番茄、拟南芥和葡萄中同型半胱氨酸S-甲基转移酶基因家族功能研究

同型半胱氨酸S-甲基转移酶(homocysteine S-methyltransferase,HMT)普遍存在于被子植物中,在植物合成甲硫氨酸过程中起着重要作用,其在拟南芥中的功能已有所研究,但该家族在其他植物中的功能尚不清楚。本文通过同源比对,获取番茄、拟南芥和葡萄中共8个HMT家族基因的信息,通过系统进化树分析,发现8个HMT蛋白形成2个分支;利用蛋白motif分析、蛋白结构域分析、基因外显子内含子结构分析,发现HMT蛋白在进化上较为保守。通过对拟南芥在非生物胁迫条件下HMT家族基因的表达水平进行分析,发现多个AtHMT基因对非生物胁迫尤其是冷胁迫、盐胁迫、干旱胁迫产生应答,表明HMT家族基因在非生物胁迫应答中的调控作用。另外,通过对番茄各组织在发育的各个阶段中HMT基因进行表达量分析,发现HMT基因可能在番茄种子发育、开花、果实成熟方面发挥作用。综上,本文对番茄、拟南芥和葡萄中HMT基因家族的生物信息学分析及基因表达数据进行了挖掘,对深入研究HMT基因在番茄、拟南芥和葡萄中的作用具有重要意义。

METTL3在同型半胱氨酸诱导小鼠胰岛β细胞自噬中的作用

背景:高同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)血症与胰岛β细胞功能密切相关,但其具体分子机制尚不完全明确。目的:探讨METTL3在Hcy诱导小鼠胰岛β细胞自噬中的作用。方法:取第3,4代小鼠胰岛β细胞进行实验。①细胞模型建立和分组:对照组细胞不加入Hcy,Hcy组细胞加入浓度为100µmol/L Hcy干预48h;②按Lipofectamine^(TM) 2000说明书将过表达质粒Ad-METTL3及si-METTL3转染小鼠胰岛β细胞,设计3种不同干扰片段,PCR验证、筛选出干扰效率最好的干扰片段;③转染后实验分组:对照组、Hcy组、Ad-NC(阴性对照)+Hcy组、Ad-METTL3+Hcy组、si-NC(阴性对照)+Hcy组和si-METTL3+Hcy组;④采用qRT-PCR及Western blot检测细胞中METTL3及细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、p62的表达;ELISA法测定胰岛素水平来评价胰岛β细胞胰岛素分泌能力;分别过表达和干扰METTL3后检测细胞自噬相关蛋白及胰岛素水平。结果与结论:①与对照组相比,Hcy组自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ的表达水平升高(P<0.05),而p62表达明显降低(P<0.05),胰岛素分泌能力明显下降(P<0.05);②与对照组相比,Hcy组中METTL3蛋白及mRNA水平表达均降低(P<0.05);③胰岛β细胞中沉默METTL3后,Hcy进一步上调了细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ的表达(P<0.05),而p62表达显著下降(P<0.05),细胞中胰岛素水平增加(P<0.05);过表达METTL3后,Hcy则使LC3Ⅱ/Ⅰ表达显著降低且p62表达则增高(P<0.05);④结论:METTL3参与了Hcy诱导的胰岛β细胞自噬调控,对胰岛素的分泌发挥着调控作用。

S-同型半胱氨酸甲基转移酶活性检测和保存方法的建立

目的建立一种简单的S-同型半胱氨酸甲基转移酶(HMT)活性测定方法,确定HMT的最佳使用条件,并初步探索HMT的保存方法。方法采用原核表达系统制备HMT,经镍亲和层析和Sephadex G15两步纯化。SDS-PAGE对目的蛋白进行理化性质鉴定。基于5,5′-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)可以特异性地与含有巯基的化合物快速发生化学反应的原理,通过检测同型半胱氨酸的减少量来计算酶活性,确定HMT最佳活性测定条件。比较添加和不添加甘油的两组HMT酶液置于不同温度下保存,定期测定活力;在HMT酶液中加入不同浓度的不同保护剂,比较冷冻干燥后的活性保留率。结果重组表达的酶纯度高达95%以上,相对分子质量为36 000,具有良好的催化活性,比活为2 000U/mg。在37℃、pH7.4的HEPES缓冲液中反应25min为酶活性测定最佳条件。加入甘油能明显延长酶的保存时间并且酶液在6个月内的活力保留一半。冷冻保护剂甘露醇和海藻糖的添加对HMT酶冻干品的酶活保留率分别为104.0%和100.0%。结论通过基因工程技术获得HMT,建立了简单的HMT活性测定方法,并确定了该酶的最佳保存方法,为临床应用奠定了基础。

