外周血长链非编码RNA-同源盒基因反义转录RNA与卵巢癌术后转归关系及意义

目的探讨外周血长链非编码RNA(Lnc RNA)-同源盒基因反义转录RNA(HOTAIR)与卵巢癌术后转归的关系及意义。方法选取自2014年5月至2016年5月武汉大学中南医院收治的138例卵巢癌患者为研究对象,根据复发情况将患者分为复发组(n=37)和未复发组(n=101)。比较两组患者术前、后的血清糖类抗原125(CA125)水平及Lnc RNA-HOTAIR表达情况;应用受试者工作特征曲线(ROC)分析CA125和Lnc RNA-HOTAIR对患者术后转归的预测价值。结果复发组的血清CA125水平、外周血Lnc RNA-HOTAIR表达均高于非复发组,组间比较,差异有统计学意义(P <0. 05)。ROC曲线分析结果显示,术前、术后Lnc RNA-HOTAIR和CA125对卵巢癌术后复发均有较高的预测价值,术前Lnc RNA-HOTAIR和CA125的最佳工作点分别为2. 75和356. 7 U/ml,术后Lnc RNA-HOTAIR和CA125的最佳工作点分别为1. 62和46. 3 U/ml。结论外周血Lnc RNA-HOTAIR表达水平与卵巢癌术后转归密切相关,可作为血清CA125的辅助指标对术后复发做出预测。

同源盒基因转录反义RNA在卵巢上皮性恶性肿瘤中的作用研究进展

卵巢上皮性恶性肿瘤是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,其病死率居妇科恶性肿瘤之首。约10%的卵巢癌与遗传基因的突变有关,其中以BRCA1/2基因突变研究最为深入,但卵巢癌的发生是一个多因素、多基因、多阶段的复杂的生物学过程,其病因及发生机制尚未明确。同源基因转录反义RNA(HOTAIR)是第1个被发现具有反式调节作用的长链非编码RNA,在维持肿瘤细胞的生长和增殖,提高肿瘤细胞的侵袭转移能力,诱导血管生成同时抑制肿瘤细胞的凋亡等方面具有重要意义;在卵巢癌的发病、转移、复发及肿瘤耐药中起到重要作用。本文对HOTAIR异常表达在卵巢上皮性恶性肿瘤发生、发展中的作用机制及其应用于临床的研究价值进行综述。

HOX反义基因间RNA在唾液腺腺样囊性癌组织中的表达及对预后的影响

目的探讨HOX反义基因间RNA(HOTAIR)在唾液腺腺样囊性癌(SACC)患者组织中的表达及对预后的影响。方法选取2007年3月至2014年3月行手术切除治疗的SACC患者86例,同期留取45例正常唾液腺组织,实时荧光定量聚合酶链式反应检测HOTAIR水平,术后随访至2019年3月31日,记录患者死亡情况及生存时间,以SACC患者组织中HOTAIR相对表达量的四分位数为标准,将患者分为低表达组和高表达组,采用Kaplan-Meier法和Log-Rank检验对两组生存时间进行比较;以年龄、性别、肿瘤部位、病理学类型、肿瘤直径、TNM分期、神经侵犯和淋巴结转移为自变量,采用Cox比例风险回归模型对影响生存时间的多因素进行分析。结果SACC组织中HOTAIR相对表达量为2.48±0.22,高于正常唾液腺组织的1.03±0.13,差异有统计学意义(t=39.812,P<0.001);与TNM分期Ⅰ~Ⅱ期、未发生神经侵犯及淋巴结转移患者相比,TNM分期Ⅲ~Ⅳ期、发生神经侵犯及淋巴结转移SACC患者组织中HOTAIR相对表达量升高(P<0.05);Kaplan-Meier生存分析结果显示,低表达组患者平均生存时间和累积生存率[(113.32±10.77)个月、72.73%]均高于高表达组[(59.75±6.50)个月、39.06%](P=0.004);Cox比例风险回归模型分析结果显示,神经侵犯、淋巴结转移和HOTAIR高表达是影响SACC患者预后的独立风险因素(HR=3.274、2.971、2.911,P<0.05)。结论HOTAIR在SACC患者组织中呈高表达,与患者不良预后有关,是影响预后的风险因素,有望成为SACC患者预后评估的潜在标志物。

