厌氧表达乳酸脱氢酶以提高大肠杆菌产D-乳酸光学纯度

【目的】为解决在D-乳酸工业发酵生产中使用农业粗加工或废弃物等廉价原料(含有少量L-乳酸)而导致终产物D-乳酸光纯降低的问题。【方法】构建了带有不同启动子的L-乳酸脱氢酶基因lldD的表达质粒:pUC19-PLD(PpflBp6)、pUC19-NLD(PnirB)及pUC19-PNLD(PpflBp6-PnirB),并将它们分别转化入大肠杆菌D-乳酸工程菌HBUT-D中,得到菌株HBUT-D3、HBUT-D5和HBUT-D7。通过LldD的酶活检测以及对NBS培养基(添加1 g/L L-乳酸)发酵结果的TOPSIS多元评估,优选出可快速去除L-乳酸且不影响D-乳酸发酵的菌株,并使用农业廉价原料进行发酵。【结果】HBUT-D7的LldD比酶活为64 U/g,L-乳酸的消耗速率为34 mg/(L·h),D-乳酸的生产强度为4.09 g/(L·h),综合评估为最优菌株。以玉米浆为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7的L-乳酸消耗速率分别为10.41 mg/(L·h)及34.75 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为4.24 g/(L·h)及3.87 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为99.07%及99.92%。以糖蜜为原料进行发酵时,HBUT-D及HBUT-D7的L-乳酸消耗速率为6.87 mg/(L·h)和17.18 mg/(L·h);D-乳酸生产强度分别为1.93 g/(L·h)及1.88 g/(L·h);D-乳酸光学纯度分别为99.22%及99.99%。【结论】厌氧诱导启动子的表达质粒可提高菌株HBUT-D7的L-乳酸脱氢酶酶活,使其在使用廉价原料发酵时能有效消除L-乳酸,提高发酵终产物D-乳酸的光学纯度。

鼠李糖乳杆菌L-乳酸脱氢酶的生物信息学分析和基因克隆

本研究以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)L-乳酸脱氢酶(Lr-L-LDH)为研究对象,以研究较多的Lr-L-LDH1为对照,对基因组注释的两个Lr-L-LDH1和Lr-L-LDH2基因,进行异同分析。采用在线网站和专业软件对Lr-L-LDH1和Lr-L-LDH2的一级结构、基本特性、亲疏水性、二级结构进行分析和预测,对三级结构进行同源建模以及酶和底物的分子对接分析,并对酶的编码基因进行系统发育分析,克隆表达及酶活性检测。结果显示:相较于Lr-L-LDH1,Lr-L-LDH2有着相似的分子特性,二级和三级结构,但Lr-L-LDH2编码序列短,氨基酸序列同源性低(48.08%),有不同的进化地位;Lr-L-LDH2也含有乳酸脱氢酶催化活性位点序列和保守的NAD^(+)结合位点序列(GXGXXG),能够形成典型的活性三维口袋域,是NAD^(+)依赖型四聚体结构L-乳酸脱氢酶,在细胞中需要果糖1,6-二磷酸(FBP)来激活,催化丙酮酸还原为L-乳酸;体外克隆表达和酶学分析表明,Lr-L-LDH2酶活力极显著低于Lr-L-LDH1(P<0.01)。Lr-L-LDH1和Lr-L-LDH2都具有乳酸脱氢酶活性,推测二者在乳酸表达调控中相互作用,对鼠李糖乳杆菌L-乳酸脱氢酶的分子改造应同时考虑Lr-L-LDH1和Lr-L-LDH2的作用,研究对乳酸发酵工业的基因工程改造提供分子基础和科学依据。

重组L-乳酸脱氢酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性研究

乳酸脱氢酶是生物法转化苯丙酮酸为苯乳酸的一种有效的酶。实验克隆到一种新型L-乳酸脱氢酶基因ldhL,来源于Lactobacillus plantarumSK-2(植物乳杆菌SK-2),GenBank接受号为FJ392647。以pET-22b(+)为载体质粒,E.coliBL21(DE3)为宿主细胞,构建了基因重组菌,IPTG可诱导目的蛋白的过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分析,约在37ku处出现显著的特征蛋白条带;重组LDH的比酶活为0.06U/mg。

