降解苯丙氨酸的工程益生菌构建及其喂养苯丙酮尿症小鼠的效果分析

苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)是一种常染色体隐性遗传病,低蛋白饮食是目前临床治疗的主要方法,而采用工程益生菌治疗尚处于研发阶段。为了探究工程益生菌对PKU的治疗效果,该研究基于大肠埃希菌Nissle 1917(EcN)菌株,构建了一株表达苯丙氨酸裂解酶的工程益生菌EcN-PAL。通过λ-Red同源重组系统在EcN中导入经优化设计的苯丙氨酸裂解酶基因,并通过体外降解实验和小鼠喂养实验验证其功能性。实验结果表明,工程益生菌EcN-PAL成功表达苯丙氨酸裂解酶,并且可降解苯丙氨酸和有效降低PKU小鼠的血液苯丙氨酸浓度。该研究成功构建的工程益生菌EcN-PAL对苯丙氨酸有良好的降解效果,动物实验证实可有效治疗PKU小鼠,为用于PKU患者的益生菌治疗奠定了基础。

小鼠MIP1-α重组腺病毒载体的构建及其在肝癌细胞中的表达

目的 :构建小鼠趋化因子 MIP1-α(m MIP1-α)的重组腺病毒载体并在小鼠肝癌细胞中表达 ,为肝癌基因治疗提供实验基础。 方法 :PCR扩增含有 m MIP1-α的质粒 ,将腺病毒骨架质粒 p Ad Easy- 1以及线性化的重组穿梭质粒 p Track- CMV-m MIP1-α共转化 BJ5 183受体菌并在其中发生同源重组 ,利用重组前后抗性的改变筛选出重组子 ,重组腺病毒质粒经过 2 93细胞的包装、扩增和纯化后 ,感染小鼠肝癌细胞株 Hepa1- 6 ,一步法提取细胞总 RNA,RT- PCR检测 m MIP1-α的 m RNA。琼脂糖凝胶打孔法体外观察感染上清中 m MIP1-α对小鼠脾细胞的趋化活性。 结果 :得到了携带 m MIP1-α的重组腺病毒 ,纯化后滴度为 4× 10 1 1 efu/ ml,在感染后的 Hepa1- 6细胞中检测到 m MIP1-α的表达 ,上清中 m MIP1-α的趋化指数为 6 .3。结论 :成功地构建了携带 m MIP1-α的重组腺病毒载体 ,为下一步应用于肝癌的基因治疗提供了基础。

禽致病性大肠杆菌CE129 Ⅵ型分泌系统主要亚单位基因hcp1、hcp2缺失株的构建与验证

为获得禽致病性大肠杆菌(APEC)CE129 Ⅵ型的hcp1、hcp2基因缺失株,本研究利用Red同源重组系统对APEC野生株CE129的Ⅵ型分泌系统(T6SS)hcp1和hcp2基因进行敲除,获得hcp1、hcp2基因单缺失株CE129△hcp1、CE129△hcp2和双缺失株CE129△hcp1△hcp2。将hcp1、hcp2基因分别克隆到表达载体pBR322和pACYC184中,构建相应的基因回补株CE129△hcp1/phcp1、CE129△hcp2/phcp2和CE129△hcp1△hcp22/phcp1phcp2。通过PCR特异性检测和基因测序显示,上述突变株与回补株均成功构建,且均能够稳定遗传。上述基因缺失株和回补株的成功构建,有助于深入了解APEC CE129菌株T6SS的作用机制,为进一步研究APEC的致病机理及其防控奠定了基础。

