藏系绵羊乙酰辅酶A合成酶2基因的生物信息学分析

对藏系绵羊乙酰辅酶A合成酶基因进行测序和序列分析,以期为近一步研究该基因及相关基因家族功能等研究提供素材.用Illumina HiSeq 2000测序技术获得ACSS2基因,进行生物信息学分析.结果显示:藏系绵羊ACSS2编码基因全长2106个bp,编码701个氨基酸。将测序获得的藏系绵羊ACSS2编码核苷酸及氨基酸序列分别与GeneBank中公布的牛、人、野猪、小鼠、大鼠这5种动物进行序列同源性比对,发现核苷酸序列同源性分别为97.9%,91.3%,90.9%,88.3%,88.1%,相应的氨基酸序列同源性分别为98.7%,93.7%,91.3%,92.2%,92.3%.表明动物的ACSS2基因具有高度保守性,种间差异较小.

柱状黄杆菌乙酰辅酶A合成酶基因及其上游调控序列分析

柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)是世界范围内危害淡水鱼类的柱形病的病原。目前对该病原菌遗传操作系统的研究进展较慢,而寻找高效稳定的启动子来调控外源基因在细菌体内的表达,有可能促进该细菌遗传操作系统的构建。本研究获得了柱状黄杆菌乙酰辅酶A合成酶基因(acetyl-coenzyme A synthetase gene,acs)的编码序列及其上游调控序列,该基因全长2 323 bp,编码635个氨基酸。通过序列分析,发现在该基因起始密码子ATG的上游存在核糖体结合位点(ribosome biding site,RBS)序列TAAAA,和启动子–7和–33的保守基序TATTTTCG和TTG。将acs的上游调控序列(promoter sequence,Pacs)置于氯霉素抗性基因(chloramphenicol acetyltransferase,cat)的上游并导入柱状黄杆菌G4株后,cat基因得以表达,并使宿主细胞产生稳定的氯霉素抗性。通过5′RACE技术,确定了外源的cat基因和内源的acs基因的转录起始位点都是位于起始密码子上游46 bp处的T。通过删减分析调控序列Pacs,发现起始密码子上游164 bp的序列是保持启动子活性所必需的。通过分析和比对32个基因的核糖体结合位点区域,在起始密码子上游10 bp处发现了RBS保守基序TAAAA。

提高光滑球拟酵母乙酰辅酶A水平促进α－酮戊二酸合成

【目的】为了了解光滑球拟酵母中乙酰辅酶A含量对其碳代谢及其通量的影响。【方法】将来源于酿酒酵母中编码乙酰辅酶A合成酶ACS2基因过量表达于发酵法生产丙酮酸的生产菌株Torulopsis glabrata中,获得了一株乙酰辅酶A合成酶活性提高9.2倍(1.20U/mg protein)的重组菌T.glabrata ACS2-1。【结果】与出发菌株WSH-IP303相比,重组菌T.glabrata ACS2-1:(1)能以乙酸为唯一碳源在胞内积累0.94mmol/(L·g DCW)的乙酰辅酶A;(2)以葡萄糖为唯一碳源时胞内乙酰辅酶A浓度、α-酮戊二酸产量和Cα-KG/Cpyr是出发菌株WSH-IP303的3.22、2.05和2.52倍;(3)在葡萄糖培养基中添加4g/L乙酸,使乙酰辅酶A浓度、α-酮戊二酸产量和Cα-KG/Cpyr是出发菌株WSH-IP303的4.55、2.47和3.75倍,α-酮戊二酸浓度达到17.8g/L。【结论】这一结果表明,改变细胞内关键辅因子的浓度能使碳代谢流的流向与通量发生改变,从积累丙酮酸转向过量积累α-酮戊二酸。