乳酸片球菌L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

与其它微生物相比,用大肠杆菌进行发酵生产乳酸有许多优势,但大肠杆菌没有L乳酸脱氢酶基因,不能利用糖发酵生产L乳酸.本文采用PCR技术,以乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)基因组DNA为模板,克隆得到L乳酸脱氢酶(Llactatedehydrogenase)基因,将该基因的ORF连接到表达质粒pET22b(+),获得重组质粒pETldhL.将pETldhL质粒转化大肠杆菌BL21株,实现了ldhL基因的表达;对含有ldhL基因的重组菌株进行表达研究,在30℃以IPTG诱导8h后,SDSPAGE分析可见明显特异性条带,酶活力达到6.49u/mL,是野生菌酶活力(2.82u/mL)的2.3倍.对重组表达的L乳酸脱氢酶生物学特性研究显示,它们的最适反应温度为27～30℃,最适反应pH为5.0～5.3.

棉子酚、吡喹酮、蒿甲醚对重组日本血吸虫乳酸脱氢酶的作用

目的检测棉子酚、吡喹酮、蒿甲醚对重组日本血吸虫乳酸脱氢酶(rSjLDH)活性的影响。方法在已建立的rSjLDH标准酶活性测定体系中分别加入不同浓度的棉子酚(0～0.10mmol/L)、吡喹酮(0～0.20mmol/L)及蒿甲醚(0～0.10mmol/L),以相应药物溶剂作对照,分光光度法测定药物对rSjLDH活性的影响。用SPSS13.0软件统计结果,计算药物对酶活性的相对抑制率。结果与对照组比较,0.04mmol/L棉子酚对rSjLDH催化丙酮酸还原为乳酸及乳酸氧化为丙酮酸的相对抑制率分别为59.1%和34.4%(P<0.01),0.10mmol/L棉子酚分别为91.3%和89.1%(P<0.01);0.06mmol/L吡喹酮分别为5.77%和41.4%(P<0.05),0.20mmol/L吡喹酮分别为83.8%和72.2%(P<0.01)。0.10mmol/L蒿甲醚对rSjLDH则无抑制作用(P>0.05)。结论棉子酚及吡喹酮对rSjLDH活性均有显著的抑制作用,SjLDH可能是吡喹酮的分子靶标之一。

L-乳酸脱氢酶基因克隆及功能分析

构建了一株产D ,L_乳酸的乳杆菌 (Lactobacillussp .)MD_1的基因文库。利用乳酸脱氢酶和丙酮酸裂解酶缺陷的EscherichiacoliFMJ14 4作为宿主 ,通过互补筛选分离克隆到乳酸脱氢酶基因 (ldhL)。核酸序列分析表明 ,该基因以ATG为起始密码子编码 316个氨基酸残基组成的蛋白质 ,预测的分子量为 33 84kD ;5′端存在典型的启动子结构 ,3′端的终止子是不依赖于 ρ因子的转录终止子。ldhL编码的蛋白质有 3个保守区域 ,其中Gly13～Asp5 0保守区域是NADH的结合位点 ,Asp73～Ile10 0和Asn12 3～Arg15 4保守区是酶的活性部位。该ldhL和其他乳杆菌的ldhL基因和编码的氨基酸序列相似性较低 ,核苷酸序列相似性最高仅为 6 4 1% ,氨基酸序列相似性最高仅为 6 8 9% 。

牛链球菌L-(+)-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达

利用PCR方法从牛链球菌(Streptococcus bovis)基因组DNA中扩增出了L(+)乳酸脱氢酶基因(ldh),并将其连接到表达载体pSE380上,得到重组质粒pSEldh,将重组质粒转化到大肠杆菌菌株JM109。利用SDS-PAGE分析ldh表达产物的分子量为36KD,重组菌株的乳酸脱氢酶酶活力为168.2U/mL,最适反应温度25℃,最适作用pH为5.0,重组质粒的稳定性达99.9%。

