稳定同位素标记氨基酸细胞培养联合质谱绝对定量技术在5、7、55型腺病毒鉴定中的应用

利用稳定同位素标记肽段的质谱绝对定量(AQUA)技术,实现了对5、7和55型人腺病毒的准确鉴定。采用细胞培养条件下稳定同位素代谢标记(SILAC)技术培养细胞至大肠杆菌生长至对数生长期,1 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)低温诱导蛋白表达,提取并利用谷胱甘肽S转移酶(GST)纯化富集相应标记的腺病毒六邻体蛋白。通过胶消化分别消化三种不同标记策略(非标记、中度标记和重度标记)的纯化蛋白,消化肽段等量混合脱盐后经纳流液相色谱-串联质谱(Nano HPLC-MS/MS)进行定量蛋白分析。通过SILAC实现大肠杆菌的完整代谢标记,诱导表达腺病毒六邻体蛋白,通过AQUA技术实现对非标记、中度标记、重度标记六邻体蛋白标志性肽段鉴定。成功实现SILAC三种不同标记策略条件下大肠杆菌中5、7、55型人腺病毒六邻体蛋白的完整标记,为5、7、55型人腺病毒感染的快速分型检测提供了新的鉴定策略。

稳定同位素iTRAQ标记/高效液相色谱-串联质谱法同时定量分析人体中42种氨基酸及典型病例

建立稳定同位素iTRAQ标记/高效液相色谱-串联质谱法同时定量分析人体中42种氨基酸的方法。人生物样本经磺基水杨酸沉淀蛋白,稳定同位素iTRAQ-115衍生化后,加入iTRAQ-114同位素标记的氨基酸内标液进样,选用AAA-C18色谱柱,以水-乙腈(含有0.01%七氟丁酸、0.1%甲酸)为流动相,采用梯度洗脱进行分离,选用3200QTRAP型质谱仪的多重反应监测(MRM)扫描方式进行检测。同位素内标消除了系统误差,实现了氨基酸的定量分析,42种氨基酸及同分异构体均能基线分离。本方法快速、灵敏、专属性强、高通量,可用于临床氨基酸代谢疾病的诊疗和营养评估。

氨基酸分析-同位素稀释质谱法准确定量胱抑素C重组蛋白

目的:建立同位素稀释液相色谱串联质谱法进行氨基酸分析,准确定量人重组蛋白胱抑素C(Cys C)。方法:优化Cys C蛋白酸水解条件,将Cys C蛋白水解成氨基酸,以水解产物缬氨酸(Val)和苯丙氨酸(Phe)为研究对象,13C5-Val和13C9,15N-Phe为内标,根据括号法分别计算水解产物Val和Phe浓度,从而准确定量Cys C蛋白。结果:Cys C蛋白在130℃,6 mol/L HCl溶液中水解4 h可完全水解。以水解产物Val和Phe分别计算Cys C浓度为1.324 mg/g和1.328 mg/g,一致性较好,检测结果变异系数均小于7%(n=5),取二者平均值得到重组Cys C蛋白浓度为1.326 mg/g。结论:成功建立同位素稀释质谱法准确定量重组蛋白Cys C的氨基酸分析方法,有望为临床实验室蛋白质检测的溯源提供思路。