干扰乙酰辅酶A合成酶2对三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖及凋亡的影响

目的:研究乙酰辅酶A合成酶2(acetyl-CoA synthase 2,ACSS2)对三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖和凋亡的影响及可能的机制。方法:选用正常乳腺上皮MCF-10A细胞与三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法分别检测及比较两者ACSS2 mRNA和蛋白表达差异;设计并合成针对ACSS2的特异性干扰RNA(siRNA-ACSS2)及无序序列的阴性对照(siRNA-NC),分别瞬时转染MDA-MB-468细胞并采用qRT-PCR和蛋白质印迹法鉴定其干扰效果;采用CCK-8法检测转染后MDA-MB-468细胞增殖能力;流式细胞术检测MDA-MB-468细胞转染后细胞凋亡水平;蛋白质印迹法检测MDA-MB-468细胞中PI3K/AKT信号通路以及凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3、Bcl-2、Bax和增殖相关蛋白Ki-67等表达。结果:MDA-MB-468细胞中ACSS2 mRNA和蛋白表达水平明显高于MCF-10A细胞(P<0.01);与阴性对照组细胞相比,靶向干扰MDA-MB-468细胞ACSS2表达后细胞增殖活力明显下降(P<0.01),细胞凋亡水平明显上升(P<0.01),p-PI3K、p-AKT、Ki-67和Bcl-2表达明显降低(P均<0.01),cleaved-caspase-3、Bax表达明显上升(P均<0.01)。结论:干扰ACSS2表达可能通过PI3K/AKT信号通路抑制MDA-MB-468细胞增殖和促进凋亡发生。

敲低乙酰辅酶A合成酶短链家族成员2(ACSS2)抑制营养缺乏诱导的宫颈癌细胞迁移和侵袭及机制

目的探讨营养缺乏诱导的乙酰辅酶A合成酶短链家族成员2(ACSS2)表达上调对宫颈癌细胞侵袭和迁移能力的作用机制.方法免疫组织化学染色法检测井比较20对宫颈癌组织及癌旁组织中ACSS2的表达差异.培养宫颈癌HeLa细胞和HCvEpC宫颈正常上皮细胞,将培养血清由100 ml/L降至10 mL/L进行营养缺乏处理.Western blot法检测细胞ACSS2及GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin、E-actin、E-cadherin、vimentin的蛋白水平.小干扰RNA(siRNA)靶向下调ACSS2表达,划痕实验检测细胞迁移能力的改变,Transwell^TM实验观察细胞侵袭能力.结果与癌旁正常组织相比,宫颈癌瘤体组织中ACSS2表达较高;营养缺乏处理可上调宫颈癌HeLa细胞ACSS2蛋白水平,HCvEpC宫颈正常上皮细胞未见明显变化;营养缺乏处理可以促进HeLa细胞上皮间质转化(EMT)发生,靶向抑制ACSS2可有效逆转这一进程;营养缺乏处理促使HeLa细胞愈合率增加,敲低ACSS2愈合率降低;营养缺乏处理上调宫颈癌细胞的侵袭能力,敲低ACSS2侵袭细胞数减少;营养缺乏处理48 h后,宫颈癌细胞中ACSS2、磷酸化的糖原合成酶激酶-3β(p-GSK-3β)以及核内β-catenin蛋白表达均有升高;敲低ACSS2后,可抑制营养缺乏诱导的Wnt/β-catenin信号活化.结论敲低ACSS2水平可以有效逆转营养缺乏诱导的宫颈癌侵袭和迁移,可能与抑制Wnt/β-catenin信号活化相关.