亚甲基四氢叶酸还原酶基因及甲硫氨酸合成酶基因多态性与口服叶酸治疗高同型半胱氨酸血症疗效的关系研究

目的分析亚甲基四氢叶酸还原酶基因(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶基因(MTR)多态性与口服叶酸治疗高同型半胱氨酸血症(HHcy)疗效的关系及基因与环境在治疗效果中的交互作用。方法选取2014年6—9月于郑州大学第五附属医院神经内科检查血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平的住院HHcy患者515例为研究对象。常规治疗基础上给予口服叶酸(5 mg/d)治疗90 d。治疗中期(叶酸补充45 d)行第1次电话随访,治疗结束(叶酸补充90 d)行第2次电话随访,督促患者遵循医嘱服药,并在治疗结束后到医院复查血浆Hcy水平。按照复查血浆Hcy水平将患者分为失败组(Hcy≥15.0μmol/L)和成功组(Hcy<15.0μmol/L)。收集患者的基线资料,选取MTHFR上2个单核苷酸多态性(SNP)位点和MTR上1个SNP位点,分别为:rs1801133、rs1801131和rs1805087;采用Sequenom公司的时间飞行质谱生物芯片系统(Mass Array系统)检测基因分型和等位基因,采用多因素降维法(MDR)分析基因-环境交互作用。结果随访结束后,剔除服药依从性差或者失访患者131例,剔除两次服药依从性均一般的患者125例,剩余259例。其中失败组115例,成功组144例。失败组患者糖尿病病史发生率、高血压病史发生率、冠心病病史发生率、基线血浆Hcy水平均高于成功组(P<0.05)。成功组3个SNP位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(rs1801133:χ2=0.11,P=0.170;rs1801131:χ2=0.00,P=1.000;rs1805087:χ2=0.01,P=0.860)。单因素非条件Logistic回归分析结果显示,rs1801133位点的TT基因型、T等位基因,rs1801131位点的AC基因型、AC+CC基因型、C等位基因与叶酸治疗HHcy疗效有回归关系(P<0.05)。MDR软件结果显示,最优模型为高血压病史、冠心病病史和rs1801133的三因素交互模型(P<0.05)。结论 MTHFR rs1801133位点的TT基因型和等位基因T可增加叶酸治疗HHcy失败的风险;rs1801131位点的AC基因型、AC+CC基因型和等位基因C可降低叶酸治疗HHcy失败的风险。MTR rs1805087位点基因型及等位基因与叶酸治疗HHcy疗效无回归关系。高血压病史、冠心病病史、rs1801133位点对叶酸治疗HHcy的疗效具有交互作用。

一种S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲基转移酶活性的检测方法

通过PCR扩增获得了S-腺苷-L-高半胱氨酸核苷酶(SAHN)和S-核糖基高半胱氨酸酶(SRHH)的基因序列,克隆入表达载体,转化宿主细胞,表达纯化得到带有组氨酸标签的重组蛋白,基于SAHN和SRHH重组酶建立了一种酶偶联分析S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)依赖的甲基转移酶活性的检测方法.甲基转移酶的共同产物S-腺苷-L-高半胱氨酸(AdoHcy)首先被SAHN酶水解生成腺嘌呤和S-核苷高半胱氨酸,后者进一步被SRHH酶裂解生成高半胱氨酸,最后高半胱氨酸与Ellman’s试剂反应生成5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB).实验结果表明,重组表达获取的2种酶蛋白均具有良好的催化活性,酶偶联反应生成的TNB与初始AdoHcy浓度呈现显著的线性正相关.该检测方法克服了S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲基转移酶的共同产物AdoHcy的反馈抑制,使甲基化反应进行完全,从而保证了对甲基转移酶活性准确有效的定量分析.

