人牙龈组织中内皮素及一氧化氮合成酸的异常与牙周病相关性的研究

目的：探讨人牙龈组织中内皮素（ＥＴ）及一氧化氮合成酸（ＮＯＳ）的分布及含量的变化与牙周病发病的关系。方法：应用免疫组织化学，组织化学方法及计算机图像处理技术对２０例正常人和２０例慢性牙周炎患者的牙龈组织中ＥＴ、ＮＯＳ等免疫活性物质进行了定性及定量的观察分析。结果：在牙周病牙龈组织中ＮＯＳ含量比正常组织中有所增高，ＥＴ含量显著增高。（Ｐ＜００１）。而在分布特点上二者变化不明显。ＥＴ主要分布在小血管及毛细血管内皮内，ＮＯＳ主要包绕于血管壁周围。结论：在病变组织中，ＥＴ、ＮＯＳ含量的增加，可能与牙周组织损害及牙周疾病的发生密切相关。

阳浮床再生用合成酸改成副产酸的试验

原水中常含有Ca^(2+)、Mg^(2+)、Na^+等阳离子和SO_4^(2-)、CI^-、HCIO_3^-阴离子。阳浮床中装001×7强酸性阳树脂,用来除掉水中的阳离子,当原水通过强酸H^+型树脂层时,水中各种阳离子均被树脂吸着,树脂上的H^-被置换到水中,交换中H^(?)交换剂层逐渐减少,直至交换后的水中浅漏出阳离子,称之阳浮床失效。为恢复交换剂的交换能力,用酸进行再生。原再生工艺用合成酸,用酸量大,价格高,加之蛋氨酸投产需用合成酸,我厂又有副产酸,1993年对阳浮床再生用副产酸试验,取得了较好的效果,保证了电站炉的用水水质,并为蛋氨酸生产用合成酸创造了条件,而且在经济上取得了明显的经济效益。

短短芽胞杆菌分支酸合成酶基因BbaroC的鉴定及转录因子调控分析

分支酸合成酶AroC是莽草酸途径中芳香族化合物合成的关键酶,探明短短芽胞杆菌aroC基因的特征及转录调控因子可为短短芽胞杆菌作用机理研究奠定基础。从短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX中克隆了aroC基因,进行生物信息学分析和转录因子预测。短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX中aroC基因序列长度为1 164 bp, GenBank登录号为OR475562。短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX与Brevibacillus brevis NBRC 100599的aroC基因序列同源性最高,为98.88%,与Brevibacillus brevis HNCS-1的AroC氨基酸序列同源性最高,为100%;其编码的蛋白为亲水性蛋白,无信号肽,定位于细胞质。靶向BbaroC的转录因子共有23个,分别来自10个物种,Escherichia coli(Strain K12 MG1655)和Bacillus subtilis(Strain 168)分别预测到12个和3个转录因子。BbaroC在短短芽胞杆菌抑菌活性物质产生中可能发挥着重要作用,这为其在农业上的广泛应用提供依据。

先天性胆汁酸合成障碍患儿行亲体肝移植的术后护理

总结3例先天性胆汁酸合成障碍患儿行亲体肝移植的术后护理经验。护理要点:早期拔除气管插管,谨防气道梗阻;监测基因突变相关特征,促进患儿早期康复;做好高危患儿抗凝治疗及出血护理;实施预见性护理,加强乳糜漏的观察及护理;加强感染控制管理,预防肺部感染。3例患儿经过治疗与护理,顺利出院,随访7个月~3年,病情稳定。

