移植前选择性去除同种异体反应供者淋巴细胞预防移植物抗宿主病的实验研究

目的探讨在移植前选择性去除同种异体反应的供者淋巴细胞预防移植物抗宿主病（GVHD）的效果。方法以（BALB／c×C57BL／6）F1雌性小鼠（H-2^d/^b）为受鼠，于第0天接受亚致死量的^60Co γ射线全身照射（TBI），总剂量为4Gy，第1天接种P388D1白血病细胞，第2天输注由C57BL／6雄性小鼠（H-2^b）为供鼠提供的不相匹配的供者脾淋巴细胞，第6天再次TBI 9Gy，第7天输注由（BALB／c×C57BL／6）F1雄性小鼠（H-2^d/^b）提供的骨髓造血干细胞。结果以TBI选择性去除同种异体反应供者淋巴细胞组的小鼠无白血病和GVHD的发生，生存期超过了210d。对照组的小鼠出现了明显的GVHD、白血病或因出血、感染导致的死亡，生存期短，为20～36d（P〈0．01）。结论在造血干细胞移植前输注不相匹配的供者淋巴细胞诱导移植物抗白血病（GVL）效应，然后再选择性去除同种异体反应的供者淋巴细胞来预防GVHD的发生是可行的。

测定同种异体反应中分泌细胞因子的T淋巴细胞及其临床意义初探(英文)

本研究目的是测定同种异基因外周血单个核细胞 (PBMNCs)刺激后分泌不同细胞因子的T淋巴细胞水平并对其临床意义进行研究 ,以建立一种监测同种异体反应性T淋巴细胞的新方法。首先 ,利用新颖的细胞因子分泌检测方法 (CKSA)从单细胞水平定量测定了人混合淋巴细胞反应后分泌IFN γ ,IL 4和IL 10的T淋巴细胞水平 ;然后根据上述实验结果 ,分析 2例接受异基因骨髓移植后发生急性移植物抗宿主病 (aGVHD)的患者外周血中分泌IFN γ的T细胞水平。结果表明 :经同种异体PBMNCs刺激后分泌IFN γ的T淋巴细胞水平显著升高 [(1.12± 0 .13) % ],而分泌IL 4和IL 10的T淋巴细胞则无升高 ,分别为 (0 .12± 0 .0 3) %和 (0 .10± 0 .0 3) %。患者外周血分泌IFN γ的T淋巴细胞水平和aGVHD的发生及严重程度有一定的相关性。结论 :利用CKSA从单细胞水平定量测定同种异体PBMNCs刺激后分泌IFN γ的T淋巴细胞水平的技术具有临床应用价值 ,可以应用于对aGVHD的识别。

TBI和环磷酰胺选择性去除同种异基因反应供者淋巴细胞的研究

本研究用全身照射(TBI)和环磷酰胺(CY)选择性去除同种异基因反应的供者淋巴细胞,为预防移植物抗宿主病(GVHD)的发生探索新的手段。以(BALB/c×C57BL/6)F1雌性小鼠(H-2d/b)为受鼠,于第0天接受亚致死量的60Co-γ射线全身照射,总剂量为4Gy,第1天接种P388D1白血病细胞,第2天输注由C57BL/6雄性小鼠(H-2b)为供鼠提供的MHC不匹配的供者脾淋巴细胞,在造血干细胞移植前诱导移植物抗白血病效应(GVL)。第6天腹腔注射环磷酰胺(CY)200mg/kg或再次TBI9Gy,选择性去除同种异基因反应供者淋巴细胞,第7天输注(BALB/c×C57BL/6)F1雄性小鼠(H-2d/b)提供的骨髓造血干细胞。结果显示:以CY和TBI选择性去除同种异基因反应供者淋巴细胞组的小鼠无白血病和GVHD的发生,生存期超过了210天,于移植后第21天出现完全供者嵌合,然后嵌合率下降,第90天表现为混合嵌合体(MC)。对照组的小鼠出现了白血病和GVHD,出血、感染明显,生存期短,为20-36天(P<0.01)。结论:同基因骨髓移植前输注不相匹配的供者脾细胞诱导GVL效应,然后再通过TBI和CY选择性去除同种异基因反应的供者淋巴细胞来预防移植物抗宿主病(GVHD)的发生是可能的。

