携带同源重组修复相关基因突变的消化道肿瘤的临床特点

目的:探讨消化道肿瘤中同源重组修复相关基因(homologous recombination repair related gene,HRR)突变的发生情况及临床意义。方法:共92例消化道肿瘤患者,79例患者进行了血液标本HRR检测,53例患者进行了组织标本HRR检测,40例患者同时行血液和组织的HRR基因检测,收集患者基因检测结果及临床相关资料。结果:在79例患者血液标本检测中发现10例(12.6%)有临床意义HRR突变,在53例患者组织标本检测中发现9例(17.0%)有临床意义HRR突变。40例同时行血液和组织的HRR基因检测患者中常见的有临床意义HRR突变为CDK12突变4例(10.0%)、ATM突变3例(7.5%)、BRCA1突变2例(5.0%)。13例有临床意义HRR突变患者中常见共存突变为TP53突变10例(76.9%)、APC突变5例(38.5%)、PIK3CA突变4例(30.8%)。40例患者中13例患者血液和/或组织中有临床意义HRR突变,27例患者血液和组织中均无任何临床意义HRR突变且两组相比,有临床意义HRR突变组肿瘤突变负荷(tumor mutational burden,TMB)为6.17(2.24~11.52),而未携带HRR突变组TMB为0.4(0~3.75),差异有统计学意义(P<0.05)。40例患者组织检测中7例HRR有临床意义的突变,33例无HRR突变,血液检测中10例HRR有临床意义的突变,30例无HRR突变,一致性检验的Kappa值为0.333(P=0.031)。结论:携带有临床意义HRR突变的消化道肿瘤患者TMB更高,血液和组织检测HRR突变有较好的一致性。

携带同源重组修复相关基因突变的消化道肿瘤的临床特征研究

探讨消化道肿瘤当中的同源重组修复相关基因(Homologous recombination repair related gene,HRR)的突变情况及临床特征。方法 本次研究将2020年11月-2022年10月在本院治疗的92例消化道肿瘤患者作为研究对象,其中有79例的患者接受了同源重组修复相关基因的血液检测,53例患者接受了HRR的组织样本检测,40例患者同时接受了两种样本检测,对其中的检测结果进行分析。结果 在血液标本的检测过程中,有10例患者出现了基因突变,突变率为12.6%(10/79);在组织样本的检测当中,有9例患者出现了基因突变,突变率为17.0%(9/53);在同时接受组织样本与学哦样本的检测当中, 最常见的突变情况为CDK12突变(10.0%),ATM突变(7.5%)及BRCA1突变(5.0%)。对于出现了基因突变的患者而言,肿瘤突变符合(Tumor mutational burden,TMB)是6.17(2.24-11.52),未出现基因突变的患者为0.4(0-3.75),在数据的对比中具有统计学差异(P<0.05)。在异质性的检验中,Kappa值是0.333(P=0.031)。结论 具有临床意义HRR突变的患者在同源重组修复相关基因更高,且血液样本与组织样本在检测中也具有较好一致性。