胱硫氨酸β-合成酶在食管胃结合部腺癌中的表达及其临床意义

目的 检测胱硫氨酸β-合成酶(CBS)在食管胃结合部腺癌(AEG)中的表达,探讨CBS表达与肿瘤血管新生、临床病理特征及预后的关系。方法 选取经手术切除的243例AEG患者的蜡块标本制作病理芯片,采用免疫组织化学法检测癌组织及配对癌旁正常组织中CBS、血管内皮细胞生长因子(VEGF)及微血管密度(MVD)的表达情况,分析CBS表达水平与VEGF及肿瘤MVD的相关性。探讨CBS表达水平与AEG患者的临床病理特征及预后的关系。结果 CBS在AEG患者的癌组织和配对癌旁正常组织中的阳性表达率分别为66.67%(162/243)和30.45%(74/243),两组比较差异有统计学意义(P<0.001)。CBS表达水平与T分期、淋巴结转移、吸烟史、VEGF表达及MVD均有关(P<0.05),而与患者的年龄、性别、分化程度、TNM分期及饮酒史无关(P>0.05)。CBS低表达患者的中位无病生存时间(DFS)为63个月,显著长于CBS高表达患者的50个月,差异有统计学意义(P=0.0039)。Cox多因素回归分析显示,CBS表达(HR=1.827,95%CI:1.146~2.912,P=0.011)、VEGF表达(HR=2.684,95%CI:1.637~4.401,P<0.001)、MVD(HR=4.064,95%CI:2.419~6.829,P<0.001)及TNM分期(HR=2.354,95%CI:1.523~3.638,P<0.001)是影响AEG患者DFS的独立因素。结论 CBS高表达可能与肿瘤新生血管相关,是AEG预后的不良因素之一,在AEG的诊治中具有潜在应用价值。

雷公藤甲素通过丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶/糖原合成酶激酶-3β通路对MGC803细胞增殖、侵袭与迁移的影响

目的 探讨雷公藤甲素通过丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶/糖原合成酶激酶-3β(AKT/GSK-3β)通路对MGC803细胞增殖、侵袭与迁移的影响。方法 体外培养MGC803细胞,确定雷公藤甲素的干预剂量和干预时间。将细胞分为阴性对照组(A组,不进行处理),阳性对照组(B组,10μmol/L顺铂),雷公藤甲素高、中、低剂量组(C组、D组、E组)。干预48 h,采用Transwell法检测细胞侵袭能力,采用划痕试验法检测迁移能力,采用免疫印迹(Western blot)法检测检测相关蛋白的表达。结果 随着雷公藤甲素浓度的增加,MGC803细胞增殖率降低(P <0.05);48 h时半数抑制浓度(IC50)最小,选择干预时间为48 h,C组、D组、E组的干预剂量分别为80,40,20 nmol/L。与B组比较,C组、D组、E组侵袭细胞数、细胞迁移距离及波形蛋白(vimentin),snail,p-AKT/AKT,p-GSK-3β/GSK-3β表达水平均显著升高(P <0.05),上皮钙黏素(E-cadherin)、β-联蛋白(β-catenin)表达水平均显著降低(P <0.05),且呈剂量依赖关系。结论 雷公藤甲素可通过抑制AKT/GSK-3β信号通路而抑制MGC803细胞增殖、侵袭与迁移。

光催化、电催化和生物催化在扁桃酸合成中的应用进展

扁桃酸被认为是一种应用领域非常广泛的手性药物中间体和相关分解剂,具有很高的价值。结合可持续化学合成的需求和趋势,简要总结了扁桃酸的传统合成方法,探讨了光催化、电催化和生物催化在扁桃酸合成中的应用;概述了光催化、电催化和生物催化的基本原理和机制,在扁桃酸合成中的应用案例以及各自的优势和挑战;最后,展望了光催化、电催化和生物催化在扁桃酸合成中的未来发展方向和研究挑战;可以为扁桃酸合成的催化方法选择和优化提供参考。

