水稻Rubisco激酶基因叶绿体转运肽增强转基因表达

将水稻RCA基因N端预测的转运肽(TP)序列融合报告基因GFP,构建瞬时表达载体pGD-RCATP-GFP,转化农杆菌后,注射侵染烟草叶片,通过荧光显微镜观察瞬时表达情况,结果表明外源蛋白GFP定位在叶绿体上,依此预测水稻RCA基因N端48aa为叶绿体转运肽。将该序列与报告基因GUS融合,构建植物表达载体p1300-RCATP-AGS,转化水稻后,检测阳性株叶片的GUS酶活,其GUS蛋白表达效率是未连有叶绿体转运肽的转基因植物的4.2倍左右。

微藻叶绿体细胞器工厂研究进展

微藻是重要的太阳能驱动CO_(2)生物转化的生物,建立微藻叶绿体细胞器工厂是通过合成生物学手段实现“碳中和”的潜在途径之一。这是因为微藻叶绿体是碳同化以及后续碳水化合物、脂肪酸、天然色素、氨基酸等重要合成器官,与高等植物细胞内具备多个相对较小的叶绿体不同,大部分微藻仅拥有一个占细胞体积50%以上的大叶绿体,更有利于获得纯净的株系,有望在食品、水产、医药、化学品、生物燃料等领域占据重要地位。微藻改造及微藻叶绿体细胞器工厂研究尚处于起步阶段,本文系统通过对现有转化、表达技术进展进行汇总和简要分析,对比了叶绿体直接转化和基于叶绿体转运肽的核转化叶绿体表达不同策略的优缺点,为后续发展提供借鉴。其中,靶向叶绿体基因组的直接转化策略应用较广泛,主要集中在莱茵衣藻中,已成功表达了100多种不同的蛋白质,但是叶绿体基因组可插入位点有限和调控手段相对缺乏;通过利用叶绿体转运肽,叶绿体中90%以上的蛋白都是核编码并被可控递送到叶绿体内,因此近年来基于叶绿体转运肽的核转化叶绿体定位表达技术的关注度得到了提升,并且已经在固碳、油脂生产调节方面展示出了一定优势。

拟南芥ats1A基因启动子的克隆和功能分析

通过PCR扩增,从拟南芥中克隆出ats1A基因启动子(包括叶绿体转运肽),将此启动子与GUS基因相连构建植物瞬时表达载体,用基因枪法将之导入烟草进行瞬时表达。GUS基因检测分析表明,ats1A基因启动子能特异的启动GUS基因在烟草叶片中高效表达。

草甘膦抗性和磷高效吸收复合基因转化玉米的研究

【目的】草甘膦是世界上用途最广的除草剂之一,磷是玉米生长发育所必需的大量营养元素,培育抗草甘膦兼具高效磷素吸收利用的复合性状对玉米生产有重要意义.【方法】构建由Ubiquitin1启动子驱动的两种叶绿体转运肽/CP4 EPSPs融合基因,和根特异性启动子GLU1P驱动的植酸酶基因phyA2双价植物表达载体,通过农杆菌介导法对玉米茎尖进行转化.对转基因植株进行实时定量PCR(RT-qPCR)分析、不同浓度草甘膦检测以及丙酮-磷钼酸铵法测定.【结果】获得9株阳性转基因植株;发现不同转运肽对EPSPs基因的表达量影响不同,且对草甘膦的抗性也不同;转基因植株植酸酶活性比野生型植株平均提高18.7倍.【结论】本研究为获得具有草甘膦抗性和磷素高效吸收利用复合性状的转基因玉米优良种质奠定了基础.

转1174AALdico-2+CTP耐草甘膦优异棉花种质系的创制及其特性

【目的】棉田杂草是限制棉花生长的因素之一,与棉花争夺营养、水分和光照,不仅影响棉花的生长发育,还影响棉花的产量和品质。通过基因工程途径培育高耐草甘膦优异棉花种质,实现棉田间化学除草,提高植棉的经济效益。【方法】将来源于耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)的EPSPS基因1174AALdico-2连接叶绿体转运肽,以35S为启动子,将2个目的基因串联后构建棉花转化载体。运用农杆菌活体转化技术,将目的基因导入棉花品种中棉所49,获得阳性转化体植株。以受体材料中棉所49和转化体自交分离得到的非转基因NON为对照,对转化体植株进行分子特征检测、草甘膦耐受性鉴定、农艺性状和经济性状等综合评价,以筛选出优良的转基因耐草甘膦棉花材料。【结果】通过农杆菌活体转化方法获得138个阳性转化体,对转化体植株进行目的基因PCR检测、Southern blot、Western blot分析和ELISA检测,从中筛选出17个分子特征明确、外源基因表达量高的阳性转化体。Southern blot和核苷酸测序结果表明,转化体插入位点和拷贝数各不相同,其中,ZD131、ZD185和ZD207等3个转化体为单拷贝插入位点,外源基因插入位点分别位于棉花D亚组第7染色体、D亚组第13染色体和A亚组第12染色体。草甘膦耐受性鉴定结果表明,17个阳性转化体均高耐草甘膦,其中ZD131、ZD185和ZD207等3个转化体的耐受性在3个世代之间稳定遗传,可耐4倍的田间草甘膦推荐剂量。农艺性状和经济性状评估结果表明,ZD131、ZD185和ZD207等3个转化体植株生长发育正常,表现出铃大、衣分高、结铃性强等特点,皮棉产量超过对照,纤维品质达到优质棉水平。【结论】将来源于耐辐射奇球菌的EPSPS基因1174AALdico-2与叶绿体转运肽连接,多基因串联后构建转化载体,农杆菌活体转化技术转入中棉所49,通过一系列筛选后获得3份优良的转基因耐草甘膦材料ZD131、ZD185和ZD207,该方法在提高棉花耐草甘膦水平的同时,也提高了转基因材料的农艺和经济性状。