沙门氏菌sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpW表达的调控作用

为探究sRNA RybB和伴侣蛋白Hfq对沙门氏菌孔蛋白OmpW表达的调控作用,研究利用λred同源重组系统构建ompW基因lacZ融合菌株,再通过P22噬菌体转导技术构建颜色指示菌株中rybB和hfq相关基因的单缺失株、双缺失株,通过β-半乳糖苷酶活性试验和qPCR分析,确定sRNA RybB及伴侣蛋白Hfq对孔蛋白OmpW表达的调控作用。结果显示:成功构建了颜色指示菌株ΔompW∶∶LacZ和相对应的基因缺失菌株;与标准株LT2相比,ΔhfqY25A、ΔhfqK56A、Δhfq65、Δhfq87基因使ompW蛋白表达水平极显著下调(P<0.01),具有正调控作用,而Δhfq72、Δhfq∶∶tet、ΔrybB、ΔrybBΔhfq∶∶tet基因使ompW蛋白表达水平极显著上调(P<0.01),具有负调控作用;与标准株LT2相比,缺失hfq定点突变和rybB对ompW基因具有负调控作用。研究表明,沙门氏菌伴侣蛋白Hfq及RybB对孔蛋白ompW基因的蛋白表达水平和转录水平产生不同程度的影响,初步阐明了伴侣蛋白Hfq、sRNA RybB和靶基因三者的内在关系,为沙门氏菌减毒活疫苗与新型抗菌药物研制的研究奠定基础。

基于酿酒酵母的多片段质粒的构建

为避免现有的多片段质粒构建技术的弊端,提高多片段质粒构建效率,以构建树干毕赤酵母Agglutinin-like基因的敲除载体为例,利用酿酒酵母活体细胞重组系统,一次性将多个外源DNA片段和线性化质粒重组,形成环状质粒。通过引物设计在相互连接的DNA片段之间引入50bp重叠序列,用PCR扩增DNA片段后,与线性化质粒一起转化酿酒酵母,再用PCR和测序等方法鉴定阳性酵母菌落中质粒的正确性。通过本方法构建的多片段质粒正确率高、耗时短。

肠炎沙门氏菌tu-fA基因缺失株的构建及其生物学特性研究

为构建肠炎沙门氏菌(S.enterica)tu-fA基因缺失株及鉴定其生物学特性,本实验利用Red重组系统,以pKD3中的FRT-氯霉素抗性(cat^r)基因-FRT序列为模板,利用含有tu-fA基因两端序列的引物,经PCR扩增同源重组DNA片段(tu-fA5'-FRT-cat^r-FRT-tu-fA3'),将该DNA片段电转化于含有质粒pKD46的S.enterica SM6株中进行同源重组,通过氯霉素抗性筛选tu-fA基因缺失的SM6株(SM6△tu-f A::cat),再通过导入质粒pCP20于SM6△tu-fA::cat中敲除cat r基因,从而构建了tu-fA基因缺失株SM6△tu-fA。生物学特性鉴定结果表明,基因缺失株具有良好的遗传稳定性;与亲本株相比,细菌形态未发生明显改变,但基因缺失株体外生长速率略低,利用碳源的能力有所增强;缺失株侵袭Caco-2细胞的能力与亲本株相比有所降低,表明tu-f A基因编码的延伸因子(EF-Tu)在调控细菌侵袭细胞的过程中起着一定的作用。本研究通过构建tu-fA基因缺失的S.enterica株,为进一步研究tu-fA基因编码的EF-Tu的功能奠定基础。

产肠毒素大肠杆菌F4ac黏附素新基因sfm缺失株的构建及相关功能验证

为研究产肠毒素大肠杆菌菌株F4ac(F4ac^+ETEC)菌毛粘附素sfm基因的功能,本研究利用Red同源重组方法对F4ac+ETEC的sfm基因进行敲除,构建缺失株F4acΔsfm。再将sfm基因克隆到表达载体pACYC184中,获得重组质粒pACYC184-sfm,并转化至F4acΔsfm得到回补株F4acΔsfm/psfm。对ETEC野生菌、缺失株和回补株的生长曲线进行了测定和比较,结果显示sfm的缺失和回补对F4ac^+ETEC的生长没有影响;生物被膜定性和定量试验结果一致:均表明sfm在F4ac^+ETEC生物被膜形成的过程中作用不明显;血凝试验和甘露糖敏感性血凝试验结果显示3种类型的菌株均能够与2%猪血红细胞发生凝集反应,且该凝集现象能被D-甘露糖抑制。本研究为进一步研究sfm菌毛粘附素功能奠定了基础。