脂磷壁酸合成酶ltaS基因缺失对产单核细胞李氏杆菌致病性的影响

本文旨在构建脂磷壁酸合成酶ltaS基因缺失株,探讨ltaS基因对产单核细胞李氏杆菌致病力的影响。本研究利用同源重组技术构建产单核细胞李氏杆菌ltaS基因缺失株,通过生物学特性试验探究ltaS基因缺失株对产单核细胞李氏杆菌生长能力和菌体形态的影响,Western blot试验探究亲本株EGDe-prfA、缺失株ΔltaS对InlA和InlB在细菌表面的锚定情况;使用鸡胚成纤维DF-1细胞进行细胞黏附侵袭试验、小鼠RAW264.7细胞进行吞噬试验与巨噬细胞内增殖试验测定ltaS基因对产单核细胞李氏杆菌侵染能力的影响;小鼠脏器细菌载量和小鼠存活试验评估ltaS基因缺失对产单核细胞李氏杆菌致病性的影响。结果显示:利用同源重组技术成功构建产单核细胞李氏杆菌ltaS基因缺失株,生长曲线试验和光学显微镜观察发现ltaS基因不影响产单核细胞李氏杆菌在BHI中正常生长和细菌形态,通过Western blot试验验证ltaS基因缺失导致细菌表面毒力的InlA和InlB锚定量降低。细胞黏附侵袭试验结果表明,ΔltaS对DF-1的黏附率极显著低于亲本株EGDe-prfA(P<0.01)并且侵袭率也极显著低于亲本株EGDe-prfA(P<0.01);吞噬试验结果显示,小鼠巨噬细胞RAW264.7对ΔltaS的吞噬率与亲本株EGDe-prfA相比无显著性差异(P>0.05);而在增殖试验中,ΔltaS在RAW264.7中增殖量与亲本株EGDe-prfA存在显著差异(P<0.05)。小鼠致病力试验结果显示,经ΔltaS感染的小鼠的肝、脾内细菌载量均显著低于EGDe-prfA(P<0.01)并且EGDe-prfA感染后的小鼠96 h内全部死亡,而缺失株ΔltaS感染的小鼠存活率为80%,测定出亲本株EGDe-prfA半数致死量LD 50为1.7×104 CFU,缺失株ΔltaS半数致死量LD 50为7.49×106 CFU。综上所述,ltaS基因缺失显著减少表面InlA和InlB的锚定量,减弱产单核细胞李氏杆菌对DF-1细胞的黏附侵袭能力与RAW264.7内细菌增殖能力,并且降低对小鼠的致病性。

透明质酸合成酶2通过调控TGF-β/SMAD4信号通路对肾细胞癌发生发展的影响

目的探讨透明质酸合成酶2(HAS2)在肾细胞癌(RCC)中的作用及其潜在分子机制。方法收集我院从2019年8月至2021年7月收治的RCC患者接受手术切除的30例RCC组织(RCC组)和30例癌旁组织(NAT组),RT-qPCR和Western blot实验分别检测HAS2 mRNA和蛋白在RCC组织和细胞中的表达。将NC-siRNA、HAS2-siRNA转染至细胞后,细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测RCC细胞的活力;流式细胞术检测RCC细胞凋亡情况;细胞划痕实验检测细胞迁移情况;Western blot检测RCC细胞中上皮-间充质转化(EMT)标志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白和凋亡蛋白标志物Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白以及TGF-β1、p-Smad4蛋白的表达。结果与NAT组比较,RCC组织中HAS2 mRNA和蛋白水平均显著升高(P<0.05);与正常肾近端小管上皮细胞(RPTEC)比较,RCC细胞系中HAS2 mRNA和蛋白水平均显著升高(P<0.05)。与Control组比较,HAS2-siRNA组细胞中HAS2 mRNA和蛋白水平显著降低,细胞增殖和迁移能力显著降低,细胞凋亡率显著升高,Bax和Caspase-3蛋白水平显著升高,Bcl-2蛋白水平显著降低,E-cadherin蛋白水平显著升高,N-cadherin和Vimentin蛋白水平显著降低,TGF-β1、p-Smad4蛋白水平均显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。NC-siRNA组与Control组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论沉默HAS2能抑制肾细胞癌细胞增殖、迁移和EMT,促进肾细胞癌细胞凋亡,其机制可能与调控TGF-β/SMAD4信号通路有关。

茶树茉莉酸合成与转导途径关键基因在乌龙茶加工过程中对萜类物质的影响

对茶树茉莉酸合成与信号转导途径关键基因进行分析,并探究其在乌龙茶加工过程中的表达模式和对萜类物质形成的影响。结果表明,茶树茉莉酸合成与信号转导途径中共11个关键基因家族,包含133个候选基因;顺式作用元件分析显示,该途径关键基因的启动子区域包含大量的顺式作用元件,包括茉莉酸响应、损伤响应和厌氧诱导响应等元件;qRT-PCR分析表明,该途径大多数基因在萎凋过程呈上升趋势,在二摇后达到最高,四摇过程显著下调,杀青前略有回升,且关键基因可响应乌龙茶加工过程中多种胁迫;顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用(HS-SPME-GC-MS)检测出73种萜类物质,主要包括芳樟醇、香叶醇和α-法尼烯等呈花果香型物质;相关性分析表明,CsLOX11、CsLOX12、CsAOS2、CsAOC1、CsACX4、CsACX8、CsMYC2-4、CsMYC2_15和CsMYC2_21与β-蒎烯、柠檬烯和月桂烯等呈正相关,CsOPR2、CsTPL6和CsLUG4与反式-橙花叔醇、α-法尼烯和紫罗兰酮等呈正相关,其中CsTPL6与35种萜类化合物呈极显著正相关。明确茶树茉莉酸合成与信号转导途径关键基因参与调控乌龙茶加工过程中萜类化合物的形成,为探明乌龙茶加工过程香气形成的分子机制奠定基础。

