烟草烟雾通过ROS/Sirt3/SOD2通路诱导NSCLC细胞吉非替尼耐药

背景与目的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)最常见的驱动基因突变。为延长患者生存时间,NSCLC EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)耐药是目前急需解决的重大难题。本研究主要探究烟草烟雾(cigaree smoke,CS)诱导NSCLC发生吉非替尼耐药的机制。方法体外培养PC-9、A549细胞,分别经1μmol/L吉非替尼处理4 h、10%CS萃取物(CS extract,CSE)处理48 h。Western blot检测沉默蛋白3(Sirtuin 3,Sirt3)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2)蛋白表达,使用DCFH-DA探针检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,CCK-8试剂盒检测细胞活性,Ed U检测细胞增殖能力。Sirt3过表达质粒(OV-Sirt3)转染于PC-9和A549细胞中、N-乙酰半胱氨酸乙酯(N-acetylcysteine,NAC)作用于细胞后分别经1μmol/L吉非替尼处理4 h和10%CSE处理48 h。Western blot检测Sirt3、SOD2蛋白表达,DCFH-DA探针检测细胞中的ROS水平,CCK-8检测细胞活性。结果CSE均可促使PC-9、A549细胞对吉非替尼的半数抑制浓度(50%inhibitory concentration,IC_(50))提高(P<0.01),并且增强PC-9和A549细胞的增殖能力,提示CS可诱导NSCLC吉非替尼耐药;ROS参与CSE诱导的吉非替尼耐药(P<0.05);CSE诱导Sirt3、SOD2低表达(P<0.01),且Sirt3/SOD2与肺癌患者不良预后有关(P<0.05);OV-Sirt3的PC-9、A549细胞可逆转CSE诱导的吉非替尼耐药(P<0.05)且显著降低ROS生成;NAC可逆转CSE诱导的PC-9、A549细胞吉非替尼耐药(P<0.05)。结论ROS/Sirt3/SOD2通路参与了CS诱导的NSCLC吉非替尼耐药。

PAK3通过激活ERK1活性介导非小细胞肺癌对吉非替尼耐药

目的:探讨p21激活激酶3(PAK3)在介导非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)对吉非替尼耐药过程中的作用和分子机制。方法:我们通过免疫组化方法检测了肺腺癌患者在出现吉非替尼耐药前后PAK3的表达模式,并通过Western Blot检测了PAK3在肺癌细胞系HCC827和PC9吉非替尼耐药前后的表达模式。应用PAK3-siRNA下调肺癌细胞系中PAK3的表达后,通过Western Blot和细胞功能学实验,检测肺癌细胞系的增殖、侵袭能力及ERK1的活性变化。抑制ERK1的活性后,转染PAK3-cDNA质粒,检测肺癌细胞系的增殖、侵袭能力及其对吉非替尼的敏感性变化。结果:PAK3在肺癌组织和细胞系对吉非替尼耐药后出现显著增强;在肺癌细胞系中,PAK3能够促进肺癌细胞增殖、侵袭能力及相关蛋白的表达,激活ERK1的活性,并减弱肺癌细胞系对吉非替尼的敏感性。抑制ERK1的活性后,PAK3的表达上调对肺癌细胞恶性表型的促进作用,及其对吉非替尼耐药的促进作用显著减弱。结论:PAK3通过激活ERK1促进肺癌细胞的增殖和侵袭能力,进而促进NSCLC对吉非替尼耐药。