破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌BL21(DE3)的lpxM突变株构建

研究利用Red同源重组技术对常用大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)进行改良,构建破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌表达宿主菌,该菌株可望有助于解决因破菌时宿主菌染色体核酸释放给后续纯化重组蛋白工作带来的困难。将N端连有OmpA的信号肽的S.aureus nucleaseB(nucB)表达框整合至E.coli BL21(DE3)的lpxM位点,改造后菌株(称为BLN)经诱导能表达nucB、并分泌至周质空间,这样可使宿主核酸免受该酶"毒性"影响,菌体裂解后,nucB释放,能自动降解宿主核酸。BLN菌体生长状态以及表达外源重组蛋白的能力与出发菌基本一致。

大肠杆菌BL21(DE3)lpxM突变株的构建

目的:lpxM基因失活可以产生极低内毒素活性的脂多糖。构建大肠杆菌BL21(DE3)的lpxM突变株,并考察该突变株的生长状态和表达重组蛋白的能力。方法:构建同源臂长500bp左右的打靶载体,借助Red同源重组系统,使E.coliBL21(DE3)的lpxM基因发生插入失活,再导入编码FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20去除抗性基因。PCR鉴定发生插入突变的菌株,应用SDS-PAGE分析突变前后的脂多糖,考查对重组蛋白表达的影响。结果:PCR鉴定结果说明lpxM基因发生了插入突变。与出发株比较,突变株的脂多糖电泳图谱发生了明显变化,但其生长状态与表达重组蛋白的能力与出发株基本一致。结论:大肠杆菌BL21(DE3)的lpxM突变株可以用于重组蛋白的表达。

鼠伤寒沙门氏菌STM LT2 Hfq关键作用位点的分析

为探究伴侣蛋白Hfq与GcvB及其靶基因oppA可能存在的关键作用位点,本研究通过λ-Red同源重组技术构建Hfq远端面和近端面核心氨基酸的突变菌株及Hfq C-端截短菌株,在此基础上构建相应的Hfq-His6标签蛋白标签融合菌株。运用P22噬菌体转导技术构建相应的GcvB基因缺失菌株以及oppA::lacZ基因融合菌株。通过Western blotting试验检测Hfq蛋白水平,实时荧光定量PCR检测GcvB和oppA基因转录水平,β-半乳糖苷酶试验检测oppA蛋白水平。Western blotting结果显示,Hfq远端面和近端面核心氨基酸的突变及Hfq C-端的截短均不同程度地上调了Hfq蛋白水平。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,Hfq近端面核心氨基酸的突变使GcvB基因转录水平下调。β-半乳糖苷酶试验结果显示,与对照组相比,Hfq远端面和近端面核心氨基酸的突变及Hfq C-端的截短均未造成oppA基因转录水平的明显变化,但均不同程度地上调了oppA蛋白水平,其中Hfq近端面核心氨基酸突变及Hfq C-端分别截短至第65和72位氨基酸时oppA蛋白水平上调最为明显,分别上调了2.9、3.3和2.0倍。以上结果表明,Hfq近端面对于Hfq维持GcvB稳定性非常重要,Hfq近端面第56位氨基酸及Hfq C-端第65-87位氨基酸与oppA蛋白水平呈负相关。

沙门菌伴侣蛋白Hfq及RybB对外膜蛋白相关基因fadL、ompN、ybfM的作用

为了解RybB sRNA、RNA伴侣蛋白Hfq对沙门菌外膜蛋白fadL、ybfM、ompN的作用,利用λ-red同源重组系统构建fadL、ybfM、ompN基因lac融合菌株,通过P22噬菌体转导完成颜色指示菌株中RybB、hfq基因的单缺失与双缺失,进行β-半乳糖苷酶活性试验和qPCR,对其相应表达量进行分析.结果表明,Hfq抑制ybfM、ompN的表达,但fadL的表达上调;RybB sRNA抑制ompN、fadL的表达,但ybfM的表达上调.当Hfq与RybB共同对ybfM、fadL、ompN进行调控时,对ompN、ybfM的表达具有抑制作用,但fadL的表达上调,且Hfq的调控作用总体大于RybB.