长链非编码RNA同源异型基因簇A远端转录本在肿瘤中的研究进展

长链非编码RNA(lncRNA)是一种转录本长度超过200个核苷酸,没有蛋白质编码功能的特殊RNA分子。长期以来,lncRNA被当作基因组的"垃圾序列",但随着研究的不断深入,人们发现lncRNA广泛参与细胞的生物学过程。lncRNA与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关。而同源异型基因簇A远端转录本(HOTTIP)属于lncRNAs中的一种,其在多种恶性肿瘤中异常表达,所以了解HOTTIP在调节肿瘤细胞生命活动中的具体作用具有十分重要的意义。对其在肿瘤细胞发生、发展中的潜在分子机制进行分析,可为今后肿瘤的预防和治疗提供新思路。

酵母菌3-磷酸甘油脱氢酶基因(gpd1)的克隆及其在高渗胁迫下mRNA转录水平的差异

YY、FHS和WFB是生产中常用的酵母菌株。在高渗胁迫下的生长速度依次为FHS、YY、WFB。克隆gpd1基因片段并测序,再与NCBI公布的gpd1序列(X76859)比较,WFB、YY、FHS的同源性分别为99·32%、99·83%、99·83%,YY、FHS菌株的gpd1序列与NCBI上的gpd1序列(X76859)对应的氨基酸序列完全一致,WFB与它们的同源性只有98·5%。用不同浓度的NaCl培养酵母细胞进行渗透胁迫处理,RNA点杂交显示YY、FHS菌株gpd1基因的mRNA表达量在NaCl浓度上升时候有上升的趋势;WFB菌株gpd1基因的mRNA表达量随NaCl浓度的上升逐渐降低。实验结果显示,gpd1基因mRNA转录水平与抗高渗能力相关。

逆转录病毒介导外源基因高效感染大鼠骨髓间充质干细胞

目的通过逆转录病毒系统将小鼠同源盒基因Sox1转移至大鼠骨髓间充质干细胞(rMSC),检测外源基因的表达,感染效率及感染时间。方法常规分子生物学亚克隆技术构建重组逆转录病毒载体,转染至包装细胞株PT67,制备含目的基因的重组逆转录病毒液,感染rMSC,并用带EGFP表达盒的pLEGFP-N1载体的逆转录病毒系统作为平行对照,评估感染率;使用Westernblot以及免疫组织化学的方法检测携带目的基因的重组逆转录病毒在rMSC中的感染和表达情况。结果本实验成功地制备了pLXSN-Sox1重组逆转录病毒载体并制备出高滴度病毒颗粒;将病毒上清感染rMSC,EGFP阳性细胞为21%,感染时间持续20d,而对照脂质体转染法EGFP阳性细胞仅为3%。免疫组化及Westernblot显示用重组逆转录病毒液感染的rMSC可表达外源基因产物Sox1蛋白。结论采用逆转录病毒介导的方法可以将外源性基因高效转移至rMSC中,并有外源性基因的稳定表达。

反义基因致使植物抗病毒

将反义基因(含有碱基相反或互补的序列)用于细菌和真核生物,以抑制基因的表达。在动物中,用反义基因通过遗传工程手段(推测可能是通过阻断病毒的复制)抗病毒侵染。Imperial Collega 的研究者 E.R.Bejarano 和 C.P.Lichtenstein 现已获得转基因烟草植株,其含有一基因的反义 DNA 序列,该基因编码双联病毒番茄金花叶病毒(TGMV)DNA 复制绝对所需的一种蛋白。Bejarano 和 Lichtenstein 发现,用 TGMV 接种上述植株时.部分反义品系的发病率显著降低,并且与反义 RNA 转录本的丰度和由被侵染叶组织获得的病毒 DNA 的减少具有广泛的相关性。