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4诱导新鲜异体骨移植免疫耐受的实验研究

目的 利用外源性细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 ( cytotoxic T lymphocyte- associated antigen 4immuno globlin,CTL A4 - Ig)阻断T细胞反应的第2信号,诱导新鲜同种异体骨移植免疫耐受。 方法 采用近交系小鼠BAL B/C 6 6只作为骨移植的受体,进行异位肌袋一次及第2次骨移植。一次移植分为3组,每组18只,一组移植C5 7BL/6小鼠骨骼,注射L6 (对照品) ,为AL组;一组移植C5 7BL/6小鼠骨骼,注射CTL A4 - Ig,为AC组;一组移植同系BAL B/C小鼠骨骼,注射PBS缓冲液,为AB组。在第2、4及6周,进行血淋巴细胞亚群分析,血清抗体测定,供体细胞及抗原二次刺激实验及组织学观察。另取12只BAL B/C小鼠,进行第2次移植实验,供体为C5 7BL/6小鼠的骨骼,注射CTL A4 - Ig后2周,分别移植C5 7BL/6 ( BC组)和C3H( BH组)小鼠的骨骼,检测产生免疫耐受的特异性。 结果 AL组与AB组比较,产生了强烈的免疫排斥反应,移植后2、4及6周,CD4 T细胞的增殖明显增加( P<0 .0 5 ) ,血清抗体明显增多( P<0 .0 5 ) ,供体细胞及骨抗原二次刺激的细胞增殖也明显增加( P<0 .0 5 ) ;AC组免疫排斥反应较轻,在CD4 T细胞的增殖、血清抗体及二次刺激的细胞增殖方面均与AB组相似( P>0 .0 5 ) ;组织学观察也显示,异体骨周围的淋巴细胞浸润消失,软骨诱导及新骨形?

猪软骨细胞同种异体移植的免疫排斥机制

目的探讨猪软骨细胞同种异体移植的免疫排斥机制。方法分离制备猪软骨细胞和淋巴细胞 ,采用同种异体软骨细胞—淋巴细胞混合培养反应和IFN γ诱导比较分析 ,经3 H TdR法观察淋巴细胞刺激指数 ,FACS测定软骨细胞表面猪白细胞抗原(SLA)分子表达变化 ;不同时间收集混合反应中淋巴细胞 ,分别应用PCR和ELISA技术分析其表达的IFN γ、IL 4mRNA和蛋白含量。结果成功制备了猪的软骨细胞和淋巴细胞 ,软骨细胞表达SLAI类分子 ,而不表达SLAII类分子 ;同种异体软骨细胞对淋巴细胞有轻微刺激扩增作用 ,经IFN γ诱导具有明显增强作用。混合培养 ,18h后上清中可检测到IFN γ蛋白 ,而IL 4表达无变化。结论软骨细胞SLAI类分子刺激同种异体淋巴细胞产生IFN γ,进一步诱导软骨细胞SLAII类分子表达 。

猪同种异体肾移植术前组织配型方法探讨

同种异体器官移植及建立器官移植模型术前进行严格组织配型有利于减少免疫学因素的影响,使受体和移植物长期存活。由于目前没有成熟的猪组织配型方法及试剂,我们模拟人器官移植方法选择供受体建立猪同种异体肾移植模型。从23头四川白猪中选择ABO血型相同、ABO血交叉配血反应阴性、微量淋巴细胞毒反应(CDC)、阴性单向混合淋巴反应(MLR)相对较低的同胞猪共6对(1例只作供体)为供受体行单肾原位移植,另一侧肾切除。5例组织相容性较低(MLR在2175～3560之间,CDC计分在1～4分之间),其中2例于术后第2d死于手术打击,2例术后第4d分别死于急性肾小管坏死和加速性排斥反应,1例术后1周死于急性肾小管坏死。6例组织相容性较高(MLR在982～1916之间,CDC计分在2～4分),其中1例死于手术麻醉,3例分别于术后2周死于加速排斥和急性排斥,1例术后肾功能良好,另1例术后发生轻微排斥反应,而后肾功能恢复正常。提示模拟人组织配型方法选择供受体可以建立猪同种异体肾移植模型。通过ABO血型、交叉配血、CDC及MLR实验筛选成功地避免了超急性排斥反应的发生。但从本实验数据中很难分析该配型方案在避免加速型排斥反应、急性排斥反应和慢性排斥的作用,进一步的实验仍在研究之中。

