低渗诱导合浦珠母贝的三倍体

为了探究不同盐度对诱导合浦珠母贝三倍体的效果,本研究首次利用低渗方法诱导合浦珠母贝三倍体,通过控制变量法从不同盐度、诱导时机以及诱导时间中探究最适诱导条件。同时对合浦珠母贝卵裂率、孵化率以及存活率、壳长、三倍体率的变化进行了探究。结果显示,在盐度14、50%受精卵释放第一极体(PBⅠ)及诱导15 min时D形幼虫的三倍体率最高,分别为64.16%±6.92%、65.87%±6.51%以及65.14%±1.93%。三倍体幼虫并未表现出明显优势;低渗对胚胎造成的影响使幼虫存活率和三倍体率有所下降。通过对卵裂率、孵化率和15日龄存活率、壳长及三倍体率进行主成分分析,在三种诱导条件中均保留了前两个主成分,且保留的主成分的累积方差贡献率均超过了85%。盐度14、50%受精卵释放PBⅠ及诱导15 min分别在各自实验中的综合评价得分分别为第6、第1和第1。该研究表明,合浦珠母贝三倍体幼虫在生长方面的优势不明显,50%受精卵释放PBⅠ及诱导15 min两个诱导条件适合合浦珠母贝三倍体诱导。本研究可为合浦珠母贝三倍体育种提供一种新的思路,有助于提高生产效益。

盐度和pH对合浦珠母贝(Pinctada fucata)耗氧率和排氨率的影响

采用实验生态学方法,对3种规格的合浦珠母贝在不同盐度和pH下的耗氧率和排氨率进行了研究。结果表明,盐度对合浦珠母贝的耗氧率和排氨率有极显著影响(P<0.01)。在盐度21—36的范围内,耗氧率和排氨率均随盐度的升高而降低,且单位体重耗氧率、排氨率随其个体的增大而变小;pH对合浦珠母贝的耗氧率有极显著影响(P<0.01),对排氨率有显著影响(P<0.05)。单位体重耗氧率、排氨率也随其个体的增大而变小。在pH为5—9时,3种规格贝耗氧率、排氨率均先升后降,当pH为8时达到最大值,分别为2.467、4.268、7.461mg/(g·h)和0.406、1.356、2.255mg/(g·h)。随着合浦珠母贝个体的变小,其O:N值有逐渐变小的趋势。在试验盐度16—36范围内,O:N值随着盐度的升高有逐渐变大的趋势。而pH的变化对O:N的影响不明显。在本实验条件下,总体上O:N值较低,表明在盐度和pH的胁迫下合浦珠母贝以蛋白质代谢为主。

广西合浦珠母贝3个不同群体遗传关系分析

为探索广西合浦珠母贝群体内杂交组合方式,分别从北海野生群体(F_(1))、选育群体(F_(4))和养殖群体中随机挑选2龄种贝样本15个,进行简化基因组测序,通过单核苷酸多态标记解析3个群体的遗传关系。研究结果显示,获得超过585000个单核苷酸多态标记,野生群体、选育群体和养殖群体的观测杂合度分别为0.1975、0.1679和0.1783,期望杂合度分别为0.2545、0.2469和0.2732,平均近交系数分别为0.2075、0.3449和0.3465,多态信息含量分别为0.2032、0.2089和0.2241,选育群体近交系数与养殖群体相近,野生群体和养殖群体的群体遗传多态高于选育群体。系统进化树和主成分分析显示,选育群体与养殖群体部分样品亲缘关系较近。选育群体和养殖群体之间的遗传分化指数最低,部分亲本同源的可能性较大;野生群体、选育群体和养殖群体的平均长纯合片段数分别为59.1、49.5个和56.6个,长纯合片段平均长度分别为0.312、0.313Mb和0.311Mb,平均单核苷酸多态标记含量分别为59、50和73,近交系数FROH分别为0.0149~0.0240、0.0159~0.0201和0.0170~0.0246,反映3个群体的真实近交水平较低;野生群体、选育群体和养殖群体的整个染色体内连锁不平衡衰减距离分别为0.4、0.4kb和0.2kb(r2=0.2),衰减速度为养殖群体>野生群体>选育群体,选育群体衰减速度最慢,可能与人工选育有关。以上结果表明,广西合浦珠母贝可采用野生群体×选育群体或野生群体×养殖群体的杂交组合方式开展群体内杂交。本研究结果可为广西合浦珠母贝育种中的亲本选择提供参考。

