同种异体反应性细胞与调节性T细胞在新生期诱导的小鼠移植耐受中的作用探讨

目的:初步探讨同种异体反应性T细胞克隆清除与调节性T细胞在小鼠移植耐受中的作用。方法:雌性BALB/c小鼠与雄性C57BL/6小鼠杂交一代获得F1小鼠,不同剂量的F1小鼠脾脏细胞经眶静脉输注给新生24 h C57BL/6小鼠体内诱导耐受,成年后移植F1小鼠来源的皮肤,建立不同耐受程度的小鼠移植耐受模型;耐受小鼠脾脏细胞经CFSE标记后注射到F1小鼠体内,分析耐受小鼠来源的T细胞在体内对F1抗原的增殖能力;流式细胞术、过继转移实验分析CD4+Foxp3+调节性T细胞在移植耐受和移植排斥过程中的表达。结果:C57BL/6小鼠在新生期输注F1小鼠脾脏细胞可诱导移植耐受,耐受程度与输注的脾脏细胞剂量有关,3×107个F1小鼠脾脏细胞可诱导C57BL/76小鼠长期皮肤移植耐受,1×107个细胞诱导可使移植皮肤生存时间显著延长,但在50 d内完全排斥;体内混合淋巴细胞反应实验证明,长期耐受小鼠体内的同种异体反应性T细胞被完全克隆清除,但低剂量组小鼠体内仍存在一定数量的反应性T细胞;流式细胞分析发现,高剂量和低剂量组小鼠体内的CD4+Foxp3+调节性T细胞表达与初始小鼠相比没有显著差异;同种异体反应性T细胞过继转移给耐受小鼠,移植耐受的皮肤发生排斥反应,小鼠体内的调节性T细胞表达升高。结论:小鼠的移植耐受程度与小鼠体内的同种异体反应性T细胞的克隆清除程度有关,与CD4+Foxp3+调节性T细胞的表达没有直接关系;调节细胞在移植排斥过程中表达升高,可能作为一种反馈机制参与耐受的形成。

同种CTL识别表位的抗原肽非依赖性现象

目的初步探讨细胞毒T细胞(CTL)对同种抗原的识别机制。方法用负载特定肽的T2细胞与HLA-A2阴性个体的外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes,PBL)共培养,激活同种反应性CTL,通过乳酸脱氢酶(LDH)释放法观察同种反应性CTL对不同载肽T2细胞的杀伤活性。结果用负载特定抗原肽的T2细胞诱导所获得的同种反应性CTL对负载不同抗原肽的T2细胞及空载T2细胞具有同等杀伤效应。结论同种反应性CTL对同种MHC分子的识别不依赖抗原肽。

杀伤性人工抗原提呈细胞治疗小鼠皮肤移植排斥及其对治疗鼠整体免疫功能的影响

目的:研究杀伤性人工抗原提呈细胞(Ka APC)治疗小鼠皮肤移植排斥的效果及其对治疗鼠整体免疫功能的影响。方法:利用可生物降解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微米球做载体,共价吸附H-2Kb抗原和anti-Fas等负性调节分子,制备针对同种反应性T细胞的特异性Ka APC,治疗以C57BL/6和BALB/c为供受对的小鼠皮肤移植排斥,并利用混合淋巴细胞培养观察治疗鼠对第三方供体的同种反应能力以及通过载瘤实验观察治疗鼠的抗肿瘤能力等,以论证Ka APC治疗对机体整体免疫功能的影响,帮助筛选有效治疗方案。结果:成功制备Ka APC,FACS验证其有正确的表型;Ka APC输注使皮肤移植物的存活时间明显延长,P<0.000 1,但并未显著损伤治疗鼠T细胞对第三方供体鼠脾细胞的同种增殖能力,也并未显著损伤治疗鼠的抗肿瘤能力。结论:Ka APC可以抑制小鼠皮肤移植排斥并对治疗鼠的整体免疫功能无明显损伤。