非小细胞肺癌组织EMSY、PIDD表达与同源重组修复基因的相关性及其临床意义

目的研究非小细胞肺癌(NSCLC)组织中EMSY转录抑制因子(EMSY)、p53诱导的死亡结构域蛋白1(PIDD)表达与同源重组修复基因表达的相关性及临床意义。方法选择2022年1月—2023年4月河北北方学院附属第一医院呼吸与危重症医学科诊治NSCLC患者80例。采用实时荧光定量PCR检测癌组织及癌旁组织中EMSY、PIDD表达与同源重组修复基因人乳腺癌易感基因1(BRCA1)、切除修复交叉互补基因1(ERCC1),核糖核苷酸还原酶亚单位1(RRM1)表达。Pearson相关分析EMSY、PIDD表达与同源重组修复基因表达的相关性;分析EMSY、PIDD表达与NSCLC临床病理相关参数的关系及在NSCLC诊断中的价值。结果NSCLC癌组织中EMSY、PIDD、BRCA1、ERCC1、RRM1 mRNA相对表达量均高于癌旁组织(t/P=30.176/<0.001,27.821/<0.001,25.075/<0.001,16.680/<0.001,25.610/<0.001)。NSCLC癌组织中EMSY、PIDD mRNA与BRCA1、ERCC1、RRM1 mRNA表达均呈正相关(r/P=0.654/<0.001,0.712/<0.001,0.584/<0.001;0.724/<0.001,0.661/<0.001,0.563/<0.001)。低分化程度、有淋巴结转移及TNM分期Ⅲ期NSCLC癌组织EMSY、PIDD mRNA表达分别显著高于高中分化程度、无淋巴结转移及TNM分期Ⅰ~Ⅱ期NSCLC癌组织(t/P=13.693/<0.001,13.380/<0.001,12.197/<0.001;10.289/<0.001,11.130/<0.001,9.405/<0.001)。EMSY、PIDD mRNA及两项联合诊断NSCLC的AUC分别为0.834、0.802、0.906,两项联合诊断的AUC大于单一指标(Z=4.751、5.257,P均<0.001)。结论EMSY、PIDD在NSCLC癌组织中表达升高,与同源重组修复基因表达及不良临床病理特征有关,两者联合有助于NSCLC的诊断。

非小细胞肺癌同源重组修复通路基因与临床特征的相关性分析

目的:采用基因组不稳定评分(genomic instability score,GIS)描述非小细胞肺癌患者的同源重组修复缺陷(homolo⁃gous recombination deficiency,HRD)状态,探讨HRD状态及同源重组通路基因(homologous recombination repair,HRR)与临床特征的相关性。方法:本研究纳入2020年1月至2022年1月在重庆医科大学附属第一医院接受治疗的335例非小细胞肺癌患者,采用二代测序法检测GIS评分及35个HRR基因,根据杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)、端粒等位基因失衡(telo⁃meric allelic imbalance,TAI)、大片段迁移(large-scale state transition,LST)综合评估GIS评分。GIS评分及HRR基因与临床特征之间的关系通过Mann-Whitney U检验,Kruskal-Wallis检验和Dunn-Bonferroni检验分析。GIS评分和肿瘤突变负荷(tumor mutation burden,TMB)值的相关性采用Spearman分析。结果:在335例患者中,男性患者、年龄大、分期晚、有吸烟史、鳞癌均会导致GIS评分更高,GIS评分Md(P25,P75)分别是13(4,26.75),12(3,22.5),21.5(12,30),16(4,27)和24(18,38.25)(Z=-5.083,P<0.001;Z=2.973,P=0.003;Z=8.225,P<0.001;Z=4.655,P<0.001;Z=-7.082,P<0.001)。HRR体系基因突变组样本GIS评分高于野生组,2组GIS评分分别为18.5(5.25,28.75)和6(1,16)(Z=5.012,P<0.001)。共检测到33个HRR相关基因突变,主要集中在ATM、RECQL4、ATR、FANCM、BRCA1、FANCA、BRIP1、NBN、WRN等基因,其中BRCA2、FANCI、FANCA基因突变均会导致GIS评分升高,GIS评分Md(P25,P75)分别是34(25.25,51),31.5(14.5,50)和22(12,44)(Z=-2.805,P=0.005;Z=-2.216,P=0.027;Z=-2.478,P=0.013)。GIS评分和TMB值之间呈正相关(rs=0.504,P<0.001)。结论:揭示中国非小细胞肺癌患者GIS评分及HRR基因突变特征,提示基于二代测序的GIS评分及HRR基因检测可能成为非小细胞肺癌患者靶向治疗及免疫治疗新的生物标志物。