基于TCGA数据库分析胸苷酸合成酶基因在食管癌组织中的表达及临床意义

目的探讨胸苷酸合成酶(TYMS)基因在食管癌(ESCA)患者中的表达及其与临床特征和预后的关系。方法从癌症基因组图谱数据库下载ESCA患者的原始转录组测序数据、临床信息及临床病理学资料,应用t检验和χ^(2)检验评估TYMS基因在食管癌组织与正常组织间的表达差异,受试者操作特征(ROC)曲线评估TYMS基因对ESCA的诊断价值;Kaplan-Meier生存分析比较不同表达TYMS水平ESCA患者的无进展间隔(PFI)率、总生存(OS)率和疾病特异性生存(DSS)率;应用Cox回归分析和预后列线图确定TYMS基因对ESCA预后的评估价值;并使用单样本基因集合富集分析免疫浸润水平与TYMS基因表达的相关性。结果共获取173例样本的临床病理学资料,其中11例为正常样本,162例为ESCA样本。总样本中,ESCA组织中TYMS基因表达水平显著高于正常样本(t=6.344,P<0.001);在8例配对ESCA和邻近癌旁组织中,ESCA组织中TYMS基因表达水平显著高于邻近癌旁组织(t=6.866,P<0.001)。TYMS高表达组与TYMS低表达组患者的临床分期、病理分级、是否行放射治疗及是否为Barrett食管比较差异无统计学意义(P>0.05);2组患者的年龄、体质量及组织学分型比较差异有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线显示,TYMS基因诊断ESCA的曲线下面积为0.949,95%置信区间为0.896~1.000,敏感度为0.909,特异度为0.791。TYMS基因高表达与TYMS基因低表达患者的OS率、DSS率和PFI率比较差异无统计学意义(HR=0.940、1.040、0.980,P>0.05)。在体质量>70 kg的ESCA患者中,TYMS基因高表达患者的OS率显著低于TYMS基因低表达患者(P<0.05);在非Barrett食管疾病的ESCA患者中,TYMS基因高表达患者的OS率显著低于TYMS基因低表达患者(P<0.05)。在不同T、N、M分期及病理分级、是否行放射治疗、不同年龄段、食管癌、Barrett食管疾病及体质量≤70 kg患者中,TYMS基因高表达与TYMS基因低表达患者的OS率比较差异无统计学意义(P>0.05)。从ESCA患者体质量及非Barrett食管ESCA患者2个方面,构建TYMS基因水平预测ESCA患者生存列线图显示,随总分值的增加,1、2、3 a生存率下降;预后列线图的C指数达到0.563(0.474~0.650),所建立的1、2、3 a存活曲线与理想存活曲线匹配。单因素分析显示,M、N期和初次治疗结果与ESCA患者的OS率相关(P<0.05),TYMS基因表达水平与ESCA患者的OS率无关(P>0.05)。多因素分析显示,肿瘤分期M、N期是影响ESCA患者生存期的独立危险因素(P<0.05)。TYMS基因表达水平与肥大细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞和辅助性T细胞17的表达水平呈负相关(r=0.302、0.244、0.256、0.270,P<0.05)。结论TYMS基因在ESCA组织中高表达,可调节ESCA免疫微环境,不同程度促进肿瘤发展;TYMS基因表达水平并非ESCA患者的独立预后影响因素,可作为ESCA的诊断和部分类型ESCA患者预后预测的潜在生物标志物。