高同型半胱氨酸和高胆固醇血症联合作用对大鼠基因组DNA总甲基化状态的影响

目的:探讨高同型半胱氨酸血症(HHCY)和高胆固醇血症(HTC)联合作用对大鼠主动脉基因组DNA总甲基转移酶活力(DNMT)及总甲基化水平的影响。方法:44只健康清洁级成年Wistar雄性大鼠按2×2析因设计随机分为阴性对照组、高同型半胱氨酸(HCY)组、高总胆固醇(TC)组、高HCY+高TC组,每组11只。对照组给予普通大鼠饲料,其余各组给予相应的配方饲料。喂养3个月后心脏取血检测血清中HCY、TC等相关指标。提取主动脉基因组DNA检测基因组DNA总甲基化水平;提取主动脉核蛋白检测基因组DNA总甲基转移酶活力。结果:HHCY和HTC联合作用大鼠血清HCY较高,产生相互作用(P<0.01),表现为协同作用,而对大鼠血清TC、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)无交互作用。HHCY和HTC联合作用主动脉基因组DNA总甲基转移酶活力较高,产生相互作用(P<0.01),表现为协同作用,总基因组DNA甲基化水平降低,即去甲基化程度的增加,产生相互作用(P<0.01),表现为协同作用。结论:HHCY和HTC联合作用使得大鼠主动脉基因组DNA总DNMT活力增高,基因组DNA总甲基化水平降低,可能是AS发生发展的重要机制之一。

BHMT对同型半胱氨酸诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤的保护作用

目的:观察甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)在同型半胱氨酸(Hcy)环境下对人晶状体上皮细胞(HLEC)的保护作用。方法:构建BHMT基因过表达慢病毒载体,将体外培养的HLEC随机分为3组:正常组:正常培养的HLEC;对照组:感染了空载体的HLEC-B3,BHMT过表达组(OE):感染了过表达BHMT基因载体的HLEC-B3,均培养于10%FBS(胎牛血清)培养基+5mmol/L Hcy培养液中。应用EdU(5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷)试剂盒检测细胞的增殖能力,流式细胞仪检测活性氧(ROS)含量,可见分光光度计测算谷胱甘肽(GSH)活性,Western blotting检测内质网应激相关蛋白(GPR78,Nrf2)及凋亡相关酶Caspase-12的表达。结果:BHMT过表达组较对照组细胞增殖能力增长约30.0%(P<0.05)。ROS检测显示,正常组、对照组、过表达组荧光强度分别为(89.2043±0.3511)%、(91.4502±0.0606)%、(49.5625±0.4502)%,过表达组与正常组有差异(P<0.05);GSH活性检测显示:相比于正常组与对照组,BHMT高表达组GSH活性明显上升(P<0.05);Western blotting结果显示:GRP78的相对表达量在正常组及对照组中明显高于过表达组,Nrf2的相对表达量在正常组与对照组中明显低于过表达组。凋亡相关酶Caspase-12的相对表达量在过表达组中明显低于对照组。结论:BHMT可以抑制Hcy对HLEC的氧化损伤作用,降低ROS水平,升高GSH活性,减轻内质网应激反应,抑制细胞凋亡。BHMT对Hcy诱导的HLEC氧化损伤有重要的保护作用。

重组BHMT对高同型半胱氨酸血症大鼠的影响

目的探讨重组BHMT对大鼠HHcy血症的防治作用。方法用含2%蛋氨酸(methionine,Met)饲料诱发HHcy的大鼠,经尾静脉注射BHMT后,观察模型大鼠血浆中同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)浓度、LDH酶活性及HDL/LDL的影响。结果重组BHMT能将HHcy组大鼠血浆中Hcy浓度(23.70±6.75)μmol/L显著降低为(14.61±2.80)μmol/L(P<0.05),LDH酶活性由(209.57±10.22)U/L降低为(225.04±30.47)U/L(P<0.05),对脂蛋白HDL/LDL基本没有影响。结论重组BHMT对高同型半胱氨酸血症有一定的治疗作用。

同型半胱氨酸与动脉粥样硬化性脑血管病关系的研究进展

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一种含硫氨基酸，在体内不能合成，由蛋氨酸去甲基化生成S-腺苷同型半胱氨酸水解后生成。Hcy主要有三种代谢途径：①再甲基化途径：以5-甲基四氢叶酸作为甲基供体，维生素B12为辅酶，在5-甲基四氢叶酸-同型半胱氨酸甲基转移酶的催化下生成蛋氨酸。而5-甲基四氢叶酸是在亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）催化下还原而来。②转硫基途径：由胱硫醚β合成酶（CBS）催化、维生素氏为辅酶，有50％的Hcy和丝氨酸合成胱硫醚。③释放到细胞外液。