102例乳腺癌同源重组修复相关胚系基因突变研究

目的:探讨乳腺癌患者同源重组修复(homologous recombination repair,HRR)相关胚系基因的突变情况及其与临床病理特征之间的关系。方法:检测本中心102例乳腺癌患者同源重组修复高度相关的21个胚系基因的变异情况,收集患者的年龄、肿瘤大小、淋巴结状态、病理类型及家族史等临床资料,统计分析基因突变与各临床病理特征之间的关系。结果:携带HRR相关胚系基因突变(含BRCA及非BRCA基因)的患者与未携带突变的患者在临床特征方面(如年龄、淋巴结状态、肿瘤大小和肿瘤分子分型等)并无统计学差异。携带BRCA突变的患者往往有肿瘤家族史(95%CI:0.997~6.142,P=0.047),尤其是乳腺癌/卵巢癌家族史(95%CI:1.227~9.953,P=0.015)。同时,ATM基因突变在人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2,Her-2)阳性患者中的发生率显著高于Her-2阴性患者(P=0.045)。结论:患者的肿瘤家族史,尤其是乳腺癌/卵巢癌家族史是发生BRCA突变的重要危险因素;Her-2阳性乳腺癌可能与ATM突变存在一定的相关性。

同源重组修复通路基因遗传变异与结直肠癌易感性的关联研究

目的探讨我国人群同源重组修复(homologous recombination repair,HRR)通路关键基因的单核苷酸多态性与结直肠癌(colorectal cancer,CRC)易感性关联。方法以生物信息学分析结合文献筛选同源重组修复通路关键基因;采用基于通路分析的病例-对照研究设计,共纳入2001年1月至2004年6月于陆军军医大学3所附属医院普通外科经病理诊断的413例新发CRC病例与1 671例非肿瘤患者对照。以ILLUMINA人类基因组芯片对筛选出的基因上下游50 kb区域内的TagSNPs分型,采用logistic回归模型计算SNPs与CRC的关联。结果筛选出17个HRR通路中的关键基因;在17个基因及上下游50 kb区域内的2 207个SNP中有16个位点与结直肠癌风险关联显著,其中RAD52基因3’-UTR的rs11226位点携带A等位基因者的CRC风险相对携带G者增加约1.4倍(OR=1.42,95%CI=1.22~1.66,P=6.67×10-6);CRTC3-AS1基因内含子区rs75893366位点携带G等位基因者的CRC风险仅为携带A者的0.4倍(OR=0.43,95%CI=0.25~0.74,P=1.81×10-3)。但仅rs11226位点经bonferroni校正后在男性和女性中均具有显著性。结论同源重组修复通路中17个关键基因的单核苷酸多态性与结直肠癌患病风险显著关联,提示同源重组修复通路基因的遗传变异可能影响结直肠癌的遗传易感性。

基于基因瘢痕评分(GSS)探索乳腺癌中的同源重组修复缺陷(HRD)

目的:使用基因瘢痕评分(GSS)描述中国乳腺癌人群的HRD状态,并对乳腺癌的HRD状态和临床特征进行统计学分析。方法:使用AmoyDx HRD Panel检测我院诊断的79例乳腺癌患者。根据拷贝数长度(LCN)、拷贝数部位(SCN)和拷贝数类型(TCN)确定基因组疤痕得分(GSS)。HRD阳性是指BRCA突变阳性和/或GSS得分≥50。HRD得分与临床特征之间的关系通过卡方检验和Fisher’s精确检验及Wilcoxon秩和检验进行统计分析。结果:在79例患者中,BRCA突变阳性率10.1%,HRD阳性率35.4%。在TNBC患者中,HRD阳性率为80%,BRCA突变阳性率26.7%。53.4%的TNBC患者BRCA突变阴性但HRD阳性。与HRD阴性的乳腺癌相比,HRD阳性乳腺癌明显更可能是Ki-67高(P<0.05)、ER阴性(P<0.05)和PR阴性(P<0.05)的肿瘤。HRD阳性率在TNBC(80%)中也明显高于Luminal A(7.7%,P<0.001)和Luminal B(27.7%,P<0.05)。结论:GSS是乳腺癌同源重组缺陷的重要检测工具,能帮助挖掘BRCA突变阴性但HRD阳性的乳腺癌人群。HRD状态与乳腺癌的ER、PR和Ki-67状态相关。

