同位素标记相对和绝对定量评价非创伤性股骨头坏死患者的血清蛋白组学分析

背景:非创伤性股骨头坏死是一类以髋关节疼痛、功能障碍进行性加重为主要症状的疾病,严重危害人体健康。它的发病机制、早期诊断和治疗仍是临床骨科医生所面临的重大挑战。目的:采用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术,用蛋白质组学筛选可能与非创伤性股骨头坏死相关的关键蛋白。通过分析这些蛋白的表达特性及潜在的生物学功能,为进一步研究非创伤性股骨头坏死病因及分子机制奠定基础。方法:提取非创伤性股骨头坏死患者和健康人血清蛋白,应用iTRAQ技术标记蛋白,联合液相色谱和串联质谱分离和分析肽段。采用Proteome Discoverer 2.1软件对两组人群蛋白进行鉴定和定量分析,获得差异蛋白,再对这些表达差异蛋白进行GO注释、KEGG通路注释和功能富集聚类分析。结果与结论:①质谱鉴定共得到1006个蛋白,通过分析得到137个差异表达蛋白,其中54个蛋白表达上调,83个蛋白表达下调;②与非创伤性股骨头坏死发生相关的表达差异显著的蛋白质包括载脂蛋白B(ApoB)、载脂蛋白A2(ApoA2)、载脂蛋白E(ApoE)、补体C4和C7等;③KEGG信号通路富集分析结果显示,关键靶点的主要信号通路为p53信号通路、转录生长因子β信号通路、扩张型心肌病信号通路;④该结果提示,载脂蛋白与非创伤性股骨头坏死发生密切相关,并发现了与非创伤性股骨头坏死相关的活跃信号通路,为非创伤性股骨头坏死发生及分子机制奠定一定的实验基础。

应用同位素标记相对和绝对定量技术筛选白厚苔和黄厚苔乳腺癌患者唾液差异表达蛋白

目的:筛选乳腺癌白苔和黄苔患者与健康对照组之间的唾液差异表达蛋白,以寻找乳腺癌早期诊断的生物标记物,探索中医舌苔形成的机制。方法:纳入具有典型的白厚苔或黄厚苔的乳腺癌患者以及薄白苔健康人各10例。采集唾液提取蛋白,然后进行蛋白变性、还原及酶解,最后进行同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags forrelative and absolute quantitation,i TRAQ)标记和液相色谱串联质谱联用技术鉴定,得到的峰图用Data Analysis4.0,Mascott2.2软件和Scaffold软件分析,得出表达量差异结果。鉴定蛋白的组间比值>1.5或<0.6被认为存在表达差异。结果:共鉴定出464个蛋白,其中达到严格定量标准的蛋白125个。与健康对照组比较,乳腺癌白苔组和黄苔组共筛选出9个唾液差异表达蛋白,乳腺癌白苔组和黄苔组之间筛选出16个差异蛋白。结论:本研究证实i TRAQ结合液相色谱串联质谱联用技术能够快速、有效地进行差异蛋白质组学研究,发现一些蛋白与乳腺癌的发生以及中医舌苔形成机制相关。

同位素标记相对和绝对定量蛋白组技术研究进展

近年来定量蛋白组学技术迅速发展,目前常用的有双向荧光差异凝胶电泳、同位素亲和标记、15N同位素标记、同位素标记相对和绝对定量和细胞培养条件下稳定同位素标记技术等。同位素标记相对和绝对定量技术以其高通量、高灵敏度、高重复性、高动态检测限和能对各种复杂样品进行相对和绝对定量研究等优势而备受研究者青睐,目前已发展到在同一实验中分析8组样品,增加了实验设计的灵活性。我们就同位素标记相对和绝对定量技术在定量蛋白组史中的地位作用、研究策略,以及在病毒致病机制研究和医药临床相关问题中的应用做简要综述。

同位素标记相对和绝对定量技术在药物蛋白质组学研究中的应用

目的建立应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术进行药物蛋白质组学研究的技术平台。方法分别测定12例高血压患者在给予降压药氨氯地平治疗前和治疗后8周的收缩压和舒张压,并同时收集患者在降压药治疗前和治疗后8周的血清,应用蛋白质组学iTRAQ技术对治疗前后的血清蛋白质组进行定量分析。结果高血压患者口服降压药苯磺酸氨氯地平片8周后平均收缩压和舒张压均明显降低(P<0.01)。经iTRAQ和ProteinPilot软件分析,共鉴定出232个差异蛋白质,其中降压药物治疗后表达上调和下调超过1.5倍的蛋白质分别有12种和13种。上调的蛋白质主要参与应激、防御和免疫反应,而下调的蛋白质主要参与应激、防御、炎症和凝血反应。本研究结果提示,降压药氨氯地平治疗可以双向调节机体的应激和防御反应,可以增强机体的免疫力,抑制炎症反应和改善高血凝状态,从而有利于血压的降低。结论应用iTRAQ技术进行药物蛋白质组学研究可筛选获得多种与药物疗效相关的差异蛋白质,为药物作用靶点和分子机制等方面的研究提供了一个良好的技术平台。