脑胶质瘤组织中透明质酸合成酶2表达变化及其与临床病理参数和预后的关系

目的观察脑胶质瘤组织中透明质酸合成酶2(HAS2)的表达变化,探讨HAS2表达与脑胶质瘤临床病理参数及预后的关系。方法收集行脑胶质瘤切除术患者的胶质瘤组织标本70例纳入病例组,肿瘤WHO分级1~2级32例、3~4级38例。另收集同期行颅内减压术的脑外伤患者的脑组织标本10例纳入对照组。分别采用免疫组化法及Western blotting法检测两组HAS2蛋白,分析HAS2表达与脑胶质瘤临床病理参数的关系。采用Logistic回归分析胶质瘤组织中HAS2表达量的影响因素。绘制Kaplan-Meier生存曲线,比较不同HAS2表达水平的脑胶质瘤患者的预后。结果免疫组化检测结果与Western blotting检测结果均显示,病例组HAS2表达高于对照组,且3~4级脑胶质瘤组织中HAS2表达高于1~2级脑胶质瘤组织(P均<0.05)。WHO分级3~4级、突变型p53、Ki-67高表达脑胶质瘤组织中HAS2高表达率分别高于1~2级、野生型p53、Ki-67低表达的肿瘤组织(P均<0.05)。将WHO分级、Ki-67表达、p53分型、年龄、性别、肿瘤部位和O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶表达作为自变量,将HAS2表达作为因变量,纳入Logistic回归模型分析,结果显示WHO分级、Ki-67表达与p53分型是脑胶质瘤患者HAS2表达的独立影响因素(P均<0.05)。HAS2高表达患者的平均生存时间、总生存率低于HAS2低表达患者(P均<0.01)。结论HAS2在脑胶质瘤组织中高表达,HAS2高表达与脑胶质瘤恶性程度有关,并影响患者预后。

三七悬浮细胞生物合成绿原酸类物质及其生物活性

利用三七(Panax notoginseng)悬浮细胞生物合成绿原酸类物质(CGAs),并对其生物活性进行了研究。对三七细胞中CGAs进行定性分析,优化了细胞培养条件以及6种诱导模式,测定了三七细胞CGAs的抗氧化及α-葡萄糖苷酶活性抑制能力。结果表明三七愈伤组织内含有4种CGAs;最优工艺条件为:B5+40 g/L蔗糖,pH 7.5,15%接种量;经30μmol/L茉莉酸甲酯诱导3 d后,CGAs产量(684.07 mg/L)比原工艺(475.18 mg/L)提高了0.44倍;三七细胞CGAs具有良好的抗氧化及α-葡萄糖苷酶活性抑制能力。

利用毕赤酵母底盘产生大麻二酚酸合成酶及其催化活性分析

为了实现大麻二酚酸合成酶(CBDAS)的微生物底盘高效表达,为体外合成大麻二酚(CBD)提供重组酶。首先从高CBD含量大麻叶片中克隆CBDAS基因,利用生物信息学方法分析其蛋白的基本理化性质,构建重组质粒pPIC9K-CBDAS后转化毕赤酵母菌,筛选重组蛋白CBDAS高表达的培养条件,并分析CBDAS的催化活性。结果表明,构建的pPIC9K-CBDAS融合蛋白表达系统能在毕赤酵母中表达;在甲醇添加量为1%、培养基pH6.0和培养48 h的诱导条件下表达量最大;重组酶CBDAS催化底物大麻萜酚酸(CBGA)反应4 h后大麻二酚酸(CBDA)含量显著增加(P<0.05),在8 h后CBD含量显著增加(P<0.05),在12 h时合成CBDA和CBD量达到最大值;CBDAS在大麻叶片大麻萜酚酸(CBGA)粗提液和CBGA标品中反应12 h后分别生成CBDA 60.64和20.12 ng/mL,CBD 128.01和207.87 ng/mL,具有较强的催化活性。通过酵母异源表达实现了大麻CBDAS的重组表达,为经济高效地合成CBDA和CBD提供活性酶。

肝移植治疗先天性胆汁酸合成障碍的疗效分析

目的探讨肝移植治疗先天性胆汁酸合成障碍(congenital bile acid synthesis disorder,CBAS)的手术疗效。方法回顾性分析2015年10月至2022年12月在复旦大学附属华山医院进行肝移植手术治疗的5例CBAS患儿的临床资料。其中CBAS 1型患儿1例,CBAS 2型患儿2例,脑腱黄瘤病(cerebrotendinous xanthomatosis,CTX)患儿2例,男性患儿3例,女性患儿2例,中位年龄为9(7~12)个月。亲属活体肝移植4例,公民逝世后器官捐献(donation after citizen's death,DCD)肝移植1例。患儿术后中位随访时间为74(60~84)个月。分析患儿术前临床特征、术中情况、术后随访资料,并对肝移植治疗效果进行评估。结果所有手术均顺利完成,术后1例患儿出现排斥反应,1例患儿出现乳糜漏,2例患儿感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)。术后1例患儿因肺部感染死亡,其余4例患儿肝功能恢复良好,且正常存活,黄疸、瘙痒等症状消退,生长发育情况有所改善。结论对于内科治疗效果不佳的CBAS患儿,肝移植是其有效治疗手段。