Ⅲ型家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症易感基因UNC13D参与同源重组修复

本研究从DNA双链断裂同源重组修复角度探讨UNC13D(秀丽新小杆线虫)基因参与Ⅲ型家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(familial hemophagocytic lymphohistiocytosis type 3,FHL3)的发病机制。利用DNA同源重组修复方法,检测正常对照组及UNC13D基因下调后DR-U2OS细胞同源重组修复率的变化情况,并研究此基因的相关功能。结果表明:下调DR-U2OS细胞的UNC13D基因表达后,同源重组修复率较正常对照组明显下降,且差异有统计学意义(P<0.05),提示UNC13D编码蛋白Munc13-4不仅参与到细胞毒颗粒的胞吐过程中,而且在DNA双链断裂修复中也起作用。结论:UNC13D基因突变可能通过抑制细胞毒颗粒的胞吐和降低DNA双链断裂后的同源重组修复率参与FHL3发病过程,这一研究结果为揭示FHL3的发病机制提供新的理论基础。

复发性卵巢癌两次手术基因同源重组修复缺陷状态变化与临床价值分析

目的:分析复发性卵巢癌患者两次手术基因同源重组修复缺陷(HRD)状态的改变,探讨卵巢癌复发时是否需要再次进行HRD检测。方法:收集2017年3月至2021年8月山东省3家三级甲等医院卵巢癌术后复发,再次行卵巢肿瘤减灭术并行HRD检测的9例上皮性卵巢癌患者的临床资料,比较两次手术样本肿瘤乳腺癌易感基因(BRCA)突变情况、HRD评分以及HRD状态的变化。结果:9例晚期上皮性卵巢癌患者中位年龄为54.8岁,中位无进展生存期为12.4个月。二次手术BRCA突变状态较初次手术均无变化,其中3例患者BRCA突变均为胚系突变,突变位点未发生改变。9例患者中HRD状态阳性6例,阴性3例。所有患者二次手术HRD评分均发生改变,但根据预先设定的HRD状态判定标准,HRD状态无变化。结论:HRD状态在原发和复发样本之间保持不变。初始肿瘤的HRD评分对于接受过含铂治疗的复发性上皮性卵巢癌的治疗方案选择仍有参考价值,提示卵巢癌复发时无需再次进行HRD检测。

卵巢癌中同源重组修复基因逆转突变导致多腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂耐药的研究进展

卵巢癌是最常见的生殖系统肿瘤之一,中国卵巢癌发病率呈明显上升趋势。卵巢癌的发生与同源重组修复基因功能异常密切相关。15%~20%的上皮性卵巢癌患者携带乳腺癌易感基因(BRCA)1/2胚系突变。多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抑制剂利用“合成致死”原理,对BRCA1/2基因突变或同源重组修复缺陷卵巢癌患者具有良好的抗肿瘤作用。随着PARP抑制剂的应用越来越广泛,PARP抑制剂原发或获得性耐药逐渐成为重要的临床问题。目前已经发现同源重组修复基因逆转突变能够恢复DNA损伤修复功能,是导致PARP抑制剂耐药的重要机制。本文就同源重组修复基因逆转突变导致PARP抑制剂耐药及逆转耐药的治疗方法进行综述。

同源重组法构建多功能农药降解基因工程菌研究

构建遗传稳定的多功能农药降解基因工程菌可以为农药污染的生物修复提供良好的菌种资源,然而,构建遗传稳定且不带入外源抗性的基因工程菌是一个难点。通过以受体菌的16SrDNA为同源重组指导序列、sacB基因为双交换正筛选标记构建同源重组载体,二亲结合的方法将甲基对硫磷水解酶基因(mpd)整合到呋喃丹降解菌Sphingomonassp.CDS1染色体的16SrDNA位点,分别成功构建了含1个和2个mpd基因插入到rDNA位点且不带入外源抗性的基因工程菌株CDSmpd和CDS2mpd。同源重组单交换的效率为3.7×10-7～6.8×10-7。通过PCR和Southern杂交的方法验证了同源重组事件。基因工程菌遗传稳定,能同时降解甲基对硫磷和呋喃丹。甲基对硫磷水解酶(MPH)的比活在各生长时期均高于原始出发菌株,比活最高达6.22muμg。