通过Fas-FasL途径体外清除小鼠同种异体反应性T细胞

目的 通过Fas Fas配体 (FasL)途径清除小鼠同种异体反应性T细胞 (ARTC) ,为减轻异基因骨髓移植 (allo BMT)后的移植物抗宿主病探索新的手段。方法 用磁性细胞分离系统分离BALB c小鼠 (H 2 d)Sca 1+早期造血细胞 (HC) ,然后借助逆转录病毒基因转移技术对其转染外源小鼠FasL(mFasL)cDNA基因 ;扩增 1周后与异基因BAC小鼠 (H 2 d ×b)脾细胞进行单向混合淋巴细胞培养(OWMLC) 6d ,观察处理后的BAC小鼠脾细胞对Na251 CrO4标记的BALB c小鼠脾细胞的杀伤作用。结果 成功分离出BALB c小鼠Sca 1+HC ,纯度为 (89.0± 6 .1) %。BAC小鼠脾细胞与转染外源mFasL的BALB cHC以 1∶5比例共培养 6d后 ,对BALB c源脾细胞杀伤率在不同效、靶比例时均呈显著降低 (P<0 .0 1)。结论 体外反应中 ,转染外源mFasLcDNA并高表达的早期HC可清除针对自身MHC抗原的ARTC。

自身肽结合于HLA-A2分子上能够在体外诱导抗原肽特异性的同种T细胞

在同种反应性T细胞(同种T细胞)识别的配体中,抗原肽的作用是免疫学长期争论的问题,即同种T细胞识别是否具有抗原肽特异性.为了证实通过长期混合淋巴细胞培养(LTMLC)方法能够诱生抗原肽/MHC复合物(pMHC)特异性的同种T细胞,本研究利用仅表达HLA-A2,TAP缺陷的T2细胞,将酪氨酸激酶来源的自身抗原肽(Tyr369-377)和EB病毒来源的病毒抗原肽(LMP2A426-434)分别加载到T2细胞上,使T2细胞提呈单一的T细胞抗原识别表位,并且选择4个HLA-A2阳性(HLA-A2+ve)与4个HLA-A2阴性(HLA-A2-ve)个体的PBL样本,与加载上述抗原肽的T2细胞混合培养.在此实验系统中,HLA-A2+ve PBL与加载病毒抗原肽的T2细胞(T2/LMP)混合培养代表T细胞对普通抗原的反应,而HLA-A2-ve PBL与加载自身抗原肽的T2细胞(T2/Tyr)混合培养则为T细胞对同种抗原的反应.利用特异性pMHC四聚体染色与特异性细胞毒试验检测LTMLC诱生CTL的特异性,其中利用HIV抗原肽(Gag77-85)作为对照.结果显示:(ⅰ)T2/LMP与HLA-A2+ve个体的PBL混合培养产生CTL(CTL-T2/LMP),CTL-T2/LMP对T2/LMP的杀伤显著高于对照T2/HIV的杀伤(26.52%±3.72%vs7.01%±0.87%,P<0.001);LMP四聚体对CTL-T2/LMP染色的阳性细胞数显著高于对照HIV四聚体(0.98%±0.33%vs0.05%±0.01%,P=0.0014);(ⅱ)加载自身抗原肽的T2细胞(T2/Tyr)可诱导HLA-A2-ve个体的PBL产生CTL(CTL-T2/Tyr),CTL-T2/Tyr对T2/Tyr的杀伤显著高于对T2/HIV的杀伤(28.07%±2.58%vs6.87±1.01%,P<0.001);Tyr四聚体对CTL-T2/Tyr染色的阳性细胞数显著高于HIV四聚体(0.88%±0.3%vs0.06±0.03%,P=0.0018).结果说明:结合于自身MHC分子上的病毒抗原肽与结合于同种MHC分子上的自身抗原肽都能诱导产生抗原肽特异性的CTL;在LTMLC诱生的同种CTL中,有相当数量的CTL具有pMHC特异性,这些同种CTL的识别机制与普通抗原反应性CTL一样,识别的对象也是特异性的pMHC.支持了同种抗原的pMHC种类繁多造成同种T细胞反应强度极高的假说.利用LTMLC诱生抗原肽特异性同种T细胞方法对于T细胞过继治疗具有潜在的应用价值.