ROR1激活AKT/FOXO1信号介导非小细胞肺癌吉非替尼耐药

EGFR-TKI靶向治疗在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)综合治疗中显示出重要作用;然而,耐药性却极大限制其临床治疗效果。受体酪氨酸激酶样孤儿受体(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1,ROR1)是Ⅰ型受体酪氨酸激酶家族中的成员,在肿瘤发生发展中发挥重要作用。本研究拟探讨ROR1介导非小细胞肺癌吉非替尼耐药的作用及机制。采用吉非替尼反复诱导非小细胞肺癌HCC827细胞,建立吉非替尼耐药细胞株HCC827/GR。应用荧光定量PCR和Western印迹检测HCC827/GR内ROR1的表达。采用shRNA的方法体外检测ROR1敲除前后HCC827/GR对吉非替尼耐药的变化,采用体外检测ROR1过表达前后HCC827对吉非替尼耐药的变化。体内检测ROR1敲除前后HCC827/GR对吉非替尼耐药的变化。Western印迹检测HCC827/GR内ROR1下游信号分子的活化。实时荧光定量PCR及Western印迹结果显示,HCC827/GR耐药细胞中的ROR1 mRNA和蛋白质表达水平显著高于HCC827敏感细胞。体外干扰ROR1表达,可明显增强HCC827/GR耐药细胞对吉非替尼的敏感性(IC_(50) 15.3±3.69 vs.4.2±1.38),增加吉非替尼诱导的细胞凋亡(20.5±2.52 vs.41.8±3.74)。体外过表达ROR1显著增强HCC827敏感细胞对吉非替尼的耐药性(IC_(50) 0.8±0.52 vs.2.2±0.87)。体内裸鼠移植瘤实验同样发现,干扰ROR1能增强HCC827/GR移植瘤对吉非替尼的敏感性。进一步研究发现,AKT/FOXO1信号在HCC827/GR耐药细胞中异常活化,而干扰ROR1能够抑制AKT的磷酸化,并上调FOXO1的表达。上述结果表明,ROR1参与非小细胞肺癌吉非替尼耐药,抑制ROR1能够逆转吉非替尼耐药,其机制与ROR1调控AKT/FOXO1信号有关。

活性氧在导致吉非替尼耐药细胞凋亡中的作用

目的:研究针对K-ras突变小分子NSC-741909是否可特异性杀伤吉非替尼原发耐药细胞,并对活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)在其中的作用进行探讨。方法:选取H322(K-ras野生)及A549(K-ras突变)人源非小细胞肺癌细胞系,观察吉非替尼对不同细胞系生长的影响;NSC-741909作用于吉非替尼耐药细胞,观察细胞增殖与凋亡的变化;DCFH-DA荧光探针标记细胞内ROS,FCM检测细胞内ROS水平的变化,Western blot检测细胞内JNK通路蛋白变化。结果:K-ras突变型细胞对吉非替尼原发耐药,但NSC-741909可使这种原发耐药细胞出现凋亡;细胞内产生ROS,p-JNK表达增加而总JNK无改变,MKP1表达受抑制。结论:针对K-ras突变的小分子NSC-741909可使吉非替尼耐药细胞产生凋亡,NSC-741909通过使细胞内产生ROS持续激活JNK通路,是其导致吉非替尼耐药细胞凋亡的可能机制之一。

吉非替尼耐药后加量疗法对比更换厄洛替尼治疗晚期非小细胞肺癌的价值评估

目的探讨吉非替尼耐药后加量疗法对比更换厄洛替尼治疗晚期非小细胞肺癌的价值评估。方法 80例吉非替尼耐药的晚期非小细胞肺癌患者,随机分为对照组和观察组,各40例。对照组采用厄洛替尼治疗,观察组采用吉非替尼加量疗法,比较两组患者的临床疗效疾病进展时间和总生存期及不良反应。结果观察组治疗有效率为22.50%、疾病控制率为65.00%,明显高于对照组的10.00%、42.50%,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组疾病进展时间为(96.2±8.7)d、总生存期为(233.5±26.4)d,明显长于对照组的(82.5±10.4)、(194.3±23.8)d,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组腹泻、皮疹、药物相关性慢性胰腺炎的发生率与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论吉非替尼耐药后加量疗法和更换厄洛替尼治疗晚期非小细胞肺癌均能获得临床受益,但加量疗法的效果更好,能明显延长患者生存周期,且不良反应轻微,具有积极的临床意义。

砷剂对吉非替尼耐药非小细胞肺癌裸鼠皮下肿瘤的作用

旨在研究三氧化二砷对吉非替尼耐药非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株NCI-H1975建立的裸鼠皮下肿瘤模型的作用效果。将NCI-H1975细胞(8×106个/只)注射于裸鼠右腋下,待肿瘤长到100 mm3时,随机将小鼠分为3组,对照组(生理盐水200μL,腹腔注射),砷剂组(三氧化二砷5 mg/kg,腹腔注射)以及吉非替尼组(吉非替尼125 mg/kg,灌胃)。裸鼠接种肿瘤细胞待肉眼可见的肿瘤出现后,每天测量肿瘤的长径和短径,计算肿瘤体积。药物作用18 d时,对小鼠进行整体拍照后进行安乐死,分离肿瘤、肺、脾等脏器,分别进行病理和电镜检测。结果显示:与对照组和吉非替尼组相比,砷剂组小鼠的肿瘤体积、重量及脾脏指数显著(P<0.05)或极显著降低(P<0.0001,P<0.01);肿瘤组织病理观察发现,与对照组和吉非替尼组相比,砷剂组肿瘤内出现明显坏死灶;电镜结果显示,砷剂组肿瘤内部能观察到自噬体;肺部病理结果显示,与对照组和吉非替尼组相比,砷剂组的肺泡壁较薄,仅见少许淋巴细胞浸润。研究表明,在裸鼠体内,砷剂能够抑制吉非替尼耐药NSCLC皮下移植瘤生长,诱导肿瘤发生自噬和坏死,保护肺部结构的完整性。