三七多糖对2型糖尿病大鼠高同型半胱氨酸信号通路的影响

目的:探讨三七多糖对2型糖尿病大鼠肝脏高同型半胱氨酸代谢信号通路3个关键分子亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、胱硫醚β-合酶(CBS)、5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶(MTR)表达的影响。方法:将60只雄性SD大鼠随机分为空白组、模型组以及三七多糖治疗组,每组20只,模型组以及三七多糖治疗组给予高脂高糖饮食6个月建立2型糖尿病模型,模型建立成功后三七多糖治疗组给予三七多糖57 mg/(kg·d)灌胃治疗,模型组给予同体积生理盐水灌胃,分别在治疗4周和8周后处死大鼠各半,收集血清和肝脏进行相关指标的检测。结果:治疗4周后大鼠血糖以及胰岛素抵抗指数三七多糖治疗组较模型组降低(P<0.05),8周后进一步降低,胰岛素水平治疗4周后三七多糖治疗组较模型组降低(P<0.05),8周后较4周无进一步改善;三七多糖治疗后,大鼠叶酸较模型组有一定升高,但差异无统计学意义(P>0.05),维生素B12在治疗4周后较模型组明显升高(P<0.05),治疗8周后进一步升高;同型半胱氨酸在治疗4周后明显降低(P<0.05),但在8周后无进一步改善;治疗4周后,与模型对照组比较,三七多糖治疗组MTHFR、MTR以及CBSm RNA及蛋白表达升高(P<0.05),治疗8周后进一步升高,但未达到空白组水平。结论:三七多糖可显著降低模型大鼠血清中同型半胱氨酸含量,其可能是通过调控高同型半胱氨酸信号通路相关蛋白MTHFR、CBS、MTR的表达来实现。

大鼠蛋白精氨酸甲基转移酶1短发夹RNA质粒体外RNA干扰及对Hcy、ADMA的影响

目的探讨蛋白精氨酸甲基转移酶1短发夹RNA质粒(pPRMT1-shRNA)在体外对大鼠主动脉内皮细胞PRMT1基因mRNA表达水平及同型半胱氨酸(Hcy)、非对称性二甲基精氨酸(ADMA)水平的影响。方法用pPRMT1-shRNA1、pPRMT1-shR-NA2阳性质粒、阴性对照pHK质粒转染大鼠主动脉内皮细胞,同时设立空白对照组。转染12h、24h后分别收集各组细胞及细胞培养液,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析各组PRMT1基因的mRNA表达情况,ELISA法检测各组细胞培养液中Hcy及AD-MA含量。结果空白对照组与阴性对照质粒组的PRMT1基因mRNA表达、Hcy、ADMA水平差异无统计学意义;PRMT1-shRNA两组与空白对照组、阴性对照质粒组比较PRMT1基因mRNA表达明显降低(P<0.01),且Hcy、ADMA水平明显下降(P<0.01);pPRMT1-shRNA1组比pPRMT1-shRNA2转染组、两组2 4h比1 2hPRMT1基因mRNA表达受抑更显著(P<0.05),Hcy、ADMA水平下降更明显(P<0.05)。结论随着PRMT1基因表达水平下降,Hcy、ADMA水平也随之降低。

不同方法测定同型半胱氨酸结果比较分析

目的探讨目前临床化学实验室测定同型半胱氨酸(Hcy)主要方法学的差异。方法选取2011年1月至今,重庆市西郊医院住院患者中存在心血管疾病家族史的病例35例,冠状动脉狭窄病例43例,慢性肾脏功能障碍病例55例,肝功能损伤病例68例,健康体检人群169例,分别采用甲基转移酶方法试剂与胱硫醚方法测定试剂进行Hcy测定,并且采用成对t检验比较结果。结果采用甲基转移酶循环法与胱硫醚循环法进行Hcy测定,心血管疾病家族史组Hcy水平分别为(19.3±5.3)μmol/L与(18.6±6.4)μmol/L;冠状动脉狭窄组Hcy水平分别为(23.5±4.5)μmol/L与(24.7±5.1)μmol/L;慢性肾脏功能障碍组Hcy水平分别为(5.3±2.4)μmol/L与(5.7±3.1)μmol/L;肝功能损伤组Hcy水平分别为(6.7±3.7)μmol/L与(6.5±4.1)μmol/L;健康体检组Hcy水平分别为(4.3±2.5)μmol/L与(4.8±3.0)μmol/L。结论不同方法测定Hcy水平并无明显差异,但血清中的特殊成分会对测定结果造成不同程度的影响。