乙酰辅酶A合成酶2低表达人胃癌细胞株MGC80-3的顺铂敏感性观察

目的观察乙酰辅酶A合成酶2(ACSS2)低表达人胃癌细胞株MGC80-3的顺铂敏感性,并进一步探讨其可能作用机制。方法 采用Western blotting法检测人胃癌细胞株MGC80-3、AGS、SGC-7901、NCI-N87以及正常胃黏膜上皮细胞系RGM-1中ACSS2蛋白。对数生长期MGC80-3细胞分为A、B、C、D组,B及D组分别加入10 μL脂质体Lipofectamine 2000+5 μL siRNA-ACSS2转染, C组加入及A组分别加入50 μL无血清纯RPMI1640培养基+5 μL 阴性对照(NC);A组、B组均培养72 h,C组培养48 h时加入5 μg/mL的顺铂(DDP),D组转染48 h时加入5 μg/mL的DDP。培养24 h时,CCK8法检测各组细胞增殖活力,培养48、72 h时流式细胞分析术测算各组细胞早晚期凋亡率,Western blotting法检测各组细胞ACSS2、p65、p-p65、B淋巴细胞瘤-2蛋白(Bcl-2)、B细胞淋巴瘤-特大型蛋白(Bcl-xL)、凋亡蛋白Bcl-2相关的X蛋白(Bax)。结果 MGC80-3、AGS、SGC-7901、NCI-N87及RGM-1细胞ACSS2蛋白相对表达量分别为0.80± 0.03 、0.62±0.04、0.60±0.04、0.72±0.05、0.41±0.04。与RGM-1细胞比较,MGC80-3、AGS、SGC-7901、NCI-N87细胞ACSS2相对表达量升高( P 均<0.01)。A、B、C、D组细胞增殖活力分别为98.67%±4.89%、92.67%±7.86%、62.67%± 4.05%、34.67%±7.61%,A组与B组相比无明显差异( P >0.05);与A组比较,C组细胞增殖活力下降( P < 0.001 );与B、C组比较,D组细胞增殖活力均下降( P 均< 0.001 )。A、B、C、D组早期细胞凋亡率分别为1.06%±0.02%、1.13%±0.08%、7.62%±0.55%、14.33%±0.21%,晚期细胞凋亡率分别为8.01%± 0.05%、8.13%±0.06%、10.81%±0.43%、15.98±0.18%。与A组比较,C、D组细胞早、晚期凋亡率均升高( P 均<0.05);与B组比较,D组早、晚期凋亡率均升高( P 均<0.05);与C组比较,D组细胞早、晚期凋亡率均升高( P 均< 0.05 )。与A组比较,C组p-p65、Bax蛋白相对表达量升高,Bcl-2、Bcl-xL相对表达量降低( P 均<0.05);与B组比较,D组细胞p65、p-p65、Bcl-2、Bcl-xL相对表达量均降低、Bax相对表达量升高( P 均<0.05)。结论 ACSS2低表达的MGC80-3细胞DDP敏感性升高。ACSS2可能通过调控NF-κB信号通路及Bcl-2、Bcl-xL、Bax蛋白的表达提高MGC80-3细胞的DDP敏感性。

乙酰辅酶A合成酶/一氧化碳脱氢酶的EPR研究

来源于厌氧微生物的乙酰辅酶A合成酶/一氧化碳脱氢酶(ACS/CODH)含有金属Ni和Fe所组成的多达7个金属簇中心,能够催化CO和CO2的可逆氧化还原,并利用CO/CO2和H2作为碳源和能源合成乙酰辅酶A.近年来,随着全球能源危机和温室效应等环境问题的加重,这类金属蛋白酶的研究日益成为人们关注的热点.电子顺磁共振光谱(EPR)作为一种研究金属价态和配位结构的有效技术,从20世纪80年代开始便被广泛地应用到该酶的研究中.该文将从ACS/CODH的各个金属簇中心入手,介绍每个金属中心的结构、功能和EPR研究.

乙酰辅酶A合成酶2在肿瘤发生发展中的研究进展

乙酰辅酶A是肿瘤快速生长过程中不可或缺的合成代谢原料,根据瓦伯格效应,肿瘤细胞无法通过丙酮酸氧化脱羧产生乙酰辅酶A,其乙酰辅酶A主要由乙酰辅酶A合成酶2(ACSS2)催化短链脂肪酸所合成,即乙酸+辅酶A+ATP=乙酰辅酶A+二磷酸+AMP,表明了ACSS2在维持肿瘤细胞生长方面至关重要。近年来,越来越多的证据表明,ACSS2活性和表达异常与肿瘤增殖、侵袭、转移、抗凋亡和耐药性等密切相关,该文围绕ACSS2在肿瘤中的相关作用及机制的研究进展进行了综述。