利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联技术构建产肠毒素大肠杆菌LT敲除菌株

本研究旨在利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联的技术对产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K88的热不稳定性肠毒素(heat-labile toxin,LT)基因进行无痕敲除并获得K88 LT-缺陷菌株。通过序列比对获取LT两端同源序列,并构建包含LT边界、氯霉素筛选标记、sgRNA和LT同源臂的供体片段;将供体片段转化至ETEC K88,同时分别利用λ-Red同源重组系统和CRISPR/Cas9基因编辑系统,对LT基因进行敲除;通过PCR验证获得了K88 LT-缺陷菌株,并通过试验测定了敲除菌株的溶血能力和生长曲线。结果显示,λ-Red同源重组系统可成功地将LT基因替换为相应的供体片段,CRISPR/Cas9基因编辑系统可高效地对筛选标记进行删除,最终通过λ-Red和CRISPR/Cas9结合的基因编辑系统可成功对ETEC K88的LT基因进行无痕敲除。体外试验结果表明,K88 LT-缺陷菌株的溶血能力丧失,并且生长速度比野生型菌株减缓,LT可能和ETEC K88的致病能力和生长性能有关。表明λ-Red和CRISPR/Cas9级联的基因敲除方法可用于LT毒素基因及其他一些大肠杆菌基因的敲除。K88 LT-缺陷菌株的构建为下一步研究LT毒素的致病机制奠定基础。

鼠伤寒沙门菌伴侣蛋白Hfq与小RNA GcvB结合位点的初步分析

旨在探究Hfq与GcvB可能的作用结合位点,本研究首先筛查GcvB中Hfq结合偏好型富U基序。通过λ-Red同源重组酶系统构建GcvB富U基序突变或截短菌株,构建GcvB终止子茎延伸菌株。运用P22噬菌体转导技术构建相应的hfq基因缺失菌株以及oppA::lacZ基因融合菌株。通过qRT-PCR检测重组菌株的gcvB基因转录水平,β-半乳糖苷酶试验检测oppA基因编码蛋白水平。预测结果显示,GcvB存在2个Hfq结合偏好型富U基序U_(5)和U_(8)。qRT-PCR结果显示,U_(5)基序的突变未造成gcvB基因转录水平明显的变化,而gcvB基因转录水平随U_(8)基序的截短而下调,截短为U_(5)和U_(4)时下调最为明显,分别下调40.5%和37.5%。延伸U_(4)截短菌株的GcvB终止子茎,结果发现,gcvB基因转录水平几乎恢复到了对照组的水平,同时也发现,尽管U_(4)截短菌株gcvB基因转录水平得以恢复,却丧失了Hfq协同GcvB转录后负调控oppA mRNA的能力。以上结果表明,U_(5)基序与Hfq维持GcvB稳定性无明显关联。U_(8)基序对Hfq协助GcvB转录后负调控oppA mRNA以及维持GcvB稳定性是重要的,推测其为Hfq与GcvB的作用结合位点。

鼠伤寒沙门氏菌LT2 Hfq与fadL、ompN、ybfM mRNA 5′UTR结合位点的预测与验证分析

通过5′RACE技术分析fadL、ompN、ybfM mRNA的5′UTR,并筛查fadL、ompN、ybfM mRNA 5′UTR中Hfq结合偏好型基序(ARN)n.利用λ-Red同源重组酶和FLP重组酶系统构建fadL、ompN、ybfM基因(ARN)n基序缺失基础上的lacZ基因融合菌株,运用P22噬菌体转导技术构建相应的hfq基因缺失菌株,通过β-半乳糖苷酶试验检测重组菌株的蛋白水平.结果显示,fadL中筛选出ARN-1(AAAAAA)、ARN-2(AAAAATAAT),其缺失降低了fadL的蛋白表达量,分别降低72%、56%;ompN中筛选出ARN-1(GTTTTT)、ARN-2(TCTTTT)、ARN-4(TTTGCT),其缺失提高了ompN的蛋白表达量,分别提高了1.29、1.30、1.07倍,ARN-3(ATTATT)缺失使ompN的蛋白表达量降低了10%;ybfM中筛选出ARN-1(AAGAGG)、ARN-2(AGCAAT)、ARN-3(AGTAAA)、ARN-4(AAAAATAGT)、ARN-5(AACAGAAAG),其缺失均增加了ybfM蛋白水平变化,分别为4.20、3.99、10.90、227.00、46.00倍.结果表明,ybfM、ompN、fadL中(ARN)n位点不同缺失能导致ybfM、ompN、fadL表达水平出现上调或下调,部分(ARN)n序列缺失可影响Hfq对相应靶基因蛋白水平调控作用.

