铂电极表面生物素-亲和素固载单链脱氧核糖核酸的电化学传感器

通过直接吸附将亲和素固定在Pt电极表面,联于生物素标记的脱氧核糖核酸(DNA)探针,制备了电化学基因传感器,建立了Pt电极表面修饰单链脱氧核糖核酸(ssDNA)的方法。修饰电极与待测溶液中人工合成的转基因食品中常有的花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)或根癌农杆菌终止子(NOS)DNA片段进行杂交,以邻菲罗林钴络合物[Co(phen)3+3]为杂交指示剂,循环伏安法测量,通过杂交前后指示剂峰电流的变化检测DNA杂交的量。研究了电极修饰、杂交反应及测量的适宜条件,在优化实验条件下,峰电流的差值与DNA杂交量之间有良好的线性关系,相关系数r=0.9996。杂交后的电极经热变性再生,可重复使用多次。

锰职业暴露工人血清γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶信使核糖核酸表达水平和谷胱甘肽过氧化物酶活力变化的研究

目的探索锰职业暴露对工人血清γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶信使核糖核酸(γ-GCS mRNA)表达水平和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力变化的影响,为锰中毒早期诊断提供科学依据。方法于2017年6月,采用分层随机抽样方法选择某摩托车生产企业人员180人为调查对象,其中电焊工为暴露组,共115人,行政办公人员为对照组,共65人,对暴露组工作场所空气锰浓度进行检测,并根据检测结果是否超过标准限值将暴露组分为高暴露亚组(43人)和低暴露亚组(72人)。对所有调查对象进行职业健康调查,采集静脉血测定γ-GCS mRNA表达水平和GSH-Px活力,分析不同组间血清γ-GCS mRNA表达水平和GSH-Px活力差异及影响因素。结果与对照组比较,暴露组工人血清GSH-PX活力较低,血清γ-GCS mRNA表达水平较高,差异均有统计学意义(F=370.52、275.95,P<0.01),低暴露亚组和高暴露亚组工人血清γ-GCS mRNA表达水平和GSH-Px活力差异有统计学意义(F=0.48、1.06,P<0.01;F=48.53、111.70,P<0.01)。工作场所空气锰浓度、电焊烟尘浓度和工人尿锰浓度与血清γ-GCS mRNA表达水平呈正相关性(r=0.71、0.49、0.31,P<0.01);工作场所空气锰浓度、电焊烟尘浓度和工人尿锰浓度与血清GSH-Px活力呈负相关性(r=-0.80、-0.52、-0.30,P<0.01);而年龄和接害工龄与血清γ-GCS mRNA表达水平和GSH-Px活力无相关性(P>0.05)。结论血清γ-GCS mRNA表达水平和GSH-Px活力可能是锰中毒早期生物标志物,工作场所空气锰浓度、电焊烟尘浓度和工人尿锰浓度水平是血清γ-GCS mRNA表达水平和GSH-Px活力的影响因素。

不同转染方式用于modRNA转染人脂肪干细胞的初步研究

目的筛选更优的转染方式,探讨其用于modRNA转染人脂肪干细胞(Human adipose-derived stem cell,hADSC)并表达特定蛋白的可行性。方法分别采用2种电转染方式Optimization4及Optimization6和脂质体转染试剂RNAiMAX,将modGFP转染到hADSC中去。应用流式细胞分析仪和荧光显微镜分析,比较不同转染方式的转染效率和蛋白表达情况;通过细胞死活染色,评估转染后24 h细胞的存活情况;将更优的电转方式与RNAiMAX用于modVEGFA转染hADSC,收集其培养24 h的上清用于人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,hUVECs)成管和transwell迁移实验,并与基质胶混合后注射于裸鼠皮下,通过大体观、HE染色及免疫荧光染色,分析其在体内促进血管再生的情况。结果Optimization6电转转染hADSC的效率为87.75%±1.52%,高于Optimization4转染组(80.85%±1.48%)和RNAiMAX转染组(81.80%±1.08%),且荧光显微镜观察及流式分析均表明电转染方式的蛋白表达优于RNAiMAX脂质体转染。3种转染方式对细胞的毒性均较小,无统计学差异。与RNAiMAX相比,Optimization6电转能更高效地介导modVEGFA转染hADSC,能更好地促进体外hUVECs成管和迁移,皮下血管再生的效果也更佳。结论相比于RNAiMAX和Optimization4电转染,Optimization6电转方式转染hADSC的效率更高,蛋白表达高效,且能在体内外快速高效促进血管再生。

mRNA技术在疫苗领域的探索与实践

mRNA疫苗是将编码抗原的mRNA递送到人体细胞内,在细胞内翻译后产生相应的抗原蛋白,从而诱导机体产生有效的免疫反应。与传统疫苗相比,mRNA疫苗安全性好、研发周期短、免疫效力高,可以同时刺激细胞免疫反应和体液免疫反应。随着核苷酸修饰技术和递送技术的发展,mRNA疫苗也迎来了广阔的应用前景。本文对mRNA技术及其在疫苗领域的应用进行综述,以期为正在或即将开展mRNA疫苗研发工作的学者提供理论和实践指导。