二甲双胍通过干预上皮-间质转化逆转尼古丁诱导的肺癌吉非替尼耐药

目的:探讨尼古丁(nicotine,NIC)诱导EGFR敏感突变PC-9肺癌细胞株吉非替尼耐药及二甲双胍对其作用。方法:PC-9分成4组:空白组、尼古丁组、二甲双胍组、尼古丁和二甲双胍组,利用定量反转录聚合酶连锁反应(quantificational realtime polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测E-cadherin和Vimentin信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,m RNA)的表达,Western blot检测E-cadherin和Vimentin蛋白表达,细胞计数试剂盒(cell counting Kit-8,CCK-8)检测不同分组细胞对吉非替尼药物敏感情况。Transwell小室实验检测细胞侵袭迁移。结果:尼古丁诱导PC-9细胞上皮间质转化呈时间浓度依赖,在10μmol/L尼古丁处理72 h后,发生E-cadherin下调和Vimentin上调最明显,故选该条件做以下实验。CCK-8提示,相比空白组,尼古丁组PC-9细胞对吉非替尼敏感性减弱,在吉非替尼浓度为0.05μmol/L最明显(P=0.000)。Matrigel侵袭实验提示尼古丁组穿膜细胞数较空白组明显增多[(15.70±1.53)个/高倍视野vs.(32.70±2.08)个/高倍视野,F=75.406,P=0.000,P=0.000];迁移实验的结果与之相似。与空白组相比,尼古丁组E-cadherin m RNA表达水平明显降低[(0.932±0.100)vs.(0.459±0.024),F=25.924,P=0.000,P=0.000)],Vimentin m RNA表达水平明显升高[(1.200±0.200)vs.(1.973±0.129),F=20.998,P=0.000,P=0.000]。蛋白水平变化与之相同。尼古丁+二甲双胍组可以增加尼古丁作用PC-9对吉非替尼的敏感性,在吉非替尼浓度为0.05、0.10、0.50、1.00、5.00μmol/L时有统计学意义。尼古丁+二甲双胍组可以减弱尼古丁组的穿膜数[(17.00±2.00)个/高倍视野vs.(32.70±2.08)个/高倍视野,F=75.406,P=0.000,P=0.000],迁移实验呈现相同的结果。相比于尼古丁组,尼古丁+二甲双胍组上调E-cadherin m RNA[(0.459±0.024)vs.(0.838±0.058),F=25.924,P=0.000,P=0.000)],下调Vimentin m RNA[(1.973±0.129)vs.(1.467±0.115),F=20.998,P=0.000,P=0.003)]。结论:尼古丁通过上皮间质转化诱导PC-9细胞吉非替尼耐药,二甲双胍可以逆转上述现象。

培美曲塞或多西他赛联合卡铂治疗吉非替尼耐药的晚期肺腺癌患者的疗效

目的:观察培美曲塞或多西他赛联合卡铂治疗吉非替尼耐药的晚期肺腺癌患者的疗效和安全性。方法:56例吉非替尼耐药的晚期(Ⅲ~Ⅳ期)肺腺癌患者中,28例采用培美曲塞联合卡铂化疗(培美曲塞组),28例采用多西他赛联合卡铂化疗(多西他赛组),21 d为1个化疗周期,2个化疗周期后评估疗效及不良反应,并进行长期随访。结果:2组近期疗效相比,差异无统计学意义(P=0.159);2组的治疗有效率、疾病控制率、无进展生存期及总生存时间相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。培美曲塞组Ⅲ、Ⅳ度白细胞减少、中性粒细胞减少、血小板减少、恶心呕吐的发生率均较多西他赛组下降(P<0.05)。结论:培美曲塞联合卡铂与多西他赛联合卡铂治疗吉非替尼耐药的晚期肺腺癌患者疗效相当,但培美曲塞联合卡铂方案的不良反应更轻,更值得临床推广。