Red系统三种蛋白在哺乳动物细胞核中定位表达的设计和构建

目的:构建在哺乳动物细胞核中同时定位表达Red系统三种蛋白的载体。方法:通过给red基因(gam、bet和exo)的3,端分别加入由7个氨基(pro-lys-lys-lys-Arg-Lys-val)组成的核定位信号序列(nuclear localization signal,NLS)和4个甘氨酸构成的linker序列,再从λ噬菌体基因组中,通过PCR技术分别扩增到C端均都带有NLS的gam、bet和exo的DNA全长序列,将三种PCR产物依次克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,得到含3个目的基因(gam-NLS、bet-NLs和exo-NLS)的三顺反子表达载体pCMV-gNIbNIxN,转染培养的哺乳类细胞后,用作者制备并纯化的抗Red3种蛋白的抗体进行间接免疫荧光检测,观察蛋白的定位情况。结果:不带有NLS的Red3种蛋白在细胞中表达主要集中在细胞质很少进入细胞核;而带有NLS的Red3种蛋白于不同时间转染人和鼠的两种细胞后,均表达定位于细胞核中。结论:三顺反子表达载体pCMV-gNIbNIxN的成功构建为进一步探索将λ噬菌体的red系统用于哺乳动物细胞的基因替代打下基础。

鼠伤寒沙门菌孔蛋白ompW、ompS、ompD基因突变株的构建及生物学特性分析

为探究孔蛋白基因ompW、ompS、ompD对鼠伤寒沙门菌的生物学特性及毒力的影响,本研究利用λ-Red同源重组系统构建相应突变株,通过检测生长曲线、泳动性、生化特性、体外遗传稳定性、生物被膜形成能力、耐药性、以及半数致死量(LD_(50))来比较鼠伤寒沙门菌标准菌株与各突变株之间的区别。结果显示,相比标准株,ompD和ompW基因突变株对细菌生长速率和运动能力影响较小,而ompS基因突变株的生长速率和运动能力则明显降低;3个突变株均不影响鼠伤寒沙门菌的生化特性,也不影响遗传稳定性,但能不同程度影响其对多种常用抗生素的敏感性,且均导致成膜能力极显著下降(P<0.01);LD_(50)毒力测定中,3个突变株毒力均导致鼠伤寒沙门菌的毒力下降,其中ompS基因突变株毒力下降最明显,LD_(50)为标准菌株的25倍。综上所述,孔蛋白ompW、ompS、ompD基因突变能影响鼠伤寒沙门菌的部分生物学特性。本研究结果为进一步研究孔蛋白ompW、ompS、ompD基因的生物学功能及沙门菌致病性奠定了试验基础。