同位素标记相对和绝对定量技术在药物蛋白质组学研究中的应用

目的建立应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术进行药物蛋白质组学研究的技术平台。方法分别测定12例高血压患者在给予降压药氨氯地平治疗前和治疗后8周的收缩压和舒张压,并同时收集患者在降压药治疗前和治疗后8周的血清,应用蛋白质组学iTRAQ技术对治疗前后的血清蛋白质组进行定量分析。结果高血压患者口服降压药苯磺酸氨氯地平片8周后平均收缩压和舒张压均明显降低(P<0.01)。经iTRAQ和ProteinPilot软件分析,共鉴定出232个差异蛋白质,其中降压药物治疗后表达上调和下调超过1.5倍的蛋白质分别有12种和13种。上调的蛋白质主要参与应激、防御和免疫反应,而下调的蛋白质主要参与应激、防御、炎症和凝血反应。本研究结果提示,降压药氨氯地平治疗可以双向调节机体的应激和防御反应,可以增强机体的免疫力,抑制炎症反应和改善高血凝状态,从而有利于血压的降低。结论应用iTRAQ技术进行药物蛋白质组学研究可筛选获得多种与药物疗效相关的差异蛋白质,为药物作用靶点和分子机制等方面的研究提供了一个良好的技术平台。

利用同位素标记相对和绝对定量技术筛查神经管畸形胚胎孕鼠血清差异蛋白质谱

目的筛查神经管畸形相关血清标记物,为阐明神经管畸形的发病机制提供理论依据。方法应用维甲酸在大鼠神经管闭合的关键期(孕10 d,E10)给药,建立脊柱裂大鼠模型,选取致畸早期孕11、13 d (E11、E13)显性脊柱裂胚胎孕鼠和正常胚胎孕鼠血清各5例,应用同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)和液相色谱质谱鉴定技术分析2组蛋白质,定量信息以蛋白的丰度比差异倍数1.5倍以上(P <0.05)为差异蛋白质。结果质谱共得到谱图157 422张,鉴定出390种蛋白质,发现E11维甲酸致畸组与正常对照组差异蛋白40种,E13维甲酸致畸组与正常对照组差异蛋白26种。结论筛选出致畸早期大量神经管畸形和正常孕鼠血清差异蛋白,差异蛋白通过直接或间接相互作用,促进或抑制神经管畸形的发生与发展。

同位素标记定量技术评估肾病综合征尿液蛋白质谱变化的初步探讨

目的旨在通过同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)技术分析原发性肾病综合征(PNS)患者尿液差异表达蛋白,寻找高特异性、无创性评估PNS的病理损害标记蛋白,并结合相应蛋白功能探讨其在PNS发病机制及疾病进展中的作用。方法 9例PNS患者肾穿刺当日和3例健康人的晨尿标本经毛细管高效液相色谱仪分离后,Q-Exactive质谱仪进行质谱分析,Maxquant 1.4.1.2和persus 1.4.1.3软件进行查库鉴定、定量和数据分析。结果成功得到PNS尿液蛋白SDS-PAGE电泳图谱,并得到724个蛋白质组,其中≥2的唯一肽段308个,定量、查库鉴定和数据分析最终得到差异蛋白表达明显的19个。其中与3例健康对照患者差异表达的蛋白3个,包括抗胰蛋白酶(AAT)、抗胰凝乳蛋白酶(AACT)和微管蛋白酪氨酸连接酶类似物7。结论 i TRAQ技术评估PNS尿液蛋白质组变化具有现实可行性,可以用于更深入的研究。

同位素标记相对和绝对定量评价非创伤性股骨头坏死患者的血清蛋白组学分析

背景:非创伤性股骨头坏死是一类以髋关节疼痛、功能障碍进行性加重为主要症状的疾病,严重危害人体健康。它的发病机制、早期诊断和治疗仍是临床骨科医生所面临的重大挑战。目的:采用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术,用蛋白质组学筛选可能与非创伤性股骨头坏死相关的关键蛋白。通过分析这些蛋白的表达特性及潜在的生物学功能,为进一步研究非创伤性股骨头坏死病因及分子机制奠定基础。方法:提取非创伤性股骨头坏死患者和健康人血清蛋白,应用iTRAQ技术标记蛋白,联合液相色谱和串联质谱分离和分析肽段。采用Proteome Discoverer 2.1软件对两组人群蛋白进行鉴定和定量分析,获得差异蛋白,再对这些表达差异蛋白进行GO注释、KEGG通路注释和功能富集聚类分析。结果与结论:①质谱鉴定共得到1006个蛋白,通过分析得到137个差异表达蛋白,其中54个蛋白表达上调,83个蛋白表达下调;②与非创伤性股骨头坏死发生相关的表达差异显著的蛋白质包括载脂蛋白B(ApoB)、载脂蛋白A2(ApoA2)、载脂蛋白E(ApoE)、补体C4和C7等;③KEGG信号通路富集分析结果显示,关键靶点的主要信号通路为p53信号通路、转录生长因子β信号通路、扩张型心肌病信号通路;④该结果提示,载脂蛋白与非创伤性股骨头坏死发生密切相关,并发现了与非创伤性股骨头坏死相关的活跃信号通路,为非创伤性股骨头坏死发生及分子机制奠定一定的实验基础。