吉非替尼耐药的低分化肺癌细胞系的建立及其生物学特征分析

目的从1例中国女性肺癌患者的胸腔积液中分离建立原代低分化肺癌细胞系,并进行生物学特征分析。方法收集1例肺癌患者胸腔积液,取沉淀物,在含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液和1%非必需氨基酸的DMEM/F12培养液中培养。待细胞长满后,使用胰蛋白酶梯度消化法传代使肿瘤纯度达>95%。进一步分析已建立细胞系(命名为ZLC-001)的核型、短串联重复序列(short tandem repeats,STR)、细胞增殖、肿瘤标志物检测和成瘤性等生物学特征。肿瘤原代细胞三维立体培养法药敏检测技术(collagen gel droplet-embedded culture drug sensitivity test,CD-DST)用于评估ZLC-001对吉非替尼、舒尼替尼、索拉非尼、拉帕替尼和伊马替尼的药物敏感性。结果成功建立来自低分化肺癌患者(女性,44岁,pStageⅣ)的原代细胞系ZLC-001。ZLC-001细胞可贴壁生长,并可稳定传代>30代。生物学特征分析中核型分析表明染色体数目主要分布在60~69。免疫组织化学结果显示,细胞角蛋白(cytokeratin,CK)和乳腺癌相关蛋白1(breast cancer associated protein 1,BRAP1)为阳性,波形蛋白、Wnt-1和钙结合蛋白(calretinin,CR)个别阳性,Napsin A、MOC-31、甲状腺转录因子1(thyroid transcription factor 1,TTF1)和D2-40均为阴性。ZLC-001细胞在裸鼠中成瘤能力强。ZLC-001对吉非替尼、舒尼替尼、索拉非尼和伊马替尼耐药,但对拉帕替尼中度敏感。结论成功建立来自中国患者的新型低分化肺癌细胞系。这种功能齐全的细胞系为开展肺癌生物学和药物反应研究提供理想的模型与工具。

干扰FOXC1逆转非小细胞肺癌吉非替尼耐药的作用

背景与目的肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌的80%。表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)靶向治疗已成为NSCLC临床治疗的主要手段,然而不可避免的耐药性出现极大限制了EGFR-TKI的治疗效果。叉头框蛋白C1(forkhead box protein C1,FOXC1)是叉头框蛋白家族重要成员,在NSCLC异常表达并参与调控NSCLC进展。本研究旨在探讨干扰FOXC1对NSCLC吉非替尼耐药的影响及可能机制。方法应用Western blot、免疫组化方法检测FOXC1在NSCLC吉非替尼耐药细胞和组织中的表达情况;应用FOXC1 shRNA转染HCC827/GR细胞,筛选稳定干扰FOXC1的HCC827/GR细胞,采用新型四氮唑盐比色法(Methyl-thiazolyldiphenyl-sulfophenyl-tetrazolium bromide assay,MTS)法、流式细胞术及微球体形成实验检测细胞增殖、细胞凋亡及细胞自我更新能力;采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、Western blot检测干性标志物SOX2、Nanog、OCT4和CD133的表达水平;运用流式细胞术检测CD133的表达情况;免疫组化检测耐药组织中SOX2和CD133的表达情况;基于癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库的肺腺癌数据集,分析FOXC1、SOX2和CD133表达的相关性。结果FOXC1在NSCLC吉非替尼耐药细胞HCC827/GR的表达水平显著高于HCC827敏感细胞(P<0.05),免疫组化结果显示FOXC1在NSCLC吉非替尼耐药组织中高表达。与对照组相比,稳定干扰FOXC1的HCC827/GR细胞对吉非替尼的半数抑制浓度(50%inhibitory concentration,IC50)值显著降低(P<0.01),细胞增殖能力降低、凋亡率升高(P<0.05)。干扰FOXC1能够抑制SOX2、CD133的表达,并减弱HCC827/GR耐药细胞的微球体形成能力。免疫组化结果显示,吉非替尼耐药组织中SOX2和CD133表达显著高于敏感组织(P<0.01)。相关性分析结果显示,FOXC1、SOX2和CD133表达两两呈正相关(P<0.05)。结论FOXC1参与NSCLC吉非替尼耐药,其机制可能与FOXC1调控肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)特性有关。