高温胁迫对合浦珠母贝不同群体存活及免疫酶活性的影响

为比较合浦珠母贝(Pinctada fucata)不同群体在高温胁迫下的存活及免疫酶活性变化情况,本实验以“海优1号”(YY)、“海选1号”(XX)、“南科1号”(KK)和广西潜在耐高温养殖群体(TT)为实验材料,通过渐变升温的方式测定4组合浦珠母贝在35℃水温胁迫下的生理指标,研究不同胁迫时长对合浦珠母贝存活及其鳃组织内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)和碱性磷酸酶(AKP)活性的影响。研究显示,实验第8天开始出现个体死亡,TT组在实验12 d后存活率显著高于其余3组(P<0.05);4个群体的SOD、CAT和T-AOC活性随胁迫时间的延长大致呈上升-下降的趋势,在1~24 h内免疫酶活性呈上升趋势,在120 h后下降至对照水平以下;在高温胁迫下各组的AKP活性增加,KK、TT与XX、YY分别在12和24 h达到峰值,在120 h显著下降。本研究初步探明了高温胁迫下合浦珠母贝的免疫应答机制。

合浦珠母贝(Pinctada martensii,Dunker)珍珠囊体外预培育的初步研究

０．３％胰蛋白酶液（２５℃）消化外套膜组织的第５～１５ｍｉｎ时间段所收获的细胞产物中，表皮细胞具有最高的纯度和贴壁活性；细胞悬液的体外短期培养过程中小牛血清和珠母贝组织提取物对于细胞在体外的生长和在珠核表面的贴附具有促进作用．

污损生物对合浦珠母贝Pinctada martensii生长和繁殖的影响

主要研究定期清除污损生物的合浦珠母贝(Pinctada martensii)与不清除污损生物的合浦珠母贝在生长及繁殖上的差异,用以说明污损生物对合浦珠母贝的生长及繁殖的影响。结果表明,合浦珠母贝在悬挂了2个月之后,清除污损生物的实验组与不清除污损生物的实验组合浦珠母贝之间的各项生长指标差异不显著(P>0.05),而在悬挂3个月和悬挂4个月之后,清除污损的合浦珠母贝与不清除污损的合浦珠母贝之间的生长指标产生了显著差异(P<0.05)。结果还显示污损生物对合浦珠母贝的繁殖周期没有影响。

合浦珠母贝幼体生长性状的遗传力及其相关性分析

以合浦珠母贝(Pinctada fucata)4种壳色选育群体为亲贝,采用人工授精技术对同一壳色亲本进行雌雄单个配对,获得了15个全同胞家系。测量5、15、25和40日龄时的壳长和壳高,利用方差分析比较不同壳色品系的生长差异;利用非求导约束最大似然法(DF-REML)对合浦珠母贝各日龄的壳长和壳高性状进行遗传参数的估计。结果表明,4种壳色系的壳长和壳高均存在显著差异(P<0.05);5～40日龄幼体壳长遗传力估计值为0.12～0.22,壳高遗传力估计值为0.17～0.23;合浦珠母贝幼体不同生长时期壳长和壳高的遗传相关和表型相关均为正相关,相关系数分别为0.825～0.989和0.832～0.965,表明以壳高或壳长为参数进行选育时,均可达到改良生长性状的效果。

合浦珠母贝β-肌动蛋白基因的克隆和序列分析

为进一步研究珍珠质基质蛋白外排机制,同时为今后合浦珠母贝(Pinctada fucata)不同组织的基因表达研究提供阳性对照,根据大鼠(Rattus norvegicus)胞质型肌动蛋白β-actin设计引物,通过RT-PCR方法克隆鉴定了合浦珠母贝肌动蛋白同源基因片段。序列分析表明,该片段编码的氨基酸序列与相应同源片段具有较高的保守性。合浦珠母贝β-肌动蛋白有多个特有的氨基酸残基。合浦珠母贝可能是在系统进化上较早分出的一支。