基因功能研究新途径-RNA干扰

近年来的研究表明,一些小的双链RNA可以高效特异地阻断体内特定基因表达,促使mRNA降解,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,称为RNA干扰(RNA interference, RNAi).他是体内抵御外在感染的—种重要保护机制,也可以作为一种简单有效的代替基因敲除的遗传工具.现就RNAi 的研究进展做一综述.

lncRNA HAGLR促卵巢癌细胞生长和上皮-间充质转化的机制研究

目的研究长链非编码RNA同源盒D基因簇反义生长相关长链非编码RNA(lncRNA HAGLR)通过调控核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族pyrin结构域蛋白3(NLRP3)炎症小体对卵巢癌细胞生长和上皮-间充质转化(EMT)的调控作用。方法培养卵巢正常细胞IOSE-80(IOSE-80组)以及卵巢癌细胞A2780(A2780组)。然后将A2780随机分为lncRNA HAGLR沉默组(siHAGLR组)、沉默阴性对照组(siNC组)、siHAGLR联合NLRP3抑制剂MCC950处理组(siHAGLR+MCC950组)。qRT-PCR法检测lncRNA HAGLR的表达。Western blot检测NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、caspase-1、ASC和EMT相关蛋白Vimentin、Snail1、α-SMA、Twist1的表达。CCK-8法检测A2780细胞的增殖活性。Transwell法检测A2780细胞的迁移和侵袭能力。细胞克隆形成实验检测A2780细胞的生长能力。TUNEL染色检测A2780细胞的凋亡。结果与IOSE-80组相比,A2780组lncRNA HAGLR、Vimentin、Snail1、α-SMA、Twist1表达均上调(P<0.05),但NLRP3、caspase-1、ASC的表达均下调(P<0.05)。与siNC组相比,siHAGLR组的lncRNA HAGLR、Vimentin、Snail1、α-SMA、Twist1表达均下调(P<0.05),但NLRP3、caspase-1、ASC的表达均上调(P<0.05),细胞增殖率、细胞克隆数以及迁移和侵袭数均明显减少(P<0.05),细胞凋亡数则增加(P<0.05)。与siHAGLR组相比,siHAGLR+MCC950组的lncRNA HAGLR表达无明显变化(P>0.05),而Vimentin、Snail1、α-SMA、Twist1表达均上调(P<0.05),但NLRP3、caspase-1、ASC的表达均下调(P<0.05),细胞增殖率、细胞克隆数以及迁移和侵袭数均显著增加(P<0.05),细胞凋亡数则减少(P<0.05)。结论lncRNA HAGLR通过抑制NLRP3炎症小体促进卵巢癌细胞的生长和EMT。

LIM同源盒基因L3/Lhx8对腭突发育及腭裂形成的影响

LIM同源盒（homcobox）基因群是同源盒基因的亚家族之一，该基因群可编码的蛋白，N末端含有两个LIM领域，C末端含有一个LIM同源盒基因领域，它作为一类转录调节因子，通过其结构域特异的分子内或分子间相互作用，在不同种类动物的形态形成过程中，发挥着极为重要的调控作用。