miR-501靶向BLID介导吉非替尼耐药性非小细胞肺癌的恶性表型

目的探究miR-501在吉非替尼耐药非小细胞肺癌(NSCLC)中的作用和机制。方法采用实时定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)检测吉非替尼耐药性NSCLC血清和细胞系PC9/GR中miR-501的表达水平,通过CCK-8、划痕实验和Transwell实验检测miR-501对PC9/GR的恶性表型的影响;利用在线数据库预测miR-501的潜在靶点,并验证其在PC9/GR的具体作用。结果与健康对照人群和正常人肺上皮细胞系比较,miR-501在吉非替尼耐药性NSCLC患者血清和PC9/GR中表达水平升高,差异有高度统计学意义(P <0.01);与mimics NC比较,miR-501 mimics PC9/GR的增殖、迁移和侵袭能力增加,差异有高度统计学意义(P <0.01);荧光素酶报告基因实验证实BLID是miR-501的直接靶点;与miR-501 mimics+pcDNA3.1比较,miR-501 mimics+pcDNA3.1-BLID PC9/GR的增殖、迁移和侵袭能力下降,差异有高度统计学意义(P <0.01)。结论上调表达的miR-501通过抑制BLID进而促进吉非替尼耐药性NSCLC的增殖、迁移和侵袭能力。因此,miR-501是吉非替尼耐药性NSCLC的潜在靶点。

miR-98调节IL-6/STAT3通路对肺癌HCC827细胞吉非替尼耐药的影响

目的:探究microRNA-98(miR-98)调节白细胞介素-6/信号传导与转录激活因子3(IL-6/STAT3)通路对肺癌HCC827细胞吉非替尼耐药(GR)的影响。方法:体外培养肺癌HCC827细胞(NC组),采用肝细胞生长因子(HGF)联合吉非替尼反复诱导肺癌HCC827细胞建立吉非替尼耐药HCC827细胞(GR组),转染miR-98 mimics/NC,分别设为mimic组和mimic-NC组,另外将亲本HCC827细胞作为对照组(Con组)。采用噻唑蓝(MTT)试剂盒检测细胞活性,流式细胞仪检查细胞凋亡情况,实时定量PCR(RT-qPCR)检测细胞miR-98、IL-6、STAT3 mRNA表达,免疫印迹(WB)检测细胞IL-6、STAT3蛋白表达。结果:随吉非替尼处理浓度增加,HCC827细胞、HCC827 GR细胞活性依次降低(P<0.05),同一浓度,HCC827 GR细胞活性高于HCC827细胞(P<0.05)。与Con组比较,NC组、mimics-NC组细胞中miR-98水平降低,而mimics组细胞中miR-98水平明显高于Con组、NC组、mimics-NC组(P<0.05);与Con组比较,NC组、mimics-NC组、mimics组细胞中IL-6、STAT3 mRNA及蛋白水平、细胞活性明显升高,而细胞凋亡率明显降低(P<0.05),且mimics组细胞中IL-6、STAT3 mRNA及蛋白水平、细胞活性明显低于NC组、mimics-NC组,而细胞凋亡率明显高于NC组、mimics-NC组(P<0.05)。结论:miR-98过表达可扭转HCC827细胞吉非替尼耐药,其作用机制可能与抑制IL-6/STAT3通路活化有关。

靶向p21蛋白激活激酶2逆转非小细胞肺癌细胞吉非替尼耐药

靶向突变的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)治疗中显示出越来越重要的作用。然而,不可避免的耐药性的出现极大限制了TKI的临床治疗效果。p21蛋白激活激酶2(p21-activated protein kinase 2,PAK2)是丝/苏氨酸激酶家族的重要成员,在肿瘤发生与发展中发挥重要的作用。本研究拟探讨靶向抑制PAK2逆转非小细胞肺癌吉非替尼耐药的作用及可能机制。首先Western印迹检测发现,相比非小细胞肺癌吉非替尼敏感细胞HCC827,耐药细胞HCC827/GR中PAK2的蛋白质磷酸化水平显著上调(P<0.01),而PAK2总蛋白质水平未见明显变化。采用PAK2抑制剂FRAX597和G5555诱导HCC827/GR细胞,MTS及克隆形成结果显示,抑制剂FRAX597和G5555均能显著增加HCC827/GR细胞对吉非替尼的敏感性(P<0.01)。流式细胞术分析发现,抑制剂FRAX597处理诱导HCC827/GR细胞发生G2/M期阻滞,并增加吉非替尼诱导的HCC827/GR细胞的凋亡以及切割胱天蛋白酶3(cleaved caspase 3)表达(P<0.01)。最后,Western印迹结果显示,抑制剂FRAX597处理能够抑制HCC827/GR细胞BCL-2和CDK4蛋白质表达(P<0.05),上调BAX、p21和p27蛋白质表达(P<0.05)。综上所述,PAK2活化与非小细胞肺癌吉非替尼耐药性密切相关;靶向抑制PAK2活化能够诱导细胞周期阻滞及凋亡,从而提高非小细胞肺癌细胞对吉非替尼的敏感性。