同位素稀释质谱法测定土壤中氨基酸的含量

建立了同位素稀释质谱法测定土壤中缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸共4种氨基酸含量的检测方法。通过在样品中加入同位素内标试剂——稳定同位素15N标记的氨基酸,经酸解、固相萃取等前处理手段对目标氨基酸进行提取、富集以及衍生化后,利用GC-MS/MS多反应监测(MRM)模式进行定量分析。结果表明,在线性范围内,4种氨基酸的线性相关系数(R2)均大于0.999,加标回收率为92.2%~108%,方法检出限(LOD)为1.4~2.9μg/kg,定量限(LOQ)为5.2~8.8μg/kg。方法高效、重现性好,可用于土壤中氨基酸的定量检测。

基于同位素相对标记与绝对定量技术结合质谱技术的幼年特发性关节炎血清蛋白质组学研究

目的应用同位素相对标记与绝对定量技术(iTRAQ)分析幼年特发性关节炎(JIA)患者与健康人群的血清差异蛋白。方法收集JIA患者血清18例、健康体检者20例、类风湿关节炎(RA)患者44例,采用iTRAQ标记联合纳升液相色谱-串联质谱筛选JIA患者的差异蛋白,并进行生物信息学分析。结果相对于健康体检组,JIA组共鉴定差异蛋白106个,其中49个表达上调,57个表达下调;JIA组和RA组中有26个差异蛋白均表达上调,37个表达下调。通过GO富集分析和KEGG通路分析,结果表明血液凝溶系统、免疫系统、脂质代谢与JIA的发病机制密切相关。通过STRING分析得到研究JIA机制的PPI网络的关键节点AHSG、APOH、脂联素等多个候选蛋白。结论本研究分析了JIA患者的血清蛋白质组,为JIA的诊断、JIA发病机制的探讨提供了实验依据。

定量蛋白质组同位素标记技术及应用

定量蛋白质组学是对蛋白质组进行精确的定量和鉴定的学科,突破了传统蛋白质组研究集中于对蛋白质的分离和鉴定,着重于定性定量解析细胞蛋白质的动态变化信息,更真实地反映了细胞功能、过程机制等综合信息。以同位素为内标的质谱分析新技术的提出,显示出可同时自动鉴定和精确定量的能力,代表了目前定量蛋白质组研究的主要发展方向。对近年来定量蛋白质组学同位素标记技术和应用研究所取得的重要进展以及最新的发展动态进行了综述。

超高效液相色谱-同位素稀释质谱法定量分析芥子气染毒血浆中5种氨基酸加合物

利用合成的芥子气-氨基酸加合物及其同位素标记化合物,基于超高效液相色谱-同位素稀释串联质谱技术,建立了芥子气染毒人血浆中5种氨基酸加合物的绝对定量分析方法。5种氨基酸加合物在0.100~100 ng/mL范围内线性良好,相关系数R2>0.995,检出限分别为0.0200 ng/mL([N1-HETE]-His和[N3-HETE]-His)和0.0500 ng/mL(HETE-Lys,HETE-Asp和HETE-Glu)。应用该定量方法研究了芥子气在人血浆蛋白上不同加合位点的反应趋势。本文所建立的氨基酸加合物绝对定量方法,不仅提供了一种芥子气中毒快速溯源方法,还为芥子气暴露人员的临床诊断救治及代谢机理研究等提供了重要的手段。