利用同位素标记相对和绝对定量技术筛查神经管畸形胚胎孕鼠血清差异蛋白质谱

目的筛查神经管畸形相关血清标记物,为阐明神经管畸形的发病机制提供理论依据。方法应用维甲酸在大鼠神经管闭合的关键期(孕10 d,E10)给药,建立脊柱裂大鼠模型,选取致畸早期孕11、13 d (E11、E13)显性脊柱裂胚胎孕鼠和正常胚胎孕鼠血清各5例,应用同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)和液相色谱质谱鉴定技术分析2组蛋白质,定量信息以蛋白的丰度比差异倍数1.5倍以上(P <0.05)为差异蛋白质。结果质谱共得到谱图157 422张,鉴定出390种蛋白质,发现E11维甲酸致畸组与正常对照组差异蛋白40种,E13维甲酸致畸组与正常对照组差异蛋白26种。结论筛选出致畸早期大量神经管畸形和正常孕鼠血清差异蛋白,差异蛋白通过直接或间接相互作用,促进或抑制神经管畸形的发生与发展。

稳定同位素标记氨基酸细胞培养联合质谱绝对定量技术在5、7、55型腺病毒鉴定中的应用

利用稳定同位素标记肽段的质谱绝对定量(AQUA)技术,实现了对5、7和55型人腺病毒的准确鉴定。采用细胞培养条件下稳定同位素代谢标记(SILAC)技术培养细胞至大肠杆菌生长至对数生长期,1 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)低温诱导蛋白表达,提取并利用谷胱甘肽S转移酶(GST)纯化富集相应标记的腺病毒六邻体蛋白。通过胶消化分别消化三种不同标记策略(非标记、中度标记和重度标记)的纯化蛋白,消化肽段等量混合脱盐后经纳流液相色谱-串联质谱(Nano HPLC-MS/MS)进行定量蛋白分析。通过SILAC实现大肠杆菌的完整代谢标记,诱导表达腺病毒六邻体蛋白,通过AQUA技术实现对非标记、中度标记、重度标记六邻体蛋白标志性肽段鉴定。成功实现SILAC三种不同标记策略条件下大肠杆菌中5、7、55型人腺病毒六邻体蛋白的完整标记,为5、7、55型人腺病毒感染的快速分型检测提供了新的鉴定策略。

基于同位素标记相对和绝对定量技术研究藏香猪冷鲜肉冰温保鲜分子机制

本研究基于同位素标记相对和绝对定量技术研究冰温-2℃和冷藏4℃条件下,藏香猪冷鲜肉蛋白质组变化及其与微生物指标(菌落总数)、理化品质(总挥发性盐基氮(total volatile base nitrogen,TVB-N)含量、弹性)、蛋白质二级结构(β-折叠和β-转角相对含量)变化的关系。结果表明:与4℃贮藏条件相比,-2℃贮藏条件下猪肉菌落总数、TVB-N含量、弹性以及蛋白质二级结构变化速率相对较低。蛋白质组学分析结果表明,在-2℃和4℃贮藏条件下,猪肉中共179个蛋白发生了明显变化,其中,丰度显著差异蛋白143个。-2℃下16 d/0 d和4℃下16 d/0 d相比较有丰度差异蛋白97个,其中共有丰度差异蛋白61个。这些差异蛋白主要涉及结构蛋白、代谢酶、应激蛋白和钙调节蛋白等。差异表达蛋白的表达量与菌落总数、理化品质(TVB-N含量、弹性)、蛋白质二级结构(β-折叠和β-转角相对含量)之间的相关性分析表明,肌球蛋白、原肌球蛋白、钙蛋白酶抑制蛋白表达量均与肉弹性、β-折叠相对含量呈极显著正相关(P<0.01),与菌落总数、TVB-N含量、β-转角相对含量呈显著或极显著负相关(P<0.05,P<0.01),相对于这3类蛋白,热休克蛋白与肉理化品质、蛋白质二级结构呈现相反的相关关系。结论:冰温贮藏能有效抑制腐败微生物增殖和猪肉蛋白质降解,降低藏香猪冷鲜肉TVB-N含量和减少蛋白质二级结构变化,维持肉弹性,进而达到冷鲜肉贮藏保鲜效果。本研究为深入理解冰温保鲜的分子机制、合理设计冰温贮藏条件提供了参考。