合浦珠母贝3个养殖群体双列杂交F1代的生长和遗传分析

为开展合浦珠母贝（Pinctada fucata）遗传改良和培育优质新品种,作者利用合浦珠母贝北海养殖群体（B）、徐闻养殖群体（X）和三亚养殖群体（S）进行双列杂交,获得3个种群内自繁群体及6个种群间杂交群体。对8月龄F1代的壳长、壳高、壳宽和体质量4个生长性状进行了测定,计算了各组合的一般配合力、特殊配合力及杂种优势。结果表明,杂交组合的各性状值普遍高于自繁群体,其中S（♀）×B（♂）和S（♀）×X（♂）杂交组合的各性状值极显著高于其他组合。三亚群体各性状的一般配合力最大,S（♀）×X（♂）组合各性状特殊配合力最大,其次是S（♀）×B（♂）组合。杂交子一代4个生长指标均表现出一定程度的杂种优势（0.24%~52.62%）。不同杂交组合间和不同性状间的杂种优势存在差异,其中,S（♀）×B（♂）杂交组合杂种优势明显,其反交组合B（♀）×S（♂）杂交优势程度不高,且在壳宽上表现出较低的杂种优势率（0.24%）;S（♀）×X（♂）杂交组合杂种优势率比反交组合X（♀）×S（♂）高。体质量的平均杂种优势率均高于其他3个性状。该研究的结果表明杂交群体性状的改进为进一步选育奠定了基础。

合浦珠母贝2个野生种群的遗传多样性

用形态特征比较与同工酶电泳分析相结合的方法 ,对产于我国北部湾和大亚湾的野生合浦珠母贝 (Pincta damartensii)的遗传多样性进行研究。结果表明 ,在贝壳形态方面 ,北部湾种群的平均壳长与壳高都略大于大亚湾种群 ,壳高与壳长呈乘幂相关 ,壳宽与壳长呈对数相关。大亚湾种群的壳宽指数、壳重指数和肥满度指标都大于北部湾种群。用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳检测由 2 6个位点编码的 12种同工酶 ,2种群都显示出较高的多态性 ,北部湾种群多态位点的比率为 38.4 6 % ,大亚湾种群则为 4 6 .15 %。都表现出明显的杂合子缺失现象 ,北部湾种群的平均杂合度 (0 .0 999)小于大亚湾种群 (0 .12 4 3)。 2种群之间的遗传距离为 0 .0 15 9。本文还讨论了引起 2种群杂合子缺失现象的原因 ,并认为生化遗传分析的结果与 2个种群的形态特征是相关联的。

基于FIASCO技术的合浦珠母贝微卫星标记分离与筛选研究

用FIASCO(Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing Repeats)技术开展了合浦珠母贝Pinctada fucata基因组微卫星标记的分离与筛选研究。合浦珠母贝基因组DNA经限制性内切酶MseI酶切后与接头连接,用生物素标记的(CA)15探针与其杂交,然后用磁珠富集、洗脱获得单链目的片段,经PCR扩增后形成双链,最后进行克隆转化,构建微卫星富集文库。挑选克隆用探针引物(CA)15和载体引物进行第2次筛选,获得阳性克隆357个,测序结果表明,297个克隆(83.2%)含有微卫星序列,包括479个微卫星DNA结构域。其中完美型微卫星有370个(77.3%),非完美型95个(19.8%),复合型14个(2.9%)。合成引物49对,有31对(63%)扩增出目的产物,其中9对在种群中(n=32)具有扩增多态性,其多态信息含量PIC值在0.375―0.809之间,平均为0.536;等位基因数在2―9个之间,平均为4.889个;观测杂合度介于0.200―0.600之间,平均为0.415;期望杂合度的变化范围为0.454―0.844,平均为0.598。表明FIASCO技术适合于合浦珠母贝微卫星标记的分离与筛选。

合浦珠母贝3个养殖群体的RAPD分析

利用RAPD标记技术检测了广西省北海市、海南省三亚市、广东省深圳市等 3个地理种群养殖合浦珠母贝(Pinctadamartensii)基因组DNA的多态性 ,并对其遗传结构进行了初步分析。从 4 0个随机引物中筛选出 13个10bp引物 ,它们在 3种群中共扩增出了 14 0条DNA片段 ,3种群共有片段 16条 ,DNA片段数分别为 5 8、91和 71条 ,多态性位点比例分别为 4 1 4 % ,6 5 0 %和 5 8 4 %。遗传距离分析表明 ,广西种群与广东种群的亲缘关系较近 ,而与海南种群亲缘关系较远。 13个引物中 ,引物S11和S3 58扩增出的 3种群指纹图谱差异显著 ,可作为 3种群鉴定的分子标记。