饲料中氨基酸分析技术研究进展

根据检测方法原理的不同,本文通过对现有化学分析法、光谱分析法、色谱分析法以及其他氨基酸分析方法的归纳、梳理和比较,较全面地介绍了饲料中氨基酸分析技术的研究进展,为合理选择适合的检测方法提供参考。

高效液相色谱-在线衍生联用技术检测食品中氨基酸

目的:建立应用在线衍生技术和双检测器联用测定食品中氨基酸的高效液相色谱方法.方法:使用高效液相色谱仪带全自动衍生功能的自动进样器进行在线衍生,经梯度分离,再利用二极管阵列-荧光检测器串联分析.结果:17种氨基酸分离良好,线性范围为 10～1 000 pmol/μl.结论:本方法测定重复性好,灵敏度高,定性定量准确,结果令人满意.

细胞培养稳定同位素标记技术与肿瘤标志分子研究

以质谱为基础的定量蛋白质组学分析技术的发展,大大加快了肿瘤标志分子的研究进程。细胞培养稳定同位素标记技术,已成为目前定量蛋白质组学的主要策略之一,它将不同来源或不同状态的细胞分别培养于含轻/重型稳定同位素标记必需氨基酸的培养基中,经过若干次细胞倍增后,稳定同位素按照序列特异的方式,完全掺入到新合成的蛋白质中。通过比较标记前后同一肽段的质谱峰值变化,可以实现对蛋白质的精确定量。它具有样本需求量少、简单、直接、高效及定量准确等特点,不仅可以定性和定量地分析差异表达蛋白质,而且可以分析蛋白质翻译后修饰和蛋白质相互作用,已逐渐成为研究差异蛋白质组的重要工具之一,在肿瘤分子标志研究中发挥重要作用。

出口梗阻型便秘病人的差异表达蛋白及其生物学功能-基于同位素标记相对和绝对定量的蛋白质组学研究

目的分析出口梗阻型便秘(ODS)病人病变直肠组织的差异表达蛋白及其生物学功能。方法纳入ODS病人20例、混合痔脱垂病人(无便秘症状)10例,所有病人均行经肛门吻合器直肠切除术并收集手术切除直肠标本。利用同位素标记相对和绝对定量技术筛选ODS病人与混合痔脱垂病人之间的差异表达蛋白谱,并对所有的差异表达蛋白进行基因本体论(GO)分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析和信号肽(SignalP)分析。结果ODS病人与混合痔脱垂病人之间差异表达蛋白共164个(表达上调88个,表达下调76个),涉及的生物过程主要包括细胞过程、生物调节、代谢过程等,涉及的细胞组成主要包括生化过程、细胞结构等,涉及的分子功能主要包括结合位点、催化活性、分子功能调节等。涉及的信号通路主要包括神经退化疾病、内分泌与代谢疾病及免疫疾病等。结论ODS病人与非便秘病人直肠组织蛋白存在差异,差异表达蛋白所参与的生物学过程及涉及的信号通路可能参与ODS发病机制。