精氨酸代琥珀酸合成酶-1对胰岛β细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨精氨酸代琥珀酸合成酶⁃1(argininosuccinate synthetase 1,ASS1)对胰岛β细胞增殖与凋亡的影响及机制。方法:利用siRNA和慢病毒载体在胰岛β⁃TC6细胞中分别敲低和过表达ASS1;5⁃乙炔基⁃2′⁃脱氧尿嘧啶核苷(5⁃ethynyl⁃2′⁃deoxyuridine,EdU)和CCK⁃8检测细胞增殖能力;Annexin V⁃PI流式细胞术和原位末端转移酶标记技术(terminal dUTP nick⁃end labeling assay,TUNEL)检测细胞凋亡水平;Western blot检测B细胞淋巴瘤⁃2(B⁃cell leukaemia⁃2,Bcl⁃2)蛋白、Bcl⁃2相关X蛋白(Bcl⁃2 associated X protein,Bax)、半胱氨酸天冬氨酸酶3(Caspase3)、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶⁃3(cleaved Caspase⁃3)、凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)、细胞核增殖抗原(Ki67)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian rapamycin target protein,mTOR)的表达水平;RT⁃qPCR检测AIF、Ki67和mTOR mRNA水平。结果:①与对照相比,敲低ASS1后,胰岛β细胞EdU阳性率和CCK⁃8细胞增殖活力降低,TUNEL阳性细胞数和AV/PI检测的细胞凋亡率升高。胰岛β细胞内AIF表达量明显升高,Bax/Bcl⁃2比值下降,Caspase⁃3活性降低。②过表达ASS1后,TUNEL阳性细胞数和AV/PI检测的细胞凋亡率均较对照组降低,伴随胰岛β细胞内Ki67和mTOR表达量升高。但胰岛β细胞EdU阳性率和CCK⁃8细胞增殖活力无明显变化。结论:ASS1过表达可能激活mTOR信号通路促进胰岛β细胞增殖;ASS1表达降低时,胰岛β细胞可通过AIF途径启动细胞凋亡。ASS1可能在胰岛β细胞的增殖和凋亡中发挥一定调控作用。

改造乙酰羟酸合成酶提高L-亮氨酸产量

乙酰羟酸合成酶(acetohydroxy acid synthase,AHAS,编码基因ilvBN)是L-亮氨酸合成途径的第一个限速酶。以谷氨酸棒杆菌XL-3(Corynebacterium glutamicum XL-3)为底盘细胞,通过分析并改造AHAS增加其对底物丙酮酸的偏好性,从而提高L-亮氨酸产量。首先利用AHAS的氨基酸序列进行同源建模,根据蛋白质结构进行丙氨酸扫描,找到突变的潜在位点,通过测定突变体酶活力和重组菌株的L-亮氨酸产量寻找最适突变体。测定结果发现将157位Gln突变成Arg能够有效提高AHAS催化丙酮酸的能力,最终重组菌株的L-亮氨酸产量达到(23.5±1.8)g/L,比出发菌株谷氨酸棒杆菌XL-3增加了51%,同时副产物L-异亮氨酸产量有所下降。因此,通过对AHAS的理性改造促进了L-亮氨酸的合成,该研究结果对后续利用蛋白质工程强化微生物合成L-亮氨酸等支链氨基酸具有重要的参考价值。