钝齿棒杆菌异源表达乙酰辅酶A合成酶对L-精氨酸合成的影响

L-精氨酸是一种人体必需氨基酸,在医疗保健、食品添加等制造行业中商业价值显著。针对1株产L-精氨酸的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5进行代谢改造,通过比较异源乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthetases,ACS)的酶学性质,构建了过表达ACS的重组钝齿棒杆菌SYPA-ACS,能有效利用乙酸提高菌株产L-精氨酸能力。首先在大肠杆菌中分别克隆表达及纯化4种不同细菌来源的ACS,发现巴氏醋酸杆菌(Acetobacter pasteurianus)ATCC 33445来源的ApACS1酶活力最高,为784.59 U/mL,最适反应的pH为7.0,最适反应温度37℃,与其他3种ACS来源相比,ApACS1具有更好的pH和温度稳定性。然后通过pXMJ19载体,将A.pasteurianus来源的编码基因acs_(1)在C.crenatum中表达,有效提高了乙酰辅酶A含量。利用5 L发酵罐,将SYPA-ACS菌株培养96 h后,L-精氨酸的产量达53.43 g/L,产率为0.577 g/(L·h),相较于出发菌株SYPA5-5,产量提高了27.48%。该策略既可以利用乙酸,降低乙酸对菌株的危害作用,又能提高乙酰辅酶A的含量,促进L-精氨酸的积累。研究结果为L-精氨酸的制备提供了绿色、高效的合成策略,具有工业化应用潜力。

鱼腥藻PCC 7120乙酰辅酶A合成酶All0769的缺失降低异形胞频率

研究鉴定了All0769为鱼腥藻PCC 7120中乙酰辅酶A合成酶,通过CRISPR/Cpf1系统敲除鱼腥藻PCC 7120中的乙酰辅酶A合成酶(由all0769编码),探究了乙酰辅酶A合成酶在异形胞分化中的调控机制。结果所示:All0769能在体外反应中催化乙酰辅酶A的生成。在供氮环境下,敲除all0769会影响藻细胞生长速率。而无论环境中是否存在化合氮,Δall0769突变株的乙酰辅酶A和α-酮戊二酸含量均显著减少。在供氮环境下,Δall0769突变株中检测到(26.17±1.55)nmol/mg protein的乙酰辅酶A,而在野生型中检测出(43.04±1.09)nmol/mg的乙酰辅酶A。Δall0769突变株的α-酮戊二酸[(1.41±0.24)nmol/mg protein]低于野生型的α-酮戊二酸[(2.13±0.05)nmol/mg protein]。在缺氮环境下,Δall0769突变株中检测到(10.00±2.81)nmol/mg protein的乙酰辅酶A,而在野生型中检测出(29.82±4.04)nmol/mg protein的乙酰辅酶A。Δall0769突变株的α-酮戊二酸含量[(1.48±0.35)nmol/mg protein]低于野生型的α-酮戊二酸[(2.74±0.33)nmol/mg protein]。此外,Δall0769突变株异形胞分化频率(7.12%)显著低于野生型异形胞分化频率(9.22%)。综上所述:文章鉴定了All0769是鱼腥藻PCC 7120中的乙酰辅酶A合成酶。在鱼腥藻PCC 7120中,缺失乙酰辅酶A合成酶(All0769)会减少乙酰辅酶A的含量,进而下调α-酮戊二酸含量使异形胞频率降低。

乙酰辅酶A合成酶2对海马记忆的影响及潜在应用前景

乙酰辅酶A合成酶2(acetyl coenzyme A synthe⁃tase 2,ACSS2)是乙酰辅酶A合成酶家族的重要成员,由ACSS2基因转录而来。ACSS2具有脂肪合成酶和应激反应调节剂的双重性质[1]。ACSS2定位于细胞质和细胞核,定位于胞质的ACSS2主要参与肿瘤的发生发展,而定位于胞核的ACSS2在组蛋白乙酰化和组织特异性基因表达调控中发挥重要作用,以调控生物表观遗传。

