植物雄性育性相关基因的克隆方法

文章基于植物分子生物学的研究成果,介绍了几种克隆植物雄性育性相关基因的方法,其中包括mRNA差异显示技术、染色体步行法(Chromosome walking)、基因标签法(Gene tagging)、基因序列同源克隆法等。

异育银鲫中科3号MSTN基因的克隆与序列分析

采用同源克隆和末端快速扩增（rapid amplication of cDNA ends，RACE）方法分离克隆了异育银鲫（Allogyoge-netics crucian carp）中科3号肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）基因全长DNA，得到3394 bp全长的DNA，包含3段外显子和2段内含子，其中2098 bp的全长cDNA在NCBI数据库中进行序列比对后，确定为异育银鲫中科3号MSTN基因。对推测的MSTN基因氨基酸序列进行同源性比对和系统分析显示：MSTN基因在异育银鲫与斑马鱼及其他鱼类间的氨基酸序列相似度为73．5％～98．0％，与鲤鱼MSTN基因相似度最高（98．0％），不同物种间MSTN的氨基酸序列较为保守。用半定量RT－PCR检测MSTN基因在异育银鲫心、肠、肌、脑、鳃和肝的相对表达量结果表明，MSTN基因在脑中含量最高，其次是肌、鳃、心、肠，在肝脏中含量最低。

太子参GAPDH基因的克隆及序列分析

为了获取可靠内参基因,采用同源克隆技术和c DNA末端快速延伸技术,首次从太子参中克隆3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)的部分c DNA序列,命名为Ph GAPDH,序列长度为981 bp,包含699 bp的部分阅读框,推测其编码232个氨基酸,还含有282 bp的3'UTR。序列分析结果表明,太子参Ph GAPDH基因编码的氨基酸序列与同科植物香石竹(Dianthus caryophyllus)氨基酸序列同源性高达99%。PCR分析结果表明,Ph GAPDH基因在太子参不同种源块根、同一种源不同组织及不同生长时期的表达水平较稳定,可以作为太子参功能基因研究的内部参考基因。

枣MAPK基因片段克隆与分析

采用同源基因克隆法,首次获得了枣MAPK基因片段543 bp,经Blast比对,该序列与湖北海棠(Malus hupehensis EF427897.1)、蓖麻(Ricinus communis XM002509805.1)、西府海棠(Malus micromalus AF435805.2)和欧洲山毛榉(Fagus sylvatica AJ784997.1)的相似率分别为86%、86%、85%和84%。进一步进行系统进化分析,证明该基因属于MAPK中TEY型的B类。

甘蔗磷效率的基因型差异及磷转运子Pht1的表达分析

磷是植物生长发育重要的大量营养元素之一。甘蔗主产区酸性红壤磷素营养缺乏,严重影响了甘蔗的生长及产量的提高。本研究利用磷吸收利用效率基因型差异显著的两个甘蔗品种ROC22和Phil72-445为材料,通过苗期营养液培养法进一步评价与验证了ROC22和Phil72-445甘蔗磷效率的基因型差异特征,以及通过同源克隆法克隆甘蔗磷转运子Pht1家族基因并采用荧光定量PCR技术分析其表达模式。结果显示:低磷胁迫下,ROC22具有比Phil72-445显著强势的生物量、植株磷累积量、地上部磷转移系数,表现为磷吸收转运高效基因型;采用同源克隆法得到甘蔗磷转运蛋白Pht1家族的6条成员基因序列(SoPht1;2,SoPht1;3,SoPht1;5,SoPht1;6,SoPht1;11,SoPht1;12),生物信息学分析得知其与高粱、稻、玉蜀黍等的Pht1家族基因序列高度相似;低磷胁迫后期(处理31 d),SoPht1;2,SoPht1;5和SoPht1;6在ROC22和Phil72-445中均有明显的低磷诱导增强表达,且这三个基因在下部成熟叶(正四叶)中的诱导增强表达很可能对ROC22的磷高效起到主要作用。本研究结果为进一步系统深入研究SoPht1基因在甘蔗磷高效中的功能机理提供了依据。