嗜热菌的耐热 L-乳酸脱氢酶的研究

从广东各地的热温泉(55—95℃)水样中,分离到200余株最适生长温度高于70℃的极端嗜热菌。其中一株编号为 HG25,具有耐热胞内 L-乳酸脱氢酶(L-Lactate dehydrogenase EC.1.1.1.27.,简称 LDH),有栖热菌属(Thermus)的特征,革兰氏阴性,无芽孢,好氧,不运动,产黄色素,最适生长温度为65—75℃,最高生长温度为85℃,最低为40℃,不水解淀粉,不从葡萄糖产酸,DNA 的 G+C 百分含量为65mol%,L-乳酸脱氢酶经硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素柱层析作了初步提纯,比活提高7倍,LDH 还原丙酮酸反应的最适温度为60℃,最适pH为8.0,酶在70℃稳定,保温10分钟后,仍保留85%的原始酶活力。失活半寿期(t_(1/2))为85℃10分钟。

一个产生L-乳酸脱氢酶的嗜热菌的新种——非解朊栖热菌

从广东省阳江、电白和韶关等地55—95℃的温泉中采集水样,经分离得到21株 G^-、不产生芽孢的高温菌。它们都能产生 L-乳酸脱氢酶。根据表观特征,DNA 的同源性和 G+Cmol%等特征可归入栖热菌属(Thermus)。但对葡萄糖不产酸和不液化明胶等表型特征不同于已发表的种。又根据该群内的 DNA/DNA 杂交结果,有高的同源性(大多在80%以上),而与已发表的种仅有40.5—70.7%的同源性。结果表明可成立一独立的类群,建议为栖热菌属的一个新种,因具不液化明胶的特性,命名为非解朊栖热菌(Thermus nonproteolyticus Cai & Yangsp.nov.)。以菌株 HG-42为模式株,保藏于中国科学院微生物研究所。

兔抗人乳酸脱氢酶C4(LDHC4)多克隆抗体制备与应用

目的 制备兔抗人乳酸脱氢酶C4(LDHC4)的多克隆抗体。方法 采用PCR点突变LDHC基因,并将该基因构建到pET-28a载体上,形成pET-28a-LDHC重组表达载体、将重组载体转化至大肠杆菌表达宿主BL21(DE3),诱导表达获得重组人LDHC4蛋白,将重组蛋白作为抗原免疫新西兰兔,3次加强免疫后得到抗血清,采用ELISA检测抗血清效价,采用Western blot法检测抗血清的特异性,采用免疫组织化学法检测人三阴性乳腺癌组织中LDHC4的表达。结果 获得了特异性的兔抗人LDHC4多克隆抗体,抗体效价达1∶51 200,该抗体可用于Western blot法和免疫组织化学法。结论 成功制备了特异性兔抗人LDHC4多克隆抗体。

L-乳酸脱氢酶生产菌的选育及产酶条件

从泡菜汁中筛得一株胞内L 乳酸脱氢酶(L LDH)活性较高的植物乳杆菌RS2 2,采用亚硝基胍和超声波同时作用进行诱变,使其比活力由3.48U/mg提高到7.49U/mg,并对突变株的产酶条件进行了研究.

L-乳酸脱氢酶抑制剂抑制成因的探讨

应用 HF/3 21G研究了抑制剂 H2N－ CO－ COO－对 L乳酸脱氢酶的抑制成因 .结果表明 ,酶被抑制的主要原因有 :(1)抑制剂与底物的稳定构象态在结构上极为相似 ,导致酶不能有效识别底物 ;(2)模型抑制剂各原子所带净电荷的优势使抑制剂更易与酶活性中心结合 ;(3)抑制剂通过对酶的诱导契合作用使酶活性中心的空间被缩小 ;(4)对活性中心有关结构的分析表明 ,底物的甲基分子片以及酶的氨基酸残基 Gln 102,对催化反应能否顺利进行 ,影响极大 .