影响动物细胞同源重组发生与基因打靶效率的分子机制

真核细胞的基因打靶是基因结构与功能研究的一种非常有价值的技术,也是可应用于基因治疗的具有潜力的工具。有2个限制因素束缚真核细胞基因打靶的发展,即同源重组(HR)率非常低而随机整合率非常高。通过特定基因的过表达或表达干涉,使一些参与DNA重组的蛋白表达水平瞬间改变,可能会增加HR率,降低随机整合率。本文列举了一些与HR相关的候选基因,详细介绍了其中的Rad52上位簇基因,还讨论了打靶载体的设计与修饰、DNA转染方法的有效性等。

同源重组修复缺陷临床检测与应用专家共识(2021版)

随着聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂在临床的广泛应用,越来越多的肿瘤患者从其治疗中获益。同源重组修复缺陷(homologous recombination deficiency,HRD)作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂重要的疗效预测标志物在患者管理中发挥越来越重要的作用,但在临床实践中,HRD的检测方法、评价体系与临床解读等标准化程度尚存不足,因此极大限制了其应用。为了促进HRD临床检测和应用的规范化,中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会遗传肿瘤标志物协作组和中华医学会病理学分会分子病理学组组织临床、病理、分子检测和生物信息分析等领域专家,综合国内外HRD检测和临床应用的共识指南、重要文献以及临床实践,编写本共识,对HRD临床检测和应用问题给出专家组意见,以期最大可能地提高PARP抑制剂疗效预测的准确性和可靠性。

DNA同源重组修复与乳腺癌的研究进展

双链断裂是真核细胞最严重的DNA损伤类型,主要依赖同源重组途径进行修复。BRCA1/2是该修复通路中的关键因子,以其为核心组成的BRCA肿瘤抑制因子网络中多种致病性突变均可损伤基因组完整性和稳定性,增高乳腺癌易感性。该文结合最新研究进展,对DNA同源重组修复网络中关键基因突变与乳腺癌易感性及个体化治疗策略进行综述,旨在促进相关突变携带者的乳腺癌早期预防、分子诊断和精准治疗。

植物DNA双链断裂修复机制及其在重离子诱变和基因编辑中的作用

在自然界中,植物会遭受各种环境或内源因素导致的DNA损伤,其中DNA双链断裂(double strand breaks,DSBs)的影响最为严重,如果修复不当,将导致基因组不稳定、基因突变甚至细胞死亡。一方面,植物进化出了强大且有序的损伤修复机制,以确保其存活及正常繁衍;另一方面,基于修复过程的容错性及致突变性,T-DNA插入、基因编辑、物理诱变等技术广泛应用于动植物品种改良。相较于哺乳动物,植物DSBs修复通路及其分子机制报道较为有限。本文综述了植物对DSBs损伤的响应、主要修复途径及关键因子,介绍了通路机制尚未完全解析的替代末端连接(alternative end joining,Alt-EJ)的最新研究进展;此外,探讨了重离子束引起的植物DSBs修复特征和多途径选择,以及基于不同DSBs修复途径的基因编辑技术的研究进展,旨在为深入了解植物DSBs损伤响应及修复的分子机制和研发高效生物育种技术提供参考。