鼠伤寒沙门氏菌Ⅵ型分泌系统相关基因敲除及其功能特性

Ⅵ型分泌系统(T6SS)是大多数革兰氏阴性细菌中都存在的一种重要的分泌系统,能介导细菌与细菌之间以及细菌和宿主细胞之间的相互作用,溶血素共调节蛋白(Hcp)和缬氨酸甘氨酸重复蛋白G(VgrG)是组成T6SS穿刺装置的重要组分。但鼠伤寒沙门氏菌Ⅵ型分泌系统的Hcp与VgrG在该菌入侵宿主细胞及抗吞噬过程中发挥的作用尚不十分清楚。【目的】本研究旨在利用基因敲除技术构建的鼠伤寒沙门氏菌hcp及vgrg基因缺失株体外接种真核上皮细胞和巨噬细胞,并以其亲本株作为对照,以研究Hcp及VgrG在该菌粘附、侵入上皮细胞及抗吞噬过程中所发挥的作用。【方法】通过优化Red同源重组系统操作过程中各个条件,建立一套快速敲除鼠伤寒沙门氏菌Ⅵ型分泌系统相关基因的操作系统,成功构建鼠伤寒沙门氏菌CVCC541的hcp及vgrg单基因缺失株、双基因缺失株及三基因缺失株,并用Hela细胞接种试验和菌落计数试验,评估不同菌株的粘附和侵袭能力;用小鼠巨噬细胞RAW 264.7接种试验,评估不同菌株的抗吞噬能力。【结果】与亲本株CVCC541粘附侵袭Hela细胞相比,基因缺失株CVCC541Δvgrg、CVCC541Δhcp2Δvgrg和CVCC541Δhcp1Δhcp2Δhcp3的粘附率分别为17.17%±2.1%、14.73%±2.5%和82%±3.7%;CVCC541Δvgrg、CVCC541Δhcp2Δvgrg和CVCC541Δhcp1Δhcp2Δhcp3的侵袭率分别为7.05%±1.05%、6.21%±1.35%和87%±3.25%;与亲本株CVCC541在小鼠巨噬细胞RAW 264.7中的存活相比,基因缺失株CVCC541Δvgrg、CVCC541Δhcp2Δvgrg和CVCC541Δhcp1Δhcp2Δhcp3的存活率分别为15.67%±2.9%、14.47%±1.87%和56.12%±3.48%。【结论】鼠伤寒沙门氏菌Ⅵ型分泌系统VgrG和Hcp对该菌入侵细胞和抗吞噬方面具有重要作用,该研究为鼠伤寒沙门氏菌通过六型分泌系统与宿主细胞相互作用的机制研究奠定了基础。

大肠杆菌基因组基因无痕敲除的优化方法

目的:优化大肠杆菌基因组基因无痕敲除的方法,提高无痕敲除的效率。方法:以无痕敲除大肠杆菌nanKETA基因簇为模型,利用Red同源重组系统和核酸内切酶I-SceI的筛选作用,通过两步连续同源重组无痕敲除大肠杆菌CLM37基因组中的nanKETA基因,优化无痕敲除时同源DNA长度与诱导用于筛选阳性克隆I-SceI表达的诱导剂浓度。通过比较敲除nanKETA基因前后菌株的生长曲线,研究大肠杆菌CLM37缺失nanKETA基因后的生长状态。结果:成功无痕敲除大肠杆菌CLM37基因组中的nanKETA基因,并在无痕化处理时,通过延长与基因组同源DNA的长度,由通常使用的80碱基对延长到684碱基对;并通过提高诱导筛选基因表达的四环素的浓度,由500μg/ml提高到1000μg/ml后,使无痕敲除效率高达90%以上。生长曲线研究表明,缺失nanKETA基因后的菌株生长状态与原菌株基本一致。结论:通过延长与基因组同源的双链核苷酸的长度和诱导筛选基因表达的四环素的浓度可显著提高无痕敲除的效率。

禽致病性大肠杆菌clpV基因缺失株的构建及其对Ⅰ型菌毛主要基因表达的影响

为研究禽致病性大肠杆菌(APEC)六型分泌系统(typeⅥsecretion system,T6SS)clpV基因对Ⅰ型菌毛表达的影响,本研究利用Red同源重组系统构建了禽致病性大肠杆菌clpV基因缺失株TW-XM△clpV。将clpV基因克隆到表达载体pBR322中,构建相应回补株TW-XMC△clpV。通过PCR特异性检测和基因测序,验证上述突变株均构建成功,且能稳定遗传。利用荧光定量PCR检测野生株、clpV缺失株和回补株中Ⅰ型菌毛9个主要基因的mRNA相对表达量。结果显示:与野生株相比,缺失株中fimC、fimF、fimG、fimI的mRNA相对表达量显著下降,fimB、fimD、fimE极显著下降,fimA与fimH则无统计学意义;而回补株各基因的mRNA相对表达量均得到了恢复。本研究表明clpV基因缺失影响了Ⅰ型菌毛的表达。本研究有助于了解T6SS与Ⅰ型菌毛合成的关系,为进一步研究APEC的致病机理奠定基础。