蒿甲醚、血红素及Fe^3＋对重组日本血吸虫乳酸脱氢酶(rSjLDH)作用的初步研究

目的检测蒿甲醚、血红素及Fe3+对rSjLDH的抑制作用,探讨蒿甲醚抗血吸虫幼虫可能的作用机制。方法在获得rSjLDH及建立标准酶活性测定体系的基础上,在标准酶活性测定体系中加入不同浓度的蒿甲醚、血红素及Fe3+,以药物相应的溶剂作为对照,测定药物对酶活性的影响。结果与相应对照组相比较,0.1 mmol/L的蒿甲醚对rSjLDH催化丙酮酸还原为乳酸及乳酸氧化为丙酮酸的反应无抑制作用(P>0.05);血红素对rSjLDH有极强的抑制作用,在0.015mmol/L时,rSjLDH催化乳酸氧化反应的活性被完全抑制(P<0.01),在浓度为0.02 mmol/L时,rSjLDH催化丙酮酸还原为乳酸的反应被抑制93.48%(P<0.01);0.1mmol/L蒿甲醚配伍0.004mmol/L血红素未发现对rSjLDH的抑制;Fe3+对rSjLDH有较强抑制作用,0.5mmol/L时rSjLDH催化正、逆反应的活性被完全抑制(P<0.01)。结论蒿甲醚对rSjLDH无抑制作用;血红素对rSjLDH有极强的抑制作用;蒿甲醚与血红素未发现有配伍作用;Fe3+对rSjLDH有较强的抑制作用。提示蒿甲醚不直接作用于SjLDH,血红素是SjLDH的强抑制剂,其在蒿甲醚作用机制中的作用需进一步研究。

米根霉L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

文章以米根霉基因组DNA为模板,根据已公布的米根酶L-乳酸脱氢酶基因(ldnL)序列设计引物,PCR扩增得到含有ldnL的DNA片段;PCR产物T/A克隆后再双酶切,将ldnL片段连接到大肠杆菌表达载体pET17b,得到重组表达质粒pET17b-ldnL;pET17b-ldnL转化大肠杆菌BL21(DE3),摇瓶培养诱导表达后的菌体经SDS-PAGE电泳分析,结果表明克隆的ldnL基因在大肠杆菌中实现表达。

过量表达乳酸脱氢酶的重组干酪乳杆菌构建及发酵性能

乳酸脱氢酶(LDH)是干酪乳酸菌(L.casei)合成L-乳酸途径中的关键酶,通过构建过量表达乳酸脱氢酶的重组干酪乳杆菌,提高干酪乳杆菌发酵产乳酸的能力。根据干酪乳杆菌乳酸脱氢酶的基因序列设计引物,PCR扩增获得乳酸脱氢酶基因(ldh),将其连接到乳酸杆菌穿梭质粒pMG36e,构建重组质粒pMG-ldh,电转入L.casei,利用红霉素MRS平板筛选阳性克隆,获得表达乳酸脱氢酶的重组菌L.casei pMG-ldh,SDS-PAGE和酶活分析结果表明成功表达了一个约37kD的乳酸脱氢酶蛋白,重组酶活力最高达95U/mL,较原始菌23U/mL提高了近3.1倍。为进一步提高其产乳酸能力,添加4mmol/L激活剂FBP和8mg/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)前体物烟酸,结果表明:重组菌L.caseipMG-ldh乳酸积累128.2g/L,生产强度达到3.04g/(L.h),较原始菌株L.casei分别提高了35%和53%,发酵周期缩短6h。

变形链球菌乳酸脱氢酶基因及同源区的克隆和序列分析

目的 :克隆变形链球菌乳酸脱氢酶基因 (ldh)及其两侧同源区基因片段。方法 :应用PCR技术扩增乳酸脱氢酶及其两端同源区序列片段 ,插入克隆载体pMD18-T中 ,转化大肠杆菌DH5α ,Amp+ 抗性挑选阳性克隆 ,经酶切及PCR鉴定后进行序列测定。结果 :PCR扩增产物特异 ;抗性筛选的 4株菌落均为阳性克隆 ;用DNASIS将序列测定的结果与基因Bank中报道的序列对比分析 ,同源性为 99.1%。结论 :根据同源性分析的结果 。