不同临床诊断中血清同型半胱氨酸方法学比较

目的探讨不同临床诊断测定同型半胱氨酸(Hcy)不同方法学的结果差异。方法选取2009年5月至2011年5月,略阳县人民医院心血管疾病住院患者中存在心血管疾病家族史的病例20例,冠状动脉狭窄15例,慢性肾脏功能障碍病例43例,肝功能损伤病例32例,健康体检人群200例,分别利用甲基转移酶方法试剂与胱硫醚方法测定试剂进行测定Hcy,利用成对t检验比较结果。结果心血管疾病家族史组Hcy水平分别为(16.3±4.1)μmol/L(甲基转移酶法)、(17.3±5.1)μmol/L(胱硫醚法),P>0.05;冠状动脉狭窄组Hcy水平分别为(24.1±5.1)μmol/L、(23.4±5.6)μmol/L,P>0.05;慢性肾脏功能障碍组Hcy水平分别为(4.9±1.9)μmol/L、(4.3±2.8)μmol/L,P>0.05;肝功能损伤组Hcy水平分别为(5.8±2.4)μmol/L、(5.3±3.7)μmol/L,P>0.05;健康体检组Hcy水平分别为(5.1±3.0)μmol/L、(4.5±2.0)μmol/L,P>0.05。结论 Hcy的测定在不同临床诊断中可以进行区别,不同方法测定同型半胱氨酸水平差异无统计学意义,但血清中的特殊成分会对不同测定方法造成不同程度的影响。

甲硫氨酸合成酶基因A2756G多态性与2型糖尿病合并脑梗死的相关性

目的研究甲硫氨酸合成酶(MS)基因A2756G多态性与2型糖尿病合并脑梗死的相关性。方法采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法鉴定安徽地区562例汉族人MS基因A2756G多态性基因型,比较对照组、2型糖尿病组、2型糖尿病合并脑梗死组各组间不同基因型及等位基因频率。结果安徽地区汉族人群存在MS基因A2756G多态性,其G等位基因频率与西方人群比较明显降低,2型糖尿病合并脑梗死组的MS不同基因型及等位基因频率与对照组比较,差异无显著性(P>0.05)。结论MS基因A2756G多态性与安徽地区汉族人群2型糖尿病合并脑梗死的遗传易感性无关。

亚甲基四氢叶酸还原酶及甲硫氨酸合成酶基因多态性与男性不育

易感基因、环境及营养等因素在疾病发生过程中起到了重要作用。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶(MS)是叶酸和同型半胱氨酸(Hcy)代谢中的重要酶,其活性缺陷可能引起体内高同型半胱氨酸血症和DNA甲基化异常而导致多种疾病。目前对MTHFR基因单核苷酸多态性C677T与男性不育的相关性报道结论不一,而对另两种单核苷酸多态性(MTHFR A1298C、MS A2756G)与男性不育的相关性报道鲜见。就MTHFR及MS基因多态性与男性不育的研究进展作一综述。

卡托普利对糖尿病大鼠肾脏甜菜碱-同型半胱氨酸甲基转移酶基因表达的影响及其意义

[目的]探讨卡托普利对糖尿病大鼠肾脏甜菜碱-同型半胱氨酸甲基转移酶基因表达的影响及其意义。[方法]建立糖尿病大鼠模型,分卡托普利干预组和对照组,15周后处死大鼠,从肾脏皮质抽提mRNA,逆转录,分别用Cy5和Cy3标记成两组cDNA探针。cDNA探针与基因芯片杂交,经扫描后,用软件分析。[结果]干预组甜菜碱-同型半胱氨酸甲基转移酶基因表达上调。[结论]卡托普利可能通过调节同型半胱氨酸代谢预防糖尿病肾病。