树突状细胞在角膜移植排斥反应中的免疫调节机制的探讨

目的观察自体未成熟树突状细胞(iDC)对于小鼠同种异体角膜移植的免疫调节作用,探讨其作用机制。方法PBS或自体iDC尾静脉注射7d后,采用双色免疫荧光染色法及流式细胞术分析小鼠脾脏中CD4+CD28+及CD4+CTLA-4+ T细胞的表达。PBS或自体iDC尾静脉注射7d后进行小鼠同种异体角膜移植,临床观察两组植片的存活时间。结果iDC注射后,脾脏中CD4+CD28+ T细胞的比例下降(P<0.01),而CD4+CTLA-4+ T细胞比例明显升高(P<0.01)。iDC经尾静脉注射后明显延长了同种异体角膜移植片的存活时间(P<0.01)。结论iDC可诱导CD80/CD86-CTLA-4抑制型共刺激信号替代CD80/CD86-CD28信号通路,从而阻断协同刺激信号的传递及T细胞的活化,对于同种异体角膜移植排斥反应具有免疫抑制作用。

同种异体复合组织移植Banff移植病理学诊断标准及进展

同种异体复合组织移植(CTA)是一门新兴的用于治疗功能性组织或肢体缺损的移植学科,由于绝大多数CTA移植物为带血管的移植物,因此也称为带血管的复合组织移植(VCA)。CTA/VCA的移植物包含同种异体的皮肤、皮下组织、骨骼、肌肉、神经和血管等两种或多种组织结构成分。由于大多数CTA/VCA移植物中带有皮肤组织,而皮肤组织是抗原性最强的免疫成分,移植术后的急性排斥反应是导致CTA/VCA移植失败及其移植物失功的首要障碍,因此CTA/VCA移植物中的皮肤排斥反应的组织病理学特征成为首要的关注点。本文就CTA/VCA的排斥反应等病理学特征、2007年Banff诊断标准及其研究进展予以综述,以期为CTA/VCA的排斥反应及其他并发症的诊断及治疗提供参考。

同种异体反应性淋巴细胞克隆疫苗回输诱导受体特异性免疫耐受的研究

目的 探讨同种异体移植抗原特异性免疫耐受诱导的新途径 ,以达到心肺移植长期存活的目的。方法 以同种异体反应性淋巴细胞克隆在体外培养条件下大量增殖后 ,作为自身独特性疫苗 ,体内注射免疫家兔 ,以混合淋巴细胞反应来观察免疫前和免疫后对供体淋巴细胞刺激指数 (SI)的变化。结果 同种异体反应性自身独特型淋巴细胞疫苗具有显著诱导特异性免疫应答移植现象 ,SI值显著降低 (P <0 .0 5) ,而对卡介苗诱导的特异性免疫应答并未因独特型淋巴细胞疫苗的应用而下降。结论 同种异体反应性自身独特型淋巴细胞疫苗有可能成为诱导抗原特异性免疫耐受的一种手段。