基于转录组和同位素标记相对与绝对定量技术的宽体金线蛭生品和烫制品差异蛋白研究

目的:通过转录组和蛋白质组技术研究宽体金线蛭生品和炮制品的差异蛋白。方法:以活体宽体金线蛭(Whitmania pigra Whitman)为原料,基于无参转录组进行基因分析,利用转录组信息匹配到Helobdella robusta蛋白质库,然后利用同位素标记相对与绝对定量技术(iTRAQ)蛋白组学技术进行宽体金线蛭的蛋白成分分析,筛选出存在于宽体金线蛭生品及炮制品中的差异蛋白质,并对其进行基因本体(GO)功能聚类分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析以及蛋白质相互作用网络分析(PPI),并结合BIOPEP数据库筛选可能具有抗凝活性的蛋白。结果:本研究筛选到差异表达蛋白共112种,其中78种上调蛋白、34种下调蛋白,并推定出6条可能具有抗凝作用的差异蛋白。GO功能聚类分析结果表明,在细胞过程(cellular process)、代谢过程(metabolic process)条目富集的差异蛋白数量最多。在差异性方面,大分子复合物(macromolecular complex)、结构分子活性(structural molecule activity)条目差异最显著。KEGG富集分析结果表明,差异蛋白在代谢途径(metabolic pathways)富集到的蛋白最多,ECM-受体相互作用(ECM-receptor interaction)、核糖体(ribosome)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)差异最显著。结论:本研究结合转录组、蛋白组数据,补充了宽体金线蛭的蛋白质库,筛选出了生品及烫制品的差异蛋白并推定了可能具有抗凝作用的差异蛋白,为宽体金线蛭基因组成、物质基础研究及炮制机制提供参考依据。

基于iTRAQ技术对低级别胶质瘤与正常脑组织差异性表达蛋白的初步筛选研究

目的应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术筛选低级别胶质瘤与正常脑组织的差异表达蛋白质。方法将6例低级别胶质瘤实体组织标本与2例正常脑组织标本各自混合后提取总蛋白,进行定量分析和酶解。iTRAQ标记后进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析。通过Mascot2.9软件进行相关图谱分析。结果有效鉴定出低级别胶质瘤与正常脑组织差异表达蛋白质162个,其中34个上调蛋白质,128个下调蛋白质,这些差异表达蛋白质具有多种生物学活性,参与不同的代谢以及信号通路。结论通过iTRAQ技术可有效鉴定出众多低级别胶质瘤与正常脑组织的差异表达蛋白质,为后续寻找低级别胶质瘤的生物标记物奠定基础。

高效液相色谱-串联质谱法测定人体内30种氨基酸

建立了以12种同位素标记氨基酸做内标,采用衍生化方法,LC-MS/MS采用MRM方式同时定量30种氨基酸的检测方法。生物样本加入含有同位素内标的甲醇溶液,沉淀蛋白后氮气吹干加入衍生试剂,样本氨基酸与同位素氨基酸内标同步衍生,减小实验误差。选用TC-C18色谱柱,以水-乙腈(均含有0.01%七氟丁酸和0.1%甲酸)为流动相,采用梯度洗脱进行分离,30种氨基酸及其中的同分异构体都能基线分离。选用3200QTRAP型质谱仪的多重反应监测(MRM)扫描方式进行检测。本方法用于实时监测恶性血液病患者血浆氨基酸谱的变化,可以直接反映机体的代谢及营养状况,对患者的移植成功率及改善移植后患者的生存质量均有重要意义。

同位素稀释的气相色谱/高分辨质谱联用测定食品中二噁英和共平面多氯联苯

采用HRGC／HRMS和同位素稀释定量技术对样品中17种4～8个氯原子取代的二嗯英和呋喃(PCDDs／Fs)与12种共平面多氯联苯(PCBs)定量分析。样品经索式抽提、FMS Power Prep系统净化、浓缩，利用高分辨气相色谱／高分辨质谱联用仪的多离子检测方式，同位素稀释技术对样品中的目标化合物进行定性和定量。该方法的检出限为pg／g水平。^13同位素内标回收率范围为47％～100％。对3个CRM鱼样中17个PCDDs／Fs和4个PCBs的检测值均在标准定值允许误差范围内。对5个不同的实际样品鱼进行测定表明，样品的回收率在48％～100％之间，回收率的相对标准偏差小于20％；对同一样品进行定量检测的精密度测试结果表明，17种PCDDs／Fs浓度的RSD低于16％，12种PCBs浓度的RSD低于11％。本方法定量分析重现性良好。