BHMT基因rs3733890和rs7356530多态性与妊娠糖尿病患病风险的关系

目的:探讨甜菜碱同型半胱氨酸S甲基转移酶(BHMT)基因rs3733890和rs7356530多态性与妊娠糖尿病(GDM)患病风险的关系。方法:选取2019年12月至2022年4月在天津医科大学朱宪彝纪念医院做孕检、汉族、年龄21~40岁、妊娠24~28周的GDM孕妇80例,均经OGTT试验确诊。选择民族、年龄、孕周及孕前BMI相匹配的60名同期健康孕妇作对照。采集外周血,ELISA法检测血清Hcy、叶酸和维生素B12水平,Sanger测序法检测BHMT rs3733890和rs7356530多态性。采用Logistic回归分析GDM与两个多态性的关联。结果:GDM组血清Hcy和叶酸水平高于对照组(P<0.05)。GDM组BHMT rs3733890 A等位基因频率高于对照组,GA和AA基因型频率高于对照组(P<0.05)。两组BHMT rs7356530等位基因和基因型频率差异无统计学意义(P>0.05)。Logistic回归分析结果显示,调整了年龄、孕前BMI、叶酸和维生素B12后,rs3733890 A等位基因与GDM患病风险增加有关,OR(95%CI)为2.624(1.254~5.494)。结论:BHMT rs3733890的A等位基因与GDM患病风险增加有关。

卒中后认知障碍与亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性关系研究

目的:探索卒中后认知障碍(PSCI)与亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性的关系。方法:选取急性卒中患者200例,其中6个月内发生认知障碍的患者100例作为痴呆组,6个月内未发生认知障碍的患者100例作为未痴呆组,另选取同期体检结果呈健康的健康体检者200例为正常对照组。采集所有研究对象外周血检测MTHFR及5-甲基四氢叶酸高半胱氨酸甲基转移酶还原酶(MTRR)基因型多态性,全自动化学发光免疫分析仪检测血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平。结果:痴呆组患者血浆Hcy水平明显高于未痴呆组(P<0.05);未痴呆组患者血浆Hcy水平明显高于对照组(P<0.05);痴呆组A1298C位点基因型AA、AC和CC、C677T位点基因型TT、CT和CC和A66G位点基因型AA、AG和GG的分布频数与未痴呆组和对照组比较具有统计学差异(均P<0.05);既往卒中史(OR=1.721,P=0.040)、卒中部位(OR=1.828,P=0.047)和血浆Hcy水平(OR=1.839,P=0.042)为卒中后发生PSCI的独立影响因素。结论:MTHFR及MTRR基因多态性与卒中后认知障碍的易感性和临床特症存在相关性,可作为筛选标志物。

重组人甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶的表达纯化和鉴定

目的对重组人甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(recombinant human betaine-homocysteine S-methyltrans-ferase,rhBHMT)进行表达纯化和鉴定。方法采用基因重组技术在原核系统表达BHMT蛋白,镍螯合亲和层析和Sephacryl S200层析进行纯化。产物经SDS-PAGE、HPLC、N端氨基酸序列检测与活性验证。结果终产物rhBHMT纯度达97.9%。相对分子质量为45 000,N端氨基酸序列与理论序列一致。结论从工程菌中获得具有活性的高纯度rhBHMT,产物均一,工艺稳定,为中试放大提供可靠依据。

应激对同型半胱氨酸关键代谢酶活性的影响

目的观察慢性束缚应激大鼠肝脏和肾脏内同型半胱氨酸甲基代谢途径中重要代谢酶活性的变化,探讨应激所致机体同型半胱氨酸代谢障碍的作用。方法采用慢性束缚应激方法建立大鼠应激模型;HPLC法检测血浆同型半胱氨酸、肝脏及肾脏甲硫氨酸合成酶和亚甲基四氢叶酸还原酶的活性;采用氨基酸自动分析仪检测甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶的活性。采用ELISA试剂盒测定血浆叶酸、维生素B6、维生素B12水平。结果束缚应激大鼠肝脏和肾脏细胞内同型半胱氨酸甲基化代谢途径中的甲硫氨酸合成酶,亚甲基四氢叶酸还原酶及甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶活性比对照组呈现总体下降的趋势。其血浆辅酶含量与对照组比呈现减低趋势。结论慢性应激所引起的肝脏细胞和肾脏细胞内同型半胱氨酸甲基化途径重要代谢酶活性降低,是引起应激机体高同型半胱氨酸血症的重要原因。