乙酰辅酶A合成酶家族中保守的色氨酸残基的生化功能（英文）

甲烷菌与甲烷八叠球菌是仅有的两种已知利用乙酸盐进行甲烷生成的菌属。稻田以及厌氧的废物分解物是甲烷生物生成的主要来源。甲烷菌在自然界广泛分布,相比甲烷八叠球菌,在低乙酸盐的环境中对乙酸盐仍有高亲和力。在甲烷生成第一步即将乙酸盐转化为乙酰辅酶A的过程中,与甲烷八叠球菌利用乙酸激酶与磷酸转乙酰酶激活途径不同,甲烷菌通过腺嘌呤形成乙酰辅酶A合成酶进行催化。在甲烷菌一属(Methanosaeta concilii)中,共发现5个乙酰辅酶A合成酶的编码基因,其中3种乙酰辅酶A合成酶的生化及酶活特性已被确定。该3种乙酰辅酶A合成酶均以乙酸盐为其最优底物。尽管在短链乙酰辅酶A合成酶家族中,发现酰基底物结合位点高度保守,但乙酰辅酶A合成酶家族的酰基底物范围极为广泛。本研究对甲烷菌中不同种乙酰辅酶A合成酶的酰基底物结合位点的关键氨基酸进行识别与比较,从而对乙酰辅酶A合成酶家族的酶活特性有更全面深入的了解。首先,我们对甲烷菌一属中乙酰辅酶A合成酶4进行生化性质测定。结果表明,该酶无催化一系列酰基底物为酰基辅酶A或其中间产物酰基腺苷酸的活性。通过序列对比发现,嗜热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1中高度保守的416位色氨酸残基在甲烷菌一属的乙酰辅酶A合成酶4中被替换成528位苯丙氨酸残基。将甲烷菌一属的乙酰辅酶A合成酶4中的528位苯丙氨酸残基点突变为色氨酸残基后,进行酶学性质测定,未检测到该突变体具有乙酰辅酶A/乙酰腺苷酸合成活性。我们进一步对嗜热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1中的416位色氨酸残基点突变为苯丙氨酸残基,酶活性质结果显示,突变酶对于乙酸盐以及丙酸盐作为底物时的活性未有明显差异。然而,以丙酸盐为底物时,释放丙酰腺苷酸中间产物。该结果表明,热自养甲烷杆菌的乙酰辅酶A合成酶1对于底物乙酸盐或丙酸盐的催化作用不甚相同,苯丙氨酸中的苯甲酰环降低该酶保留中间产物丙酰腺苷酸,从而转化为丙酰辅酶A的能力。

下调乙酰辅酶A合成酶2通过诱导自噬抑制非小细胞肺癌细胞增殖

目的:探讨乙酰辅酶A合成酶2(ACSS2)在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞中的表达及其对细胞增殖、侵袭的调控机制。方法:采用蛋白质印迹(Western blot)实验检测并分析NSCLC细胞系A549和H1299与人成纤维细胞HFF-1中ACSS2表达的差异。利用慢病毒在NSCLC细胞系中构建ACSS2敲低(ACSS2 KD组)和对照细胞系(NC组)。采用MTT实验及细胞克隆形成实验分析ACSS2对NSCLC细胞增殖的影响。采用划痕实验和Transwell实验分析ACSS2对NSCLC细胞的迁移和侵袭能力的影响。Western blot及免疫荧光实验分析敲低ACSS2对细胞自噬的影响。结果:与人成纤维细胞HFF-1相比,NSCLC细胞中ACSS2的蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。与NC组相比,ACSS2 KD组细胞增殖能力和细胞活力显著降低,ACSS2 KD组细胞的迁移和侵袭能力均明显降低(均P<0.01)。Western blot和免疫荧光实验显示,敲低ACSS2细胞自噬活性明显增加,自噬小体增多(P<0.01)。但是,敲低ACSS2几乎不影响caspase3和caspase8的蛋白表达水平(P>0.05)。ACSS2-sh RNA+Beclin1/Atg7-sh RNA共转染A549细胞(ACSS2+Beclin1/Atg7 KD组),结果显示与ACSS2KD组比,ACSS2 KD+Beclin1/Atg7 KD组细胞增殖能力有所增强,克隆形成数目明显增多(P<0.05)。结论:ACSS2在NSCLC细胞中高表达,促进细胞的增殖、侵袭。下调ACSS2可诱导NSCLC细胞发生自噬性细胞死亡,抑制细胞增殖。