不对称还原苯丙酮酸的L-乳酸脱氢酶L-LcLDH2的表达及生物信息学分析

以干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增一种L-乳酸脱氢酶(L-LcLDH2)的编码基因Lcldh2;借助表达质粒pET-28a(+)将Lcldh2在大肠杆菌BL21(DE3)中实施异源表达。实验结果表明,细胞超声破碎液中L-LcLDH2催化苯丙酮酸的酶活性为47 U/mg总蛋白质;采用重组E.coli/Lcldh2全细胞催化苯丙酮酸还原,所获产物L-苯乳酸的对映体过量(eep)值>99%。生物信息学分析表明,Lcldh2开放阅读框长906 bp,编码含301个氨基酸的L-LcLDH2,预测其相对分子质量和等电点分别为32585和5.5;L-LcLDH2含有典型的NAD+结合位点序列(GXGXXG),属于NAD依赖型L-乳酸脱氢酶,且是一种非分泌、非跨膜、无信号肽和定位于细胞质的酶蛋白。L-LcLDH2的获得为生物法制备高光学纯L-苯乳酸提供了新的酶源。

米根霉生产L-乳酸过程中乳酸脱氢酶对发酵产生的影响

研究了米根霉发酵生产Ｌ－乳酸过程中培养条件对乳酸脱氢酶和Ｌ－乳酸发酵水平的影响，着重讨论了乳酸脱氢酶活力对Ｌ－乳酸发酵水平的关系。

间日疟原虫安徽地域株乳酸脱氢酶基因序列同源性分析

采集安徽省蚌埠市区、五河县、怀远县、蒙城县和利辛县2009-2010年的39例间日疟患者血样,分别提取DNA,PCR扩增间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)基因,并克隆测序,以及Blast序列分析。结果显示,克隆的PvLDH基因片段为951 bp。序列分析发现,采自安徽地区的39例间日疟患者血样的PvLDH基因序列之间无差异(登录号为GU078391),与GenBank中其他地域株的PvLDH基因序列同源性均>99%,氨基酸序列仅分别与EJEU60134株和MIA061251株存在1个氨基酸的差异。

强化厌氧表达dld基因以提高大肠杆菌工程菌发酵产L-乳酸的光学纯度

为去除廉价发酵原料中的D-乳酸从而提高发酵最终产物L-乳酸的光学纯度,该研究通过构建带有不同厌氧诱导启动子(pflBp6、pnirB、pflBp6-pnirB)的D-乳酸脱氢酶基因(dld)的表达质粒,并将其分别转入大肠杆菌(Escherichia coli)HBUT-L,加强其在发酵产L-乳酸的同时消除外源D-乳酸的能力。通过装液量与转速的单因素试验筛选最优的质粒表达条件及菌株,并在无机盐培养基与玉米浆培养基中进行发酵验证。结果表明,在装液量为200 mL/250 mL、转速为150 r/min的条件下,含有启动子pflBp6-pnirB的表达质粒的工程菌株HBUT-L4发酵18 h时D-乳酸脱氢酶活力最高,为81.1 U/g。在此条件下进行无机盐培养基和玉米浆培养基发酵时,工程菌株HBUT-L4相对于出发菌株HBUT-L,D-乳酸消耗速率分别提高250%、217%,L-乳酸的光学纯度分别从96.32%、98.48%提升至99.95%、99.98%。在大肠杆菌工程菌发酵L-乳酸的过程中,带有厌氧诱导启动子pflBp6-pnirB的表达质粒可提高D-乳酸脱氢酶活力,强化菌株消除外源D-乳酸,进而提高L-乳酸的光学纯度的能力,具有重要的工业化应用价值。