阿法替尼联合培美曲塞和卡铂化疗治疗吉非替尼耐药肺腺癌患者的临床效果

目的分析阿法替尼联合培美曲塞和卡铂化疗治疗吉非替尼耐药肺腺癌患者的临床效果。方法将149例吉非替尼耐药肺腺癌患者分为化疗组74例和联合组75例。化疗组患者采用培美曲塞+卡铂化疗,联合组在上述化疗方案的基础上口服阿法替尼治疗。比较两组患者治疗前后的肿瘤标志物[糖类抗原199、癌胚抗原、细胞角蛋白19片段抗原21-1(CYFRA21-1)]水平,肿瘤增殖基因[B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)]、肿瘤凋亡基因[Bcl-2相关X蛋白(Bax)]mRNA的相对表达水平,以及小核仁RNA宿主基因(SNHG)12、SNHG15、SNHG16的相对表达水平。评价两组患者的临床疗效,随访2年的生存情况,并记录其治疗过程中的毒副反应发生情况。结果与治疗前水平和化疗组治疗后水平相比,联合组治疗后的糖类抗原199、癌胚抗原、CYFRA21-1、Bcl-2 mRNA相对表达水平及SNHG12、SNHG15、SNHG16相对表达水平降低,Bax mRNA相对表达水平升高(均P<0.05)。两组患者的毒副反应总发生率差异无统计学意义(P>0.05)。联合组患者的临床缓解率和2年生存率均高于化疗组,且中位无进展生存期和中位总生存期长于化疗组(均P<0.05)。结论与单纯培美曲塞+卡铂化疗相比,阿法替尼联合该化疗方案治疗吉非替尼耐药肺腺癌患者,可更有效地抑制肿瘤增殖、促进肿瘤凋亡,并下调SNHG12、SNHG15、SNHG16表达,从而抑制肿瘤进展,提高临床疗效,延长患者生存期。

高表达CXCR4可通过乳酸脱氢酶A磷酸化诱导肺腺癌细胞产生吉非替尼耐药

目的:探讨CXC趋化因子受体4(CXCR4)高表达诱导肺腺癌细胞产生吉非替尼耐药的潜在机制。方法:检测含EGFR-19del点突变的肺腺癌细胞中CXCR4的表达情况,以siRNA干扰或慢病毒感染调控细胞CXCR4的表达,通过克隆形成、CCK-8、流式细胞凋亡术、细胞凋亡相关蛋白测定、裸鼠皮下成瘤等实验鉴定细胞的吉非替尼敏感性。采用免疫共沉淀结合质谱分析法筛选CXCR4的相互作用蛋白。检测细胞的有氧糖酵解水平,并检测细胞在糖酵解抑制剂处理下的吉非替尼敏感性。结果:PC9/GR细胞存在显著的吉非替尼耐药性,PC9/GR细胞的吉非替尼IC50是PC9细胞的近100倍(19.15μmol/L vs 0.195μmol/L)。CXCR4在PC9/GR细胞中高表达(>4倍高于PC9细胞),抑制CXCR4可显著逆转PC9/GR细胞的耐药性。过表达CXCR4可诱导PC9细胞产生耐药,使吉非替尼IC50由0.89μmol/L升高至10.10μmol/L。乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)是新型CXCR4底物:CXCR4过表达通过促进LDHA磷酸化,从而增强细胞的有氧糖酵解功能;糖酵解抑制剂可显著逆转CXCR4高表达所诱导的吉非替尼耐药。结论:CXCR4高表达通过促进LDHA磷酸化使有氧糖酵解功能增强,从而诱导肺腺癌细胞产生吉非替尼耐药,是潜在的吉非替尼耐药治疗靶点。