羊毛硫氨酸合成酶C样蛋白2在细胞抗氧化中的作用及机制研究

目的探讨羊毛硫氨酸合成酶C样蛋白2(LanCL2)在细胞抗氧化过程中的作用及相关机制。方法采用不同浓度(0、30、75、100、150、200μmol/L)的过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导处理人胚胎肾细胞(HEK293T)24 h以诱导氧化应激,通过蛋白质印迹技术检测LanCL2的表达;分别转染GFP、GFP-LanCL2过表达质粒至HEK293T细胞,在200μmol/L H_(2)O_(2)刺激条件下,通过PI/Hoechst 33342染色检测细胞死亡;向HEK293T细胞中转染Myc、Myc-LanCL2、Myc-GSTP1、Myc-LanCL2-His和GSTP1-His质粒,分别作为Myc组、Myc-LanCL2组、Myc-GSTP1组、Myc-LanCL2-His组(诱导纯化后)和GSTP1-His组(诱导纯化后),将未经任何处理的细胞作为Ctrl组,采用紫外分光光度计检测各组谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性及Myc组与Myc-LanCL2组的谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性。结果与无H_(2)O_(2)刺激相比,在100、200μmol/L H_(2)O_(2)刺激后HEK293T细胞中LanCL2相对表达量升高(P<0.05);与GFP组相比,GFP-LanCL2组在200μmol/L H_(2)O_(2)刺激后细胞死亡率下降(P<0.01);Myc-LanCL2组GST活性与Myc组及Myc-GSTP1组相比,差异无统计学意义(P>0.05);与Ctrl组相比,GSTP1-His组具有较高的GST活性(P<0.001);而Myc-LanCL2-His组GST活性与Ctrl组相比,差异无统计学意义(P>0.05);Myc-LanCL2组GPx活性与Myc组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论LanCL2能被氧化应激诱导,并减轻氧化应激介导的细胞死亡,但LanCL2不具有GSH依赖的抗氧化酶(GST和GPx)活性。

先天性胆汁酸合成障碍2型血浆氨基酸谱分析

目的探讨先天性胆汁酸合成障碍2型(CBAS2)患儿血浆氨基酸谱改变及临床意义。方法回顾性分析2016年1月至2021年6月就诊的婴儿胆汁淤积症患儿的临床资料。患儿根据病因分为CBAS2组、citrin缺陷导致的婴儿肝内胆汁淤积症(NICCD)组以及不明原因婴儿肝内胆汁淤积症(INH)组,比较三组22种血浆氨基酸的差异。结果纳入婴儿胆汁淤积症患儿85例,男58例、女27例,中位年龄2.3(2.0~4.0)月。中位总胆红素为134.9(103.1~181.7)μmol/L,中位直接胆红素79.0(62.2~110.6)μmol/L。CBAS2组12例患儿中11例(91.7%)有≥3种氨基酸改变,11例(91.7%)支链氨基酸(BCAA,包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)在正常范围;INH组23例患儿中17例(73.9%)有≥3种氨基酸改变;NICCD组50例患儿均有≥3种氨基酸改变。与INH组相比,CBAS2和NICCD组的天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸水平较高;与NICCD组相比,CBAS2组谷氨酰胺、丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、丙氨酸/瓜氨酸水平较高,瓜氨酸、精氨酸、蛋氨酸、碱性氨基酸、苏氨酸/丝氨酸水平较低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论CBAS2患儿血浆氨基酸谱变化广泛。CBAS2患儿血浆氨基酸谱变化与NICCD、INH患儿不同,这对CBAS2的诊断及鉴别诊断有重要意义。

氨基脱氧分支酸合成酶对谷氨酸棒杆菌生长和产L-丝氨酸的影响

L-丝氨酸是化学和材料领域中最为重要的30个骨架化合物之一,但至今尚未实现微生物发酵法工业化生产L-丝氨酸。氨基脱氧分支酸合成酶(aminodeoxychorismate synthase,ADC synthase)是L-丝氨酸分解代谢相关的关键酶,研究前期发现,与出发菌株SSAAI相比,通过ARTP诱变获得的高产L-丝氨酸突变株A36中氨基脱氧分支酸合成酶编码基因pabAB 426位发生点突变(T426I),而氨基脱氧分支酸合成酶基因突变对酶活力、菌株生长及产L-丝氨酸的影响尚未见报道。该文采用pK18 mobsacB质粒在出发菌株SSAAI上对pabAB进行426位定点突变(T426I)研究,结果发现,pabAB定点突变株的生物量比出发菌株SSAAI下降29.3%,L-丝氨酸产量提高15.9%。同时对氨基脱氧分支酸合成酶酶活力进行测定,发现氨基脱氧分支酸合成酶编码基因pabAB 426位的T426I突变导致酶的比活力下降。进一步采用不同强度的启动子调控高产菌株A36中氨基脱氧分支酸合成酶的活力,构建重组菌株A36-Pkan和A36-Dap-e;与出发菌株A36相比,重组菌氨基脱氧分支酸合成酶的比酶活力均有提高,发酵120 h时,生物量分别提高8.3%和16%,而L-丝氨酸产量分别下降18.2%和22.6%,说明提高氨基脱氧分支酸合成酶酶活力有利于谷氨酸棒杆菌生长却不利于产L-丝氨酸。