基于同位素相对标记与绝对定量技术结合质谱技术的幼年特发性关节炎血清蛋白质组学研究

目的应用同位素相对标记与绝对定量技术(iTRAQ)分析幼年特发性关节炎(JIA)患者与健康人群的血清差异蛋白。方法收集JIA患者血清18例、健康体检者20例、类风湿关节炎(RA)患者44例,采用iTRAQ标记联合纳升液相色谱-串联质谱筛选JIA患者的差异蛋白,并进行生物信息学分析。结果相对于健康体检组,JIA组共鉴定差异蛋白106个,其中49个表达上调,57个表达下调;JIA组和RA组中有26个差异蛋白均表达上调,37个表达下调。通过GO富集分析和KEGG通路分析,结果表明血液凝溶系统、免疫系统、脂质代谢与JIA的发病机制密切相关。通过STRING分析得到研究JIA机制的PPI网络的关键节点AHSG、APOH、脂联素等多个候选蛋白。结论本研究分析了JIA患者的血清蛋白质组,为JIA的诊断、JIA发病机制的探讨提供了实验依据。

基于绝对和相对定量同位素标记技术研究桃核承气汤延缓肾间质纤维化的机制

目的研究桃核承气汤延缓肾间质纤维化(renal intersitial fibrosis,RIF)的分子机制。方法30只SPF级健康wistar雄性大鼠,随机分为假手术组、模型组、药物组,每组10只;假手术组游离单侧输尿管,模型组及药物组采用单侧输尿管梗阻方法建立RIF模型。假手术组、模型组、药物组自术后第一天开始,分别灌服5 mL蒸馏水、5 mL蒸馏水、5 mL桃核承气汤,每日一次。14天后取梗阻侧肾组织,用绝对和相对定量同位素标记(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技术筛选差异蛋白,进行蛋白质组学检测,基因本体(gene ontology,GO)分析、京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)比对及聚类分析。结果桃核承气汤具有延缓单侧输卵管梗阻造成RIF的作用;药物组与模型组相比筛选的差异蛋白共343种,其中与RIF密切相关的蛋白16种,11种蛋白表达上调,5种蛋白表达下调。GO分析主要涉及氧化还原、药物代谢等生物学过程;线粒体基质、线粒体内膜等细胞组分;氧化还原酶活性等分子功能,KEGG分析涉及AMPK、FoxO/Wnt、PPAR、HIF-1等多条信号通路。结论桃核承气汤延缓肾间质纤维化的分子机制可能与调节磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶1(phosphoenolpyruvate carboxykinase 1,PCK1)等蛋白,影响AMPK、FoxO/Wnt、PPAR、HIF-1等信号通路相关。

应用同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学方法筛选浆细胞性乳腺炎病人差异表达蛋白质

目的分析浆细胞性乳腺炎组织的蛋白表达谱,寻找浆细胞性乳腺炎的关键分子。方法选择4例浆细胞性乳腺炎病人,术中留取病灶组织、正常组织标本,提取蛋白,采用同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学技术分析在浆细胞性乳腺炎中差异表达的蛋白质,并进行功能富集分析。结果在浆细胞性乳腺炎中,鉴定出915个差异蛋白(上调795个蛋白,下调120个蛋白)。功能富集分析表明这些差异蛋白主要参与细胞黏附、炎症反应等。KEGG通路分析发现,这些差异蛋白主要参与免疫系统相关信号通路。结论浆细胞乳腺炎中差异表达的蛋白质,参与了相关信号通路,可能是浆细胞性乳腺炎发生发展的关键分子。

变应性鼻炎同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学研究

目的研究变应性鼻炎(AR)患者鼻黏膜蛋白质表达谱的变化,从蛋白质水平探讨AR的发病机制。方法采用同位素标记相对和绝对定量技术检测正常成年人及AR患者中鼻道鼻腔黏膜中的蛋白表达谱,每组4例,筛选差异表达蛋白。结果在AR患者鼻黏膜与正常人鼻黏膜之间筛选出大量差异表达蛋白。上调蛋白60个,主要包括嗜酸性粒细胞溶血磷脂酶(CLC)、普列克底物蛋白同源结构蛋白7(PLEKHA7)等;下调蛋白160个,主要包括脑恶性肿瘤缺失基因(DMBT1)、S100钙结合蛋白(S100A1)等。结论 AR患者鼻黏膜与正常人鼻黏膜蛋白表达差异明显,其中CLC的上调与DMBT1的下调可能参与鼻黏膜的炎症及免疫应答反应。