姜黄素逆转非小细胞肺癌吉非替尼耐药的研究

目的研究姜黄素对吉非替尼耐药非小细胞肺癌细胞株PC9／G2耐药性的影响及作用机制。方法MTT法测定姜黄素对PC9／G2的无毒剂量及对PC9／G2对吉非替尼耐药的逆转效应，实时荧光定量法测定姜黄素对EGFR下游通路中P13K表达水平的影响，分光光度法测定姜黄素对凋亡蛋白Caspase-3活性的影响。结果姜黄素对PC9／G2的无毒剂量为4μmol·L^-1，姜黄素联合吉非替尼组细胞存活率比单用吉非替尼组降低13％～22％，姜黄素使P13K的表达水平明显下降，Caspase-3凋亡蛋白活性显著提高。结论姜黄素对PC9／G2具有耐药逆转作用，作用机制可能是通过下调P13K的表达水平，诱导更多的凋亡蛋白Caspase-3而实现。

新型小分子药物特异性抑制吉非替尼原发耐药肺癌的体内实验研究

目的:研究针对K-ras突变小分子药物NSC-741909对吉非替尼原发耐药肿瘤模型的治疗作用,并对其机制进行研究。方法:选取H322(吉非替尼敏感,K-ras野生)及A549(吉非替尼耐药,K-ras突变)人源非小细胞肺癌细胞株,分别建立裸鼠皮下移植瘤模型,给予NSC-741909腹腔注射绘制肿瘤生长曲线;进行凋亡检测;定量RT-PCR及Western Blot方法观察K-ras、JNK、p-JNK、MKPl的改变。结果:NSC-741909能明显抑制吉非替尼耐药肺癌裸鼠皮下移植瘤的生长,并导致肿瘤细胞出现凋亡,K-ras突变表达受抑,MKPl表达明显下降,p-JNK表达增加,而总JNK蛋白表达无改变;但对吉非替尼敏感肿瘤模型无显著抑制。结论:针对K-ras突变的小分子NSC-741909可特异性抑制吉非替尼原发耐药裸鼠移植瘤生长,抑制p-JNK去磷酸化导致JNK持续激活而诱发细胞出现凋亡是其机制之一。

葫芦素B诱导EGFR溶酶体降解并通过CIP2A/PP2A/Akt信号轴抑制吉非替尼耐药的非小细胞肺癌的作用机制

目的:探讨葫芦素B(cucurbitacin B,CuB)诱导表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)溶酶体降解并通过CIP2A/PP2A/Akt信号轴抑制吉非替尼耐药(gefitinib-resistant,GR)的非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer,NSCLC)的作用机制。方法:MTT测定CuB和Gefitinib对H1975和H820细胞的抑制作用,Transwell侵袭实验及划痕愈合实验检测细胞转移能力,实时定量PCR检测EGFR基因的表达水平,Western blot检测相关蛋白的表达水平。结果:CuB不仅能抑制GR NSCLC细胞的增殖和侵袭,诱导其凋亡;而且能够促进EGFR溶酶体降解,以及下调CIP2A/PP2A/Akt信号轴。结论:CuB通过诱导EGFR溶酶体降解和下调CIP2A/PP2A/Akt信号轴来抑制GR NSCLC细胞的增殖和侵袭,可能成为治疗GR NSCLC的新型候选药物。

非小细胞肺癌K—ras突变小分子对吉非替尼耐药细胞的作用

目的观察针对K-ras突变小分子NSC-741909是否可特异性杀伤吉非替尼原发耐药细胞，并探讨其机制。方法选取吉非替尼耐药细胞；观察NSC-741909作用后细胞增殖与凋亡的变化；共聚焦显微镜观察细胞骨架改变；Westernblot检测K-ras、JNK、p-JNK的改变。结果NSC-741909可使耐药细胞在作用24h后，在1μmol／L和2μmol／L时，FITC—A＋／PE—A＋细胞增加至（6．9±0．6）％和（21．1±3．2）％（P〈0．01）；作用30min后，K-ras表达在2h下降达70％；p—JNK表达增加，并持续至少15h，而总JNK蛋白表达无改变；细胞骨架蛋白F—actin呈稀疏、不规则、发散状排列。结论针对K—ra8突变的小分子NSC-741909可特异性杀伤吉非替尼原发耐药细胞，这是通过持续激活JNK途径从而导致细胞凋亡实现的。