LncRNA FEZF1-AS1通过调控EZH2对肺间质细胞增殖、迁移及侵袭的作用

目的研究长链非编码RNA FEZ家族锌指1-反义RNA 1(lncRNA FEZF1-AS1)调控zeste同源物增强子2(EZH2)对肺间质细胞增殖、迁移、侵袭能力及上皮细胞-间质转化(EMT)的影响及其作用机制。方法将人肺腺癌细胞系A549分为对照组(control)和模型组[model,用转化生长因子β1(TGF-β1)20 ng/mL作用48 h,诱导成为肺间质细胞]。用Western blot检测细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)及波形蛋白(vimentin)的蛋白表达。RT-qPCR检测细胞中lncRNA FEZF1-AS1和EZH2基因表达。转染组细胞分为转染si NC组、si lncRNA FEZF1-AS1+OE vector组和si lncRNA FEZF1-AS1+OE EZH2组。CCK-8法检测细胞增殖、细胞划痕检测细胞迁移、Transwell小室法检测细胞侵袭;用Western blot检测细胞中E-cadherin、N-cadherin、vimentin及EZH2的蛋白表达,用RNA免疫沉淀(RIP)测定FEZF1-AS1与EZH2的直接结合作用。结果与对照组比较,模型组E-cadherin的蛋白表达水平减少(P<0.05);N-cadherin及vimentin的蛋白表达水平升高(P<0.05);与对照组比较,模型组lncRNA FEZF1-AS1与EZH2基因的表达水平明显升高(P<0.05);与si NC组相比,si lncRNA FEZF1-AS1+OE vector组细胞增殖、迁移、侵袭能力降低,E-cadherin蛋白表达升高,N-cadherin、vimentin、EZH2蛋白表达降低(P<0.05);与si lncRNA FEZF1-AS1+OE vector组比较,si lncRNA FEZF1-AS1+OE EZHZ组细胞增殖、侵袭、迁移能力升高,E-cadherin蛋白表达降低,N-cadherin、vimentin、EZH2蛋白表达升高(P<0.05);RIP实验进一步证实了lncRNA FEZF1-AS1与EZH2具有结合作用。结论LncRNA FEZF1-AS1通过调控EZH2促进肺间质细胞增殖、侵袭、转移和EMT过程。

干扰foxM1基因表达可增强骨髓间充质干细胞的成骨分化能力

背景:foxM1基因被认为参与了干细胞分化命运的调控,但其对间充质干细胞成骨分化的影响尚未见报道,关于foxM1基因的研究也主要集中于肿瘤领域。目的:探索干扰foxM1基因表达水平对骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响。方法:全骨髓贴壁法培养SD大鼠(中山大学实验动物中心提供)骨髓间充质干细胞,构建含嘌呤霉素抗性基因的foxM1 shRNA重组慢病毒载体并转染大鼠骨髓间充质干细胞,经嘌呤霉素筛选建立foxM1稳定敲低细胞株,另设置空病毒载体组以及未转染组。使用骨髓间充质干细胞成骨诱导分化培养基诱导培养并行茜素红染色检测其成骨分化能力,使用定量RT-PCR检测成骨相关基因的表达水平,同时提取胞核蛋白,Western blot检测β-catenin蛋白表达水平。结果与结论:(1)与空病毒载体组以及未转染组比较,foxM1敲低的大鼠骨髓间充质干细胞经成骨诱导分化后形成的骨结节数量明显增多,成骨相关基因col1a1和runx2表达水平均显著升高,但胞核β-catenin蛋白水平无明显改变;(2)干扰foxM1基因表达可增强骨髓间充质干细胞的成骨能力。

长链非编码RNA肝癌高表达转录本促进人骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化

背景:骨髓间充质干细胞在体外可以被诱导分化为肝样细胞,但是细胞功能不成熟。研究表明,长链非编码RNA可以影响间充质干细胞的分化,但是关于长链非编码RNA肝癌高表达转录本是否能够参与骨髓间充质干细胞向肝细胞分化还未有报道。目的:探讨长链非编码RNA肝癌高表达转录本在人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化中的作用。方法:体外添加细胞因子诱导人骨髓间充质干细胞(购自上海中科院细胞库)向肝样细胞分化,诱导4周后倒置显微镜观察细胞的形态学变化,免疫荧光技术检测肝细胞特异性蛋白的表达,qRT-PCR检测分化过程中肝癌高表达转录本的表达;然后通过慢病毒转染构建稳定表达肝癌高表达转录本的人骨髓间充质干细胞株,以转染阴性对照病毒作为对照组,两组同时添加细胞因子进行肝向细胞诱导分化,qRT-PCR、Western blot检测过表达组与对照组肝细胞特异性基因、蛋白表达的差异。结果与结论:①人骨髓间充质干细胞在体外添加细胞因子下可以成功被诱导分化为肝样细胞,在分化过程中肝癌高表达转录本的表达逐渐增高;②过表达肝癌高表达转录本后促进了人骨髓间充质干细胞诱导分化后肝细胞特异性基因及蛋白的表达;③结果表明,肝癌高表达转录本在人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化中发挥着至关重要的作用,将为细胞治疗肝脏疾病奠定坚实的理论基础。