合浦珠母贝遗传连锁图谱的构建

用AFLP标记构建了印度合浦珠母贝(Pinctada fucata)全同胞家系的遗传图谱。用经过筛选的36对引物组合对父母本和62个子代个体进行遗传分析,共得到1 547个标记,包括581个1∶1分离标记。母本分离标记294个,其中178个符合1∶1孟德尔分离规律;父本分离标记287个,其中182个符合1∶1孟德尔分离规律。雌性框架图包括33个遗传标记,分布在14个连锁群中,标记间平均间隔24.3 cM,有2个3联体,11个连锁对,图谱总长度为488.5 cM。雄性框架图包括53个遗传标记,分布在19个连锁群中,标记间平均间隔30.5 cM,有4个3联体,10个连锁对,图谱总长度为1 035.5 cM。雌雄两个框架图中AFLP标记的分布都较均匀。雌雄基因组估算长度分别为1 168.4 cM和2 037.1 cM,图谱覆盖率分别为41.8%和50.8%。本研究为进一步构建高密度遗传连锁图谱及QTL定位分析奠定了基础。

合浦珠母贝三倍体的卵诱导四倍体

将合浦珠母贝三倍体的卵与二倍体的精子授精 ,用 0 .5 μg/mL细胞松弛素B抑制受精卵第一极体的释放诱导四倍体。研究了处理起始时间及持续时间对胚胎孵化率和四倍体诱导率的影响及幼虫的生长及存活。实验结果表明 :持续时间与胚胎孵化率呈负相关 ,而与四倍体诱导率呈正相关 ,持续时间一般为1 5～ 1 8min ,处理起始时间一般在第一极体出现前 3～ 5min。在胚胎期 ,四倍体诱导率平均为 2 0 %。在幼虫培养阶段 ,幼虫死亡严重 ,收苗率极低 ,平均只有 0 .0 2 %。处理组与未处理组的生长差异不明显 (p >0 .0 5 ) ,但两组幼虫生长明显慢于二倍体组 (p <0 .0 5 )。

合浦珠母贝双列杂交家系的建立与遗传分析

以采自广西北海(B)、广东徐闻(X)、海南三亚(S)的3个不同养殖群体的合浦珠母贝为亲贝,按照完全双列杂交的方式,建立了9个交配组合,每个组合10个家系,共90个家系。出苗经60d养殖后,比较各家系的育种值,并对家系进行综合评价。结果表明:壳长的Kung育种值大于20的家系有8个,分别为BX2(表示北海♂×徐闻♀的2号家系,余依此类推)、BX9、BB4、BB5、BB8、BS9、XS3、SB8,其中XS3的壳长及壳宽的Kung育种值和综合评定值均最大,XX3最小。BB4和XS3的综合评定值大于1。壳长的一般配合力为三亚群体17.40,徐闻17.45,北海18.27;壳高为三亚14.74,徐闻14.79,北海15.54。壳长的特殊配合力为三亚—徐闻17.75,三亚—北海18.27,徐闻—北海18.12;壳高为三亚—徐闻14.98,三亚—北海15.51,徐闻—北海15.46。壳长的平均杂种优势为三亚—徐闻1.41,三亚—北海0.96,徐闻—北海0.67;壳高为三亚—徐闻1.13,三亚—北海1.60,徐闻—北海1.19。表明北海的亲本较好。

合浦珠母贝碱性磷酸酶的分离纯化与性质研究

以合浦珠母贝 (Pinctadafucata)为提取酶的原料 ,经Tris HCl缓冲液 (pH7.5)抽提 ,正丁醇处理 ,硫酸铵分级沉淀分离 ,DEAE 纤维素离子交换树脂柱层析 ,DEAE A25离子交换分子筛柱层析纯化 ,得到一定纯度的碱性磷酸酶 ,比活力达到1444U/mg。酶学性质和动力学性质研究表明 ,该酶催化对硝基苯磷酸 (pNPP)的水解反应 ,最适 pH值为9.72,最适温度为45℃ ,水解反应的活化能为Ka=21.4kJ/mol,初速度为6.1μmol/L,米氏常数Km 值为2.86mmol/L,Vm 值为9.09μmol/L。产物类似物HPO2 - 4,WO3 - 4 对该酶均有明显的抑制作用 ,表现为竞争性抑制。金属离子对该酶的催化活力有不同的影响 ,正一价金属离子对该酶活性无影响 ,Mg2 +,Co2 +,Mn2 +对该酶有激活作用 ,Zn2 +对该酶有明显的抑制作用。