苜蓿根瘤菌乙酰-CoA合成酶的过量表达、纯化及特性

PCR扩增了苜蓿根瘤菌乙酰辅酶A合成酶编码基因 (acsA1) ,克隆到连接 -非依赖型载体pET30LIC ;在E .coliBL2 1(DE3)pLysS中得到了有效表达 ,表达需IPTG的诱导 ,诱导 3h达到酶活高峰 .采用His·Bind柱层析对ACS进行了纯化 ,纯化的酶蛋白经SDS-PAGE呈单一浓带 ,分子量约 72 0 0 0 ,具较高的酶活 ,是无细胞提取液的 12 .7倍 .酶动力学分析显示 ,Vmax、Km分别为 (4 13.6± 11.7)mmolL-1和 (5 .8± 0 .6 )mmolL-1.图 4表 2参

大肠杆菌醛醇脱氢酶的纯化、分析及其在乙酰辅酶A测定中的应用

为了连续测定乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthetase,ACS)催化的乙酰辅酶A(acetyl coenzyme A,Ac-CoA)合成,探讨以醛醇脱氢酶(aldehyde/alcohol dehydrogenase,AdhE)为偶联酶检测ACS活性的可行性.以大肠杆菌(Escherichia coli K12)基因组为模板扩增、克隆AdhE基因,通过原核表达、纯化获得AdhE,对其进行了酶学动力学分析,并进一步以AdhE为偶联酶对ACS活性进行了测定.结果发现:AdhE的k_(cat)为13.8 min-1,Ac-CoA和NADH的K_(m)分别为52.8和73.4μmol·L^(-1);ACS的k_(cat)为10.5 min^(-1),乙酸和ATP的K_(m)分别为1.31和0.15 mmol·L^(-1).表明基于AdhE的Ac-CoA检测体系切实可用,为Ac-CoA合成反应的连续测定奠定了良好的基础.

调控乙酰CoA合成酶表达促进乙酸利用及GlcNAc合成

N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)是一种重要的功能单糖。在利用枯草芽孢杆菌发酵产GlcNAc的过程中,乙酸的积累严重抑制了细胞生长和GlcNAc合成。为了获得高效利用乙酸生产GlcNAc的微生物细胞工厂,作者通过突变乙酰CoA(Ac-CoA)合成酶编码基因acsA 5′UTR区域内全局转录调控因子CodY结合序列,调控acsA转录水平,进一步突变AcsA乙酰化调控位点,解除乙酰化修饰,促进乙酸转化为Ac-CoA,最终乙酸积累量由6.3 g/L减少到3.6 g/L,同时细胞干重(DCW)由2.7 g/L增加到5.3 g/L,GlcNAc产量由1.9 g/L提高到5.0 g/L,为进一步获得高产GlcNAc细胞工厂提供了基础。

嗜盐单胞菌利用乙酸盐合成PHB的研究

首先测试了嗜盐单胞菌Halomonas sp.TD1.0对乙酸钠的耐受性,结果显示乙酸钠浓度由25 g·L^(-1) 提高到100 g·L^(-1) 时对TD1.0生长的抑制率只有45.8%。在摇瓶培养中,TD1.0在36 h内消耗完27.3 g·L^(-1) 乙酸钠,细胞干质量达到9.6 g·L^(-1) ,其中PHB质量分数为61%,表明该菌株具有很好的高浓度乙酸钠耐受性和利用乙酸合成PHB的特性。随后为进一步提高乙酸钠的利用速度,在TD1.0中分别用高拷贝和低拷贝表达载体表达了来自枯草芽孢杆菌的乙酰辅酶A合成酶基因acs,结果显示,含有高拷贝表达质粒的菌株TD-PN59的乙酸盐平均利用速率为0.91 g·L^(-1) ·h^(-1),比TD1.0提高了19.7%。TD-PN59的细胞干质量和PHB质量分数分别达到9.98 g·L^(-1) 和65%,PHB产量达到6.49 g·L^(-1) ,比TD1.0提高了约10.8%。在以葡萄糖和乙酸钠为混合碳源(10 g·L^(-1) Glu和10 g·L^(-1) NaAC)的培养基中,利用低拷贝载体表达acs的TD-PN85菌株的乙酸钠利用速率显著高于TD1.0,并且在一定程度上缓解了碳分解代谢物阻遏现象(CCR),促进了葡萄糖和乙酸钠的共利用。