出口梗阻型便秘病人的差异表达蛋白及其生物学功能-基于同位素标记相对和绝对定量的蛋白质组学研究

目的分析出口梗阻型便秘(ODS)病人病变直肠组织的差异表达蛋白及其生物学功能。方法纳入ODS病人20例、混合痔脱垂病人(无便秘症状)10例,所有病人均行经肛门吻合器直肠切除术并收集手术切除直肠标本。利用同位素标记相对和绝对定量技术筛选ODS病人与混合痔脱垂病人之间的差异表达蛋白谱,并对所有的差异表达蛋白进行基因本体论(GO)分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析和信号肽(SignalP)分析。结果ODS病人与混合痔脱垂病人之间差异表达蛋白共164个(表达上调88个,表达下调76个),涉及的生物过程主要包括细胞过程、生物调节、代谢过程等,涉及的细胞组成主要包括生化过程、细胞结构等,涉及的分子功能主要包括结合位点、催化活性、分子功能调节等。涉及的信号通路主要包括神经退化疾病、内分泌与代谢疾病及免疫疾病等。结论ODS病人与非便秘病人直肠组织蛋白存在差异,差异表达蛋白所参与的生物学过程及涉及的信号通路可能参与ODS发病机制。

同位素标记定量技术评估肾病综合征尿液蛋白质谱变化的初步探讨

目的旨在通过同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)技术分析原发性肾病综合征(PNS)患者尿液差异表达蛋白,寻找高特异性、无创性评估PNS的病理损害标记蛋白,并结合相应蛋白功能探讨其在PNS发病机制及疾病进展中的作用。方法 9例PNS患者肾穿刺当日和3例健康人的晨尿标本经毛细管高效液相色谱仪分离后,Q-Exactive质谱仪进行质谱分析,Maxquant 1.4.1.2和persus 1.4.1.3软件进行查库鉴定、定量和数据分析。结果成功得到PNS尿液蛋白SDS-PAGE电泳图谱,并得到724个蛋白质组,其中≥2的唯一肽段308个,定量、查库鉴定和数据分析最终得到差异蛋白表达明显的19个。其中与3例健康对照患者差异表达的蛋白3个,包括抗胰蛋白酶(AAT)、抗胰凝乳蛋白酶(AACT)和微管蛋白酪氨酸连接酶类似物7。结论 i TRAQ技术评估PNS尿液蛋白质组变化具有现实可行性,可以用于更深入的研究。

基于转录组和同位素标记相对与绝对定量技术的宽体金线蛭生品和烫制品差异蛋白研究

目的:通过转录组和蛋白质组技术研究宽体金线蛭生品和炮制品的差异蛋白。方法:以活体宽体金线蛭(Whitmania pigra Whitman)为原料,基于无参转录组进行基因分析,利用转录组信息匹配到Helobdella robusta蛋白质库,然后利用同位素标记相对与绝对定量技术(iTRAQ)蛋白组学技术进行宽体金线蛭的蛋白成分分析,筛选出存在于宽体金线蛭生品及炮制品中的差异蛋白质,并对其进行基因本体(GO)功能聚类分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析以及蛋白质相互作用网络分析(PPI),并结合BIOPEP数据库筛选可能具有抗凝活性的蛋白。结果:本研究筛选到差异表达蛋白共112种,其中78种上调蛋白、34种下调蛋白,并推定出6条可能具有抗凝作用的差异蛋白。GO功能聚类分析结果表明,在细胞过程(cellular process)、代谢过程(metabolic process)条目富集的差异蛋白数量最多。在差异性方面,大分子复合物(macromolecular complex)、结构分子活性(structural molecule activity)条目差异最显著。KEGG富集分析结果表明,差异蛋白在代谢途径(metabolic pathways)富集到的蛋白最多,ECM-受体相互作用(ECM-receptor interaction)、核糖体(ribosome)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)差异最显著。结论:本研究结合转录组、蛋白组数据,补充了宽体金线蛭的蛋白质库,筛选出了生品及烫制品的差异蛋白并推定了可能具有抗凝作用的差异蛋白,为宽体金线蛭基因组成、物质基础研究及炮制机制提供参考依据。