基于同源重组的CRISPR精准基因编辑技术及其在农作物育种中的应用

随着CRISPR基因编辑技术的出现,几乎在任何动植物细胞基因组的特定目标位点,DNA大片段的“无缝”插入或替换,均可在CRISPR核酸酶产生双链切口后,在供体DNA存在的情况下,诱导同源定向修复来实现。目前,这种基于同源重组的CRISPR精准基因编辑在农作物基因功能分析和新技术育种中正发挥着越来越重要的作用。围绕在植物细胞中高效实现同源重组介导的CRISPR精准编辑这一目标,简述CRISPR精准编辑依赖的两种主要的基于同源重组的细胞修复机制,即合成依赖的链退火修复机制和非同源末端连接辅助的单链退火修复机制;在此基础上,详述产生DNA双链切口并诱导同源重组定向修复的CRISPR核酸酶和供体DNA/RNA,主要包括Cas9/12及其融合蛋白、sgRNA/crRNA及其修饰物、供体DNA/RNA及其修饰物;进而总结在植物遗传转化中为保障DNA双链切口和供体DNA/RNA发生的时空一致性以提高同源重组效率,而通常采用的CRISPR组分及供体DNA/RNA细胞递送方式;最后从功能基因组学研究和农作物新技术育种等方面,展望基于同源重组的CRISPR精准基因编辑技术的应用前景。

子宫内膜癌同源重组修复缺陷相关基因表达及与临床病理特征、免疫浸润的关系

目的探究子宫内膜癌患者同源重组修复(HRR)缺陷相关基因表达及其与临床病理特征、免疫浸润的关系。方法回顾性选取2018年6月至2020年6月在山东第一医科大学附属人民医院进行手术治疗的子宫内膜癌患者53例(子宫内膜癌)为研究对象,另选取健康体检女性50例为健康对照组,收集53例子宫内膜癌患者临床病理特征,实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测研究对象外周血人乳腺癌易感基因1(BRCA1)、肿瘤抑制基因-第10染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)信使RNA(mRNA)表达水平,采用流式细胞仪检测外周血单核细胞中CD_(4)^(+)T细胞各亚群比例;Pearson分析外周血BRCA1、PTEN mRNA表达与CD_(4)^(+)T细胞各亚群的相关性;COX风险回归模型分析子宫内膜癌预后影响因素。结果子宫内膜癌组患者外周血BRCA1、PTEN mRNA表达水平均高于健康对照组(2.87±0.65比1.02±0.13、3.25±0.74比1.01±0.20),差异有统计学意义(P<0.01)。子宫内膜癌组患者外周血辅助性T细胞2(Th2)、辅助性T细胞17(Th17)、调节性T细胞(Treg)、辅助性T细胞22(Th22)比例明显高于健康对照组[(10.72±1.33)%比(5.43±0.80)%、(9.78±0.80)%比(3.31±0.62)%、(10.81±1.29)%比(5.74±0.69)%、(6.09±0.70)%比(3.09±0.73)%],辅助性T细胞1(Th1)比例明显低于健康对照组[(5.54±0.90)%比(13.07±2.55)%],差异有统计学意义(P<0.01)。肌层浸润深度≥1/2、组织学分级G_(2)-G_(3)、有淋巴结转移、国际妇产科学联合会(FIGO)分期Ⅲ~Ⅳ期的患者外周血BRCA1、PTEN mRNA表达水平明显高于肌层浸润深度<1/2、组织学分级G 1、无淋巴结转移、FIGO分期Ⅰ~Ⅱ期的患者,差异有统计学意义(P<0.01或<0.05)。外周血BRCA1、PTEN mRNA分别与Th2、Th17、Treg、Th22比例呈明显正相关(P<0.01),与Th1比例呈负相关(P<0.01)。COX风险回归分析结果显示,组织学分级、FIGO分期、肌层浸润深度、有淋巴结转移外周血BRCA1 mRNA表达、外周血PTEN mRNA表达均为子宫内膜癌预后独立影响因素(P<0.01或<0.05)。结论HRR缺陷相关基因BRCA1、PTEN mRNA在子宫内膜癌患者中呈现高水平,且与肌层浸润深度、组织学分级、有淋巴结转移、FIGO分期密切相关,并可通过影响子宫内膜癌患者的免疫微环境,进而影响疾病进展和预后。