一种嗜呼吸道肠道病毒可在人细胞间黏附分子-1转基因鼠中引起脊髓灰质炎[英]／Dufresne AT…／／Proc Nail Acad Sci USA．

柯萨奇病毒A21(CAV21)属小RNA病毒科肠病毒属C型人肠道病毒(HEV—C)。HEV—C与脊髓灰质炎病毒(PV)有高度同源性，亲缘关系最近，但所致疾病不同，归因其作用于宿主细胞不同的病毒受体。PV通过受体CD155引起脊髓灰质炎，而CAV21的受体与鼻病毒相同，为细胞间黏附分子-1(ICAM-1)，引起上呼吸道感染。虽然其他的肠病毒引起脊髓灰质炎的病例均有报道，但从未观察到HEV—C引起脊髓灰质炎。本文建立人ICAM-1转基因小鼠，进行CAV21感染试验。研究发现CAV21也存在引起脊髓灰质炎的可能性。

同源盒基因转录反义RNA(HOTAIR)在乳腺癌临床诊疗中的研究进展

同源盒基因转录反义RNA(HOTAIR)是第一个被发现具有反式转录调控作用的长链非编码RNA。作为反义RNA,HOTAIR本身并不编码蛋白质,而是以反式转录调控因子作用于不同染色体上的HOX基因簇,从而在基因组调控和肿瘤的发生、发展中起着重要作用。研究表明,HOTAIR与人类多种肿瘤(如乳腺癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、喉癌等)的发生、发展及转移预后密切相关,高表达HOTAIR能抑制抑癌基因的表达,促进肿瘤复发转移,而下调HOTAIR表达则降低肿瘤细胞的转移侵袭能力。近年来研究逐渐证实,HOTAIR在乳腺癌组织、细胞系及其外周血中存在异常表达,并且这种表达失调有助于阐明乳腺癌的发生机制及耐药机制。临床研究则进一步表明,检测HOTAIR的表达水平不仅有助于提高乳腺癌的诊断敏感性和特异性,而且有助于促进临床上对乳腺癌的病情评估、预后判断、疗效评价和肿瘤复发转移的动态监测。此外,HOTAIR表达可能与乳腺癌不同激素受体类型的生物学行为相关。在乳腺癌治疗方面的探索研究则显示,通过设计HOTAIR促癌通路上的相应抗肿瘤药物或将能够为某些难治性乳腺癌的治疗带来曙光,比如他莫昔芬耐药乳腺癌。本文将对近几年上述研究进展进行综述。

PDX1与NKX6.1双基因表达腺病毒载体的构建、鉴定与表达

目的运用pADxsi系统构建带人PDX1与NKX6.1双基因表达腺病毒载体。方法采用基因克隆技术,将目的基因NKX6.1克隆至pShuttle-GFP-CMV中,得到pShuttle-GFP-CMV-NKX6.1;将PDX1克隆至pShuttle-CMV-GFP/CMV-NKX6.1上,替换掉GFP,得到pShuttle-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1;将CMV-PDX1/CMV-NKX6.1从pShuttle-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1转移到ADxsi骨架载体上,得到pADxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1,在293细胞中进行包装与扩增活病毒,病毒滴度测定;体外感染人胎肝间充质干细胞。结果分别酶切重组人PDX1与NKX6.1基因表达穿梭质粒与腺病毒载体质粒,阳性克隆均获得与理论相一致的目的条带;重组腺病毒感染人胎肝间充质干细胞比例达90%以上;RT-PCR结果表明目的基因在人胎肝间充质干细胞内能稳定表达;免疫细胞化学与间接荧光检测目的PDX1与NKX6.1蛋白分子均特异在细胞核表达。结论应用pADxsi系统重组技术成功构建了人PDX1与NKX6.1双基因表达腺病毒载体。