乙酰辅酶A合成代谢对酿酒酵母生理功能的影响

【目的】研究酿酒酵母（Saccharomycesc erevisiae）中乙酰辅酶A合成酶基因ACS1和ACS2的生理作用。【方法】将来源于S.cerevisiae的ACS1和ACS2分别进行过量表达,研究过量表达ACS1和ACS2后S.cerevisiae胞内乙酰辅酶A含量、ATP水平、甲羟戊酸途径转录和乙醇耐受性等生理学特性变化。【结果】与出发菌株相比,过量表达ACS1和ACS2使得：（1）胞内乙酰辅酶A含量提高了2.19倍（ACS1）和5.02倍（ACS2）;（2）胞内ATP含量提高了3.93倍（ACS1）和2.05倍（ACS2）;（3）甲羟戊酸途径8个关键基因表达量显著上调;（4）S.cerevisiae对乙醇胁迫抵御能力显著增强。过量表达ACS1对乙醇胁迫的耐受能力强于过量表达ACS2。【结论】增加胞内乙酰辅酶A的含量可以显著增加甲羟戊酸途径碳代谢流量,并增强S.cerevisiae对发酵过程主要副产物乙醇的耐受能力。

热稳定性丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶异源表达及其在乙酰辅酶A合成中的应用

乙酰辅酶A被广泛应用到生物医学研究中,使用TPP代替昂贵的ATP为辅因子合成乙酰辅酶A受到广泛关注。新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)来源的丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(Tn PFOR)在大肠杆菌中进行了重组表达,分析了其酶学特性,并探讨了利用嗜热酶(TnPFOR)酶法合成乙酰辅酶A。采用pET-20b(+)载体,将新阿波罗栖热袍菌来源的四亚基组成的嗜热酶(Tn PFOR)在大肠杆菌中进行异源表达;通过热处理和阴离子交换层析法纯化嗜热酶(TnPFOR);重组表达的嗜热酶(TnPFOR)的最适反应温度和pH分别为90℃和6.5,TnPFOR在90℃下孵育1h时保留了50%活性。利用嗜热酶(Tn PFOR),以TPP为辅酶合成了乙酰辅酶A,并探讨了不同温度、丙酮酸钠底物浓度和反应时间对乙酰辅酶A合成的影响。得到的优化条件为:最适反应温度为90℃,丙酮酸钠浓度为1.5mmol/L,反应时间为2min。

乙酰辅酶A合成酶2在胰腺癌的表达及意义

目的探讨乙酰辅酶A合成酶2(ACSS2)在胰腺癌中的表达及意义。方法采用免疫组织化学染色法检测ACSS2在胰腺癌组织及其癌旁正常组织中的表达,RT-PCR法检测胰腺癌组织和细胞中ACSS2mRNA表达。将ACSS2干扰RNA(si-ACSS2组)及阴性对照(NC组)均分别转染胰腺癌细胞系PANC-1和MIAPaCa-2后,采用CCK-8法检测胰腺癌细胞增殖,Transwell实验检测胰腺癌细胞侵袭和迁移,Westernblot法检测胰腺癌细胞中上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的蛋白表达。结果ACSS2在胰腺癌组织中的表达高于癌旁正常组织(P<0.05)。胰腺癌组织中ACSS2mRNA表达高于癌旁正常组织(P<0.01);胰腺癌细胞系PANC-1、BxPC-3、MIAPaCa-2、AsPC-1中ACSS2mRNA表达亦高于人胰腺导管上皮细胞(P<0.05或P<0.01)。与NC组相比,si-ACSS2组PANC-1和MIAPaCa-2细胞增殖、侵袭和迁移减少,E-cadherin蛋白表达增加,而Vimentin蛋白表达减少(P<0.05)。结论ACSS2高表达于胰腺癌组织和细胞,下调ACSS2表达可抑制胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移。ACSS2与上皮-间质转化通路相关,有望成为胰腺癌生物治疗的潜在靶点。