发

以山茶属9个组9个物种的叶绿体基因组(chloroplast genome DNA, cpDNA)全序列为研究对象,统计分析其简单重复序列(chloroplast simple sequence repeat, cpSSR)或称微卫星分布特征。结果表明山茶属各物种cpSSR数量及组成相对一致,不同微卫星重复基序中以三核苷酸基序为主,平均约占70%,随后是单核苷酸及二核苷酸基序。各物种单核苷酸和三核苷酸重复碱基类型较为一致,分别为A/T和AAG/TTC。比较叶绿体基因组的不同结构位置,各物种总的表现规律为小单拷贝区(small single copy, SSC) cpSSR分布比例最高,而反向重复区(inverted repeat, IR)最低;同时比较叶绿体基因组的不同功能区域,山茶属各物种的cpSSR主要分布于非编码区。cpSSR种间变异分析表明,cpSSR在山茶属内各组物种间差异较小,整体保持一个较高的一致性,说明山茶属是一个亲缘关系较近的属。对重复基序类型来说,单核苷酸重复基序cpSSR的变异率最高;在各结构域中,cpSSR在大单拷贝区(large single copy, LSC)的变异最大,变异比例占63.46%;而对功能区域来说,非编码区分布的cpSSR的变异率则高于编码区。研究同时建立了山茶属cpSSR分子标记体系,初步筛选出在种间具有较好多态性的cpSSR标记。本研究为今后山茶属多态性的cpSSR标记开发及应用提供重要的理论依据与物质基础。

板栗及其近缘种叶绿体SSR遗传多样性分析

为了探明板栗及其近缘种的亲缘关系并分析栗属的遗传多样性，基于叶绿体微卫星标记技术，选用4对呈现多态性的cpSSR引物，对板栗及其近缘种、野生种共6个种，56份材料进行遗传结构、遗传关系等分析。4个位点扩增等位基因数（Na）平均为3．25，有效等位基因数（Ne）平均为2．554，期望杂合度（He）平均为0．606，群体Nei’s遗传多样性（Hs）为0．320，

紫花凤梨叶绿体基因组微卫星特征分析

紫花凤梨(Tillandsia cyanea)是一种空气凤梨,具有很高的观赏价值。由于其基因组信息缺乏,其分子生物学相关研究鲜有报道。为研究紫花凤梨叶绿体微卫星(cpSSR)特征,本研究分析了紫花凤梨叶绿体全基因组序列(157602 bp),使用MISA软件共识别出204个SSR位点,位点间平均分布距离为772.6 bp。其中cpSSR主要集中于大单拷贝区(LSC),占SSR位点总数的64.22%。重复序列中主要以单碱基重复序列为主,占SSR位点总数的62.75%,主要由A/T碱基组成。cpSSR长度集中在8~20 bp,占95.10%,有10个cpSSR长度大于20 bp,这些cpSSR位点具有多态性的潜能。本研究结果为紫花凤梨的cpSSR引物筛选和遗传多样性等研究提供信息。

新疆濒危植物半日花居群的遗传变异及遗传结构分析

利用3个叶绿体微卫星多态性引物(包括mtrn Sf-trn Gr、mtrn L2-trn F和mtrn L5-trn L3)对新疆地区半日花(Helianthemum songaricum Schrenk)9个居群[分别位于伊犁河谷的军马场(JMC)、黑山头(HST)、科克苏(KKS)、种羊场(ZYC)、科博(KB)、龙口(LK)、喀拉布拉(KLBL)和拜什墩(BSD)以及河谷北部的博乐(BL)]92个单株的叶片总DNA进行了扩增,在此基础上,对各居群的遗传变异、地理分布、遗传多样性和遗传结构进行了分析。结果表明:3个叶绿体微卫星多态性引物共扩增出6个多态性位点;经分析,得到H1、H2、H3和H4 4个单倍型,其中,H1单倍型分布在JMC、HST、KKS、ZYC、KB和KLBL居群,H2单倍型仅分布在JMC居群,H3单倍型分布在LK和BL居群,H4单倍型仅分布在BSD居群。9个半日花居群总的遗传多样性指数较高(0.583),但居群内的遗传多样性指数却很低(0.040),居群间的遗传分化系数为0.932。主坐标分析(PCo A)将9个半日花居群划分成3个群体,其中,BSD居群单独为1个群体,BL和LK居群为1个群体,其余6个居群为1个群体;而亲缘关系树状图将这9个居群分成2支,其中,BL、LK和BSD居群为1支,其余6个居群为1支,说明BL、LK和BSD居群明显有别于其他居群。分子方差分析结果表明:半日花95.61%的遗传变异发生在群体间。Mantel检验结果表明:各居群间遗传距离与地理距离的相关系数为0.324,说明半日花居群间遗传距离与地理距离存在一定程度的正相关。研究结果显示:新疆地区半日花居群间发生了明显的遗传分化,并存在一定程度的地理隔离,这可能与小居群的遗传漂变和近交效应及居群间的地理障碍有关。建议对新疆地区半日花的全部居群、个体和原始生境进行保护,并对其天然居群采取复壮、迁地保护和划分居群管理单元等保护措施。

水稻白穗突变体基因的鉴定和染色体定位

从一个水稻籼粳交F6后代自然群体中获得1例白穗突变体,其成熟植株基部少数叶片中脉呈现白色,抽穗后穗粒内外稃和枝梗均表现白色.用突变体作母本与一粳稻恢复系品种制7杂交,获得一个F2分离群体.初步的遗传分析表明,该突变属单基因隐性性状.利用已定位的微卫星标记进行连锁分析,发现该基因位于水稻第1染色体上.进一步根据已完成的水稻基因组序列寻找微卫星位点,连锁分析显示,该基因位于微卫星标记SSR101和SSR63.9之间,分别相距2.3和0.8cM:并与微卫星标记SSR17呈共分离.该基因暂定名为wp(t).