酶切型稳定同位素标记肽段为内标用于药物代谢酶的绝对定量分析

利用带有酶切位点的稳定同位素标记肽段作内标,采取3种方式处理样品,考察了不同的样品处理过程对实验结果准确性的影响。首先合成不同长度的带有酶切位点的肽段,考察其酶解过程,实验结果表明,胰蛋白酶的活性位点具有一定的选择性,最终确定目标肽段两端分别加入3个氨基酸所形成的肽段为内标。分别采用在酶解前加入带酶切位点的稳定同位素标记肽段、不带酶切位点的稳定同位素标记肽段以及在酶解过程后、质谱检测前加入不带酶切位点的稳定同位素标记肽段3种方式处理样品。结果表明,采取第一种方式处理样品的测定结果更接近真实值,相对偏差范围更小,可减小蛋白质绝对定量分析的误差,提高分析结果的重现性。

定量蛋白质组同位素标记技术及应用

定量蛋白质组学是对蛋白质组进行精确的定量和鉴定的学科,突破了传统蛋白质组研究集中于对蛋白质的分离和鉴定,着重于定性定量解析细胞蛋白质的动态变化信息,更真实地反映了细胞功能、过程机制等综合信息。以同位素为内标的质谱分析新技术的提出,显示出可同时自动鉴定和精确定量的能力,代表了目前定量蛋白质组研究的主要发展方向。对近年来定量蛋白质组学同位素标记技术和应用研究所取得的重要进展以及最新的发展动态进行了综述。

基于稳定同位素标记的蛋白质组学定量方法研究进展

定量蛋白质组学已经成为后基因时代的重要研究方向之一。目前该领域的研究主要采用无标记定量方法和稳定同位素标记定量法。其中,基于稳定同位素标记的蛋白质组定量方法发展非常迅速,已为生命科学研究提供了重要的技术支撑。本文分析了基于稳定同位素标记的蛋白质组学定量方法,包括相对定量方法和绝对定量方法,并对其发展进行了展望。

^18O稳定同位素标记定量蛋白质组研究技术的建立与优化

建立了^18O稳定同位素标记方法，用于复杂体系蛋白质相对定量分析。对影响蛋白质标记稳定性的实验条件进行了比较和优化。结果表明，采用酶切后标记的方法，酶切肽段在胰酶催化下，在pH5．0的kHPO4／KH2PO4缓冲体系中，37℃^18O标记反应16h，绝大部分肽段即可达到100％的标记效率。对多个^16O／^18O成对肽段蜂强度的动态范围及定量准确度进行了考察。

细胞培养稳定同位素标记技术与肿瘤标志分子研究

以质谱为基础的定量蛋白质组学分析技术的发展,大大加快了肿瘤标志分子的研究进程。细胞培养稳定同位素标记技术,已成为目前定量蛋白质组学的主要策略之一,它将不同来源或不同状态的细胞分别培养于含轻/重型稳定同位素标记必需氨基酸的培养基中,经过若干次细胞倍增后,稳定同位素按照序列特异的方式,完全掺入到新合成的蛋白质中。通过比较标记前后同一肽段的质谱峰值变化,可以实现对蛋白质的精确定量。它具有样本需求量少、简单、直接、高效及定量准确等特点,不仅可以定性和定量地分析差异表达蛋白质,而且可以分析蛋白质翻译后修饰和蛋白质相互作用,已逐渐成为研究差异蛋白质组的重要工具之一,在肿瘤分子标志研究中发挥重要作用。

同位素标签技术在人肾小管上皮细胞蛋白质组学研究中的应用

目的建立并优化人肾小管上皮细胞蛋白质组学分析所需的相对和绝对定量的同位素标签试剂(iTRAQ)标记技术,为进一步研究奠定基础。方法将人肾小管上皮细胞株HK-2通过细胞裂解、丙酮沉淀、蛋白变性、还原及酶解,最后进行iTRAQ标记和质谱鉴定,研究iTRAQ在HK-2细胞的标记情况和蛋白质组学。结果通过质谱检测,检测到带有iTRAQ标记肽段。随机选取20个前体离子,通过3次重复试验,鉴定出iTRAQ标记多肽肽段分别为17、15和18个,标记效率在75.5%～90.0%,且组间标记效率差异无统计学意义(P>0.05)。结论iTRAQ可以在HK-2细胞中标记效果满意,且重复性较好,为进一步研究肾脏疾病的蛋白质组学奠定了基础。