反基因策略——基因治疗的新方向

自1980年Cline用重组β珠蛋白基因治疗两名β地中海贫血患者以来,基因治疗在取得众多成就的同时也暴露出一些问题。安全方面的风险及转移基因表达的不稳定性使基因替代疗法还远达不到人们最初所预想的效果。基因原位修复虽是基因治疗最理想的途径,但目前在技术上还很难做到。相比之下,反义治疗在现阶段可能是较好的方向,因为反义核酸具有传统药物的使用方便和容易大量生产等优点。

转化生长因子α反义RNA对人脑胶质瘤细胞系BT_(325)的生长抑制和诱导分化作用

转化生长因子α（TGFα）以自泌和旁泌的形式与肿瘤细胞表面表皮生长因子受体（EGFR）结合,在肿瘤的发生发展中起着重要作用。阻断这种自泌和旁泌体系可能对肿瘤细胞产生影响。为此我们构建了含TGFα反义基因的逆转录病毒重组载体并将其导入人脑胶质瘤细胞系BT325中,成功地表达了TGFα反义RNA。在反义RNA作用下,肿瘤细胞发生了显著变化,结果如下:

LncRNA ZEB1-AS1和LncRNA SOX2OT在糖尿病肾病患者中的表达及与肾功能的相关性研究

目的探究长链非编码RNA锌指E盒结合同源盒蛋白1反义链1(LncRNA ZEB1-AS1)和长链非编码RNA性别决定相关基因簇2重叠转录本(LncRNA SOX2OT)在糖尿病肾病(DN)患者中的表达及与肾功能的相关性。方法选取于2021年11月—2023年12月在武汉大学人民医院肾内科收治的DN患者106例为DN组,并根据24 h尿蛋白定量(24 h Upro)水平分为正常蛋白尿亚组43例(<30 mg)、微量蛋白尿亚组39例(30~<300 mg)、大量蛋白尿亚组24例(≥300 mg),另选取同期医院单纯糖尿病患者106例作对照组,检测患者血清LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT水平;Pearson法分析LncRNA ZEB1-AS1和LncRNA SOX2OT与肾功能指标的相关性;Logistic分析影响DN患者肾功能损伤的因素。结果DN组血清LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT水平低于对照组(t=11.471、10.257,P均<0.001)。血清LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT比较,正常尿蛋白亚组>微量尿蛋白亚组>大量尿蛋白亚组(F=58.720、117.722,P均<0.001),BUN、SCr、UA水平比较,正常尿蛋白亚组<微量尿蛋白亚组<大量尿蛋白亚组,差异均有统计学意义(F=122.493、595.589、53.178,P均<0.001);LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT分别与BUN、SCr、UA呈负相关(r=-0.487、-0.498、-0.521,-0.527、-0.515、-0.534,P均<0.001);Logistic回归分析显示,糖尿病病程长及高BUN、SCr、UA水平是影响DN患者肾功能损伤的危险因素[OR(95%CI)=1.672(1.128~2.479)、2.839(1.534~5.253)、2.754(1.512~5.017)、2.693(1.464~4.954)],高LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT是保护因素[OR(95%CI)=0.875(0.798~0.959)、0.898(0.832~0.969)]。结论血清LncRNA ZEB1-AS1、LncRNA SOX2OT水平与DN患者肾功能有关,可能是评估DN患者肾功能的潜在指标。