CD4＋Foxp3＋调节性T细胞表达升高提示免疫应答而非移植耐受

目的 探讨诱导CD4＋Foxp3＋调节性T细胞（regulatory T cells ，Tregs）表达的机制及其在移植耐受中可能的作用。方法 构建新生移植耐受小鼠动物模型，分析移植耐受与同种异体反应性T细胞、Tregs表达及嵌合体的关系；运用过继转移实验、EGFP转基因小鼠，研究移植排斥过程中Tregs表达及抗原特异性。结果 新生耐受小鼠形成嵌合体，同种异体反应性T细胞被克隆清除，但Tregs表达与初始小鼠相同；同种异体反应性T细胞识别抗原诱导免疫反应，Tregs在移植排斥反应中表达升高，且不仅同种异体反应性Tregs表达升高，非同种异体反应性Tregs表达也升高。结论 Tregs在移植排斥中非特异性诱导产生，可能为一种负反馈免疫调控机制。

新生期移植耐受依赖嵌合体的形成

目的研究新生期移植耐受机制，探讨免疫系统发育程度、嵌合体在诱导移植耐受中的作用。方法雄性C57BIM6（或GFP-C57BL／6）小鼠与雌性BALB／c小鼠杂交获得F1（或GFP—F1）小鼠，不同剂量F1或GFP—F1小鼠脾脏细胞（辐照处理的细胞作为对照）静脉注射到新生24hC57BL／6小鼠体内诱导耐受，6周后皮肤移植、混合淋巴细胞反应实验检测小鼠耐受程度，流式细胞分析小鼠外周血细胞嵌合程度。结果具有增殖活性的F1小鼠脾脏细胞可诱导新生C57BL／6小鼠嵌合体和针对F1小鼠皮肤移植物的特异性耐受；辐照处理的F1小鼠脾脏细胞不能诱导嵌合体，也没有耐受产生；长期耐受小鼠的嵌合程度明显大于慢性排斥小鼠的嵌合程度（分别为6．48％±4．02％和1．57％±0．89％），两组间的差异具有统计学意义；供体细胞剂量高则诱导小鼠的耐受程度高，3×10^7剂量F1小鼠脾脏细胞可诱导80％的小鼠长期耐受，0．7×10^7剂量诱导仅使移植物生存时间轻度延长。结论新生期移植耐受依赖嵌合体的形成，嵌合体使同种异体反应性T细胞特异性克隆清除。

移植器官体积对小鼠皮肤移植物生存时间影响的实验研究

目的 探讨移植器官体积对移植器官生存时间的影响.方法 C57BL/6小鼠与BALB/c小鼠杂交获得F1小鼠,1.5×107个F1小鼠脾脏细胞输注给新生C57BL/6小鼠;混合淋巴细胞反应检测体内同种异体反应性T细胞的克隆清除;Na（i）ve（初始）C57BL/6小鼠和新生期处理的C57BL/6小鼠移植F1小鼠皮肤,皮片大小分别为0.5 cm2和1 cm2,观察皮片的生存时间.结果 新生期C57BL/6小鼠输注F1小鼠脾脏细胞后体内同种异体反应性T细胞数量显著减少,对移植抗原的反应性减弱;Na（i）ve小鼠迅速排斥F1小鼠皮肤移植物,0.5 cm2和1 cm2组皮肤移植物的生存时间分别为（8.9±1.0）d和（9.3±1.0）d,两组间差异没有统计学意义（P＞0.05）;新生期处理的C57BL/6小鼠移植F1小鼠皮肤,1 cm2组皮肤移植物生存时间为（63±28）d,大于0.5 cm2组皮肤移植物（28±16）d,两组间差异具有统计学意义（P＜0.05）.0.5 cm2组皮肤移植物在60d内完全排斥,1 cm2组皮肤移植物在100 d时仍有部分存活,形成长期耐受.结论 降低移植受体排斥强度的同时增加移植器官的体积可延长移植器官的生存时间.