X射线修复交叉互补基因功能的研究进展

对X射线修复交叉互补(XRCC)基因功能的研究极大地促进了对哺乳动物DNA损伤修复过程和遗传不稳定性致癌机制的理解。通过观察XRCC基因突变体的表型,可以对其功能进行鉴定。目前已鉴定的这一基因家族的多数成员均参与几种重要的DNA修复途径,包括碱基切除修复、同源重组修复和非同源末端重接。XRCC基因的鉴定及其在DNA损伤修复和维持遗传稳定性过程中发挥重要的作用。

利用CRISPR/Cas9系统检测同源片段长度对重组效率的影响

目的:在大肠埃希菌中利用CRISPR/Cas9系统对插入失活的m Cherry红色荧光报告基因进行靶向切割并重组,以研究同源片段长度对重组修复效率的影响。方法:通过Golden Gate克隆方法构建Cas9表达质粒p KD46-Cas,转化至大肠埃希菌DH5α中,阿拉伯糖诱导表达Cas9蛋白,Western blot检测蛋白表达。用同样的方法,将一段随机靶标序列引入p Tac-m Cherry-3guid质粒中,造成插入失活,同时在插入序列两侧分别预留0、40、80、120 bp的m Cherry编码区overlap序列,构建出含不同长度同源片段的插入失活m Cherry荧光报告质粒p Q0、p Q40、p Q80、p Q120,并将其分别转化到表达Cas9蛋白的大肠埃希菌DH5α中,对应的细菌平板分别为p Q0组、p Q40组、p Q80组及p Q120组,每组各9个平板,对每个平板的红、白色菌落进行计数,分别计算出红色菌落数/菌落总数的比值,即为重组修复效率。结果:PCR及测序证实p KD46-Cas质粒及插入失活的m Cherry荧光报告载体p Q0、p Q40、p Q80、p Q120构建成功,Western blot鉴定p KD46-Cas在大肠埃希菌DH5α中表达Cas9蛋白;红色菌落计数显示p Q0组为0,其余3组均出现红色菌落,4组重组修复效率的差异有统计学意义(P<0.05),重组修复效率与同源片段长度呈正相关(r=0.792,P<0.01)。结论:成功建立了基于m Cherry红色荧光报告基因和Cas9的同源重组效率检测系统;研究表明不包含同源片段的质粒无法进行有效的重组,当同源片段在0~120 bp时其长度对重组效率有影响。此系统为深入研究原核生物的同源重组提供了一个新的技术平台。

肿瘤转移相关基因1短式在大肠杆菌中的表达

目的构建肿瘤转移相关基因1短式(MTA1s)原核表达载体并诱导其蛋白表达,为后续MTA1s的相关研究奠定基础。方法取对数生长期的乳腺癌MCF-7细胞,提取细胞总RNA并反转录成cDNA,并以此为模板扩增MTA1s基因的蛋白编码区。采用一步克隆的方法将目的片段插入表达载体pET-28a(+)中并构建重组原核表达载体(命名为:pET-28a-MTA1s),将构建的重组载体用双酶切、菌液聚合酶链式反应(菌液PCR)、和测序进行鉴定。将pET-28a-MTA1s导入细菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达MTA1s重组蛋白,通过SDS-PAGE进行鉴定重组蛋白(MTA1s)表达情况以及蛋白免疫印迹分析(Western blot)鉴定重组蛋白(MTA1s)表达量。结果以MCF-7乳腺癌细胞为模板扩增出大小位置正确的片段;构建的pET-28a-MTA1s重组载体经双酶切、菌液PCR验证正确,DNA测序证实序列正确。考马斯亮蓝染胶和Western blot结果显示IPTG诱导表达的重组蛋白分子量正确且条带单一。结论成功构建pET-28a-MTA1s原核表达载体,为后续进行下游实验的研究奠定基础。