4种壳色合浦珠母贝贝壳棱柱层和珍珠质层7种金属元素质量分数的比较分析

利用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-AES)对合浦珠母贝(Pinctada fucata)黑、金、红、白F5代选育群体贝壳棱柱层和珍珠质层的7种金属元素质量分数进行比较分析。结果显示,合浦珠母贝贝壳棱柱层中铁(Fe)、钾(K)、镁(Mg)和锰(Mn)的质量分数明显高于珍珠质层,而钠(Na)、Sr(锶)和锌(Zn)的质量分数则低于珍珠质层。4种壳色棱柱层和珍珠质层中的金属元素质量分数均存在差异:Mg、Sr、K、Zn在黑壳合浦珠母贝棱柱层中质量分数最低,Mn、Fe在金壳棱柱层中最低,而Na却在红壳棱柱层中最低;单因素方差分析显示,Fe、Mg、Zn可能分别会影响合浦珠母贝红壳、金壳、白壳的形成。白壳贝珍珠质层的6种金属元素(Mg除外)质量分数都最少,更有可能培育出优质珍珠。

合浦珠母贝肉短肽的分离及其抗氧化活性研究

为制备具有抗氧化能力的合浦珠母贝肉活性肽,本文采用Sephadex G-25分子筛层析法对合浦珠母贝肉酶解产物进行分离,测定分离到的各活性组分分子量及其总抗氧化活性、DPPH自由基清除能力及羟自由基清除能力。结果表明,合浦珠母贝肉酶解产物经Sephadex G-25分离得到6个主要活性组分,相对分子量分别为1437.5、833.7、421.9、244.7、89.0、17.4u,其中功能短肽F1(1437.5u)、F2(833.7u)、F4(244.7u)的抗氧化效果较强,特别是F2(833.7u)短肽具有最强的总抗氧化能力、DPPH自由基清除能力及羟自由基清除能力。该研究为合浦珠母贝肉抗氧化活性肽的开发提供理论技术依据。

合浦珠母贝同工酶的电泳分析

采用聚丙烯酰胺梯度凝胶垂直板电泳技术和特异性染色方法 ,对合浦珠母贝外套膜、闭壳肌、肝脏和鳃组织中的 15种同工酶系统进行分析 ,结果表明 :a GPDH、ADH在 4种组织中均未见表达 ;AK、AMY、PGM、ALP、GDH和LDH只在肝脏中表达 ,而ME、SOD、EST、MDH、G6PD、6PGD和AAT则有较广泛的组织分布 ,其中 12个座位 (Aat 1、Aat 2、Sod 1、Sod 2、Sod 3、Sod 4、m Mdh c、G6pd 2、6Pgd 2、Ak 1、Gdh 1、Me 2 )具有多态性 ,多态位点比例为 4 6.1% ,平均杂合度 0 .112 2± 0 .0 576。

合浦珠母贝对不同种类及浓度的单胞藻摄食与消化效果研究

从单胞藻粒径大小、表面结构、生化组成及饵料浓度等角度开展了合浦珠母贝(Pinctada fucata)对不同种类及浓度的单胞藻摄食与消化效果研究。投喂粒径大小相近的牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)和湛江叉鞭金藻(Dicrateria zhanjiangensis)混合藻,粒径大小不同的亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)和海水小球藻(Marine chlorella)混合藻,用细胞计数法检测剩余混合藻中各单胞藻浓度。分别投喂以上4种不同浓度梯度的单胞藻,观察比较粪便中单胞藻消化状况。结果显示,合浦珠母贝对粒径大小相近的单胞藻没有表现出明显的选择性摄食(P>0.05),对粒径较大的单胞藻摄食率明显高于粒径较小的单胞藻(P<0.05);随着投喂单胞藻浓度的升高,合浦珠母贝对单胞藻的消化程度降低。