日本开发出合成蛋白质技术

日本爱媛大学教授远藤弥重太研究成功一种大量合成蛋白质的技术，用它合成蛋白质产量要比用现有方法高5倍多。据当地媒体报道，新技术的关键物质是从小麦的胚芽细胞中提取出的核蛋白体，它是细胞合成蛋白质的“工厂”。科学家将这种核蛋白体与信使核糖核酸（mRNA）、合成原料氨基酸一起放入容器里发生反应，在两、三天之内就能大量合成所要获得的蛋白质。研究发现，这种方法比使用动物的核蛋白体合成蛋白质产量要高5至10倍。

日本研究成蛋白质合成新技术

日本三菱化学公司和东洋纺织公司最近合作研制出可在短时间内大量合成开发药品所需蛋白质的新技术。新技术的关键是从小麦胚芽细胞中萃取核糖体。在需合成某种蛋白质时,把这种蛋白质的基因复制品(信使核糖核酸)以及蛋白质的原材料(氨基酸)与核糖体一起放入容器内进行反应。其合成蛋白质数量可达传统方法的10倍左右。

电转方法用于modRNA转染细胞的初步研究

目的探讨电转方法用于modRNA转染细胞的可行性,并筛选出不同细胞电转所需的最适电压和脉冲时间。方法①筛选电转EGFPmodRNA进入人成纤维细胞的最佳电压和脉冲时间参数;②在此基础上将人成纤维细胞转染nGFP/EGFP+mCherrymodRNA;③将Hela、293T、3T3三种常见贴壁细胞电转EGFPmodRNA。结果①人成纤维细胞电转modRNA的最适电压为440V,最适脉冲时间为30ms;②nGFP可在核内表达,EGFP和mCherry两种蛋白可同时在胞质中表达;③Hela、293T、3T3细胞电转最适电压分别为425V、400V和440V,最适脉冲时间均为30ms。结论本实验证明①电转法转染modRNA进入细胞质和细胞核的可行性;②可同时将两种modRNA导入同一个细胞内并表达;③最适电压和最适脉冲时间需根据不同的细胞种类分别筛选。

脂质体方法用于modRNA转染各种类型细胞的初步研究

目的筛选更优的脂质体转染试剂,探讨其用于modRNA转染各种类型细胞并表达所需目的蛋白的可行性。方法分别用RNAiMax及MessageMax将modGFP转染入MEF细胞,应用荧光显微镜、流式细胞分析仪检测并比较两种转染试剂的转染效率和蛋白表达效果。将更优的转染试剂用于modGFP转染其他各种类型细胞的实验中,采用同样的方法分析modGFP的转染效率及蛋白表达情况。将modGFP与modmCherry共转MEF细胞,荧光显微镜观察共转的情况。将modnGFP及modmTBX5转染MEF细胞,荧光显微镜观察核内蛋白的表达情况。结果MEF细胞转染modGFP 24 h后,流式分析发现MessageMax的转染效率为(83.33%±3.23%),略高于RNAiMax的(78.77%±6.12%),两者没有统计学差异,但是流式分析和荧光显微镜观察均表明MessageMax转染后1周内的蛋白翻译表达效率更高,是更高效的modRNA转染试剂。MessageMax能将modGFP高效转染入3T3细胞、Hela细胞及MCF-7细胞中,并实现modGFP和modmCherry在MEF细胞中的共转及核内因子nGFP和mTBX5在MEF细胞核中的定位。结论相比于RNAiMax,MessageMax转染modRNA效果更佳,既能实现包括核内蛋白在内的各种目的蛋白在各类细胞中的高效、快速表达,也能实现多因子同时转染、共同表达。

modRNA技术:一种蛋白表达新方法

早在上世纪90年代,注射裸信使核糖核酸(mRNA)已经能够在体内实现外源性蛋白的表达。然而,mRNA的不稳定性及高度免疫原性阻碍了这项技术的进一步发展与应用。近年来,随着对mRNA结构的认识深入及核酸技术的进步,可化学合成并修饰信使核糖核酸,即Chemically synthetic modified message RNA(modRNA),modRNA兼具稳定性、低免疫原性及良好的蛋白翻译表的优势。我们对其研究现状、存在问题进行综述,并对可能的改进方向进行展望。