脂肪干细胞免疫学性状的初步实验观察

目的初步研究脂肪干细胞(Adiposederivedstemcells,ADSC)表面免疫分子的表达以及体外免疫调节功能,以期为组织工程提供同种异体种子细胞来源。方法体外培养人脂肪抽吸术中获取的脂肪干细胞,体外培养至第二代,流式细胞仪检测免疫分子HLA、HLA、B7-1、B7-2、CD40的表达。1×105个/孔ADSC细胞分别刺激单一异体淋巴细胞或混合双向淋巴细胞反应,观察淋巴细胞增殖情况。同时观察ADSC经IFN-γ作用后,免疫分子表达与淋巴细胞增殖的调节情况。结果ADSC表达HLA类分子,但未检测到HLA类分子阳性表达。B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD28、CD40未见明显阳性表达。人IFN-γ刺激48h后,HLA类分子表达明显增高,HLAI表达未见明显增高。异体或经IFN-γ作用的ADSC均未能刺激异体淋巴细胞增殖。同样数量的ADSC可明显抑制双相混合淋巴细胞增殖,经IFN-γ作用后抑制作用未见明显减弱。结论ADSC具有一定的体外调节淋巴细胞反应的能力,有可能成为组织工程同种异体细胞来源。

酶联免疫斑点法研究小鼠急性移植物抗宿主病模型中产生干扰素γ细胞的水平

目的:探讨异基因小鼠混合淋巴细胞反应(M LR)和急性移植物抗宿主病(aGVHD)模型中,供者针对受者细胞反应后产生干扰素-γ细胞(IFN-γPC)的水平。方法:在近交系MHC不合的异基因小鼠脾细胞M LR和aGVHD模型中,用酶联免疫斑点法(EL ISPOT)对供者针对受者细胞反应后IFN-γPC的水平及其影响因素进行了研究。结果:在异基因小鼠脾细胞M LR后,用EL ISPOT检测到IFN-γPC显著升高,具有针对受者细胞的特异性。在异基因小鼠aGVHD模型中,重度aGVHD小鼠脾细胞与未移植的异基因受鼠脾细胞在M LR后,IFN-γPC较中度aGVHD明显升高,无aGVHD药物预防组较预防组IFN-γPC明显升高,并具有针对受者细胞的特异性,与aGVHD的临床评分相一致。结论:用EL ISPOT可以快速而敏感地检测异基因小鼠脾细胞M LR中的同种异体反应,并和aGVHD的程度以及病程具有相关性。

健康人外周血树突状细胞诱导培养及鉴定

【目的】从健康人外周血中分离出单个核细胞(PBMC),经体外诱导培养获取树突状细胞(DC)并鉴定其表型。【方法】应用 GM-CSF、IL-4、TNF-α等细胞因子自外周血单个核细胞诱导扩增,培养出 DC,动态观察细胞形态,流式细胞仪检测其表面标志,采用混合淋巴细胞培养法检测其刺激同种异体淋巴细胞增殖能力。【结果】经诱导培养出具有典型特征的 DC,高表达 CD86、CD80,DC 特征性标志 CD1a 平均为49.28%,在体外能诱导强烈的同种异体混合淋巴细胞增殖反应。【结论】该方法能可靠地诱导培养出 DC,为 DC 的进一步研究提供实验依据。

成人外周血来源的树突状细胞的体外诱导

目的:以外周血单核细胞为前体细胞,建立体外诱导树突状细胞(dendriticcell,DC)的方法。方法:用密度梯度离心法、贴壁法从健康人外周血获取单核细胞,加入IL-4、GM-CSF和TNF-α培养7～9d成为DC,进行细胞形态学、表面标志及混和淋巴细胞反应(mixedlymphocytereaction,MLR)的鉴定。结果:外周血单核细胞经诱导培养后,具有典型的树突状形态特征,表达高水平的MHC-II类抗原和CD86共刺激分子以及多种表面标志,在MLR中能有效地刺激同种异体的淋巴细胞增殖。结论:外周血单核细胞可以成功地诱导为具有典型形态特征及功能的DC。

脂肪干细胞HLA分子表达与体外抑制淋巴细胞增殖的实验研究

目的研究脂肪干细胞(adiposederivedstemcells,ADSCs)表面免疫分子的表达以及体外调节淋巴细胞反应的功能,以期为组织工程提供同种异体种子细胞来源。方法从临床脂肪抽吸术丢弃脂肪组织中分离获取脂肪干细胞(共3例),体外培养至第2代,流式细胞仪检测免疫分子HLAI、HLAII的表达。1×105个/孔ADSC细胞刺激异体淋巴细胞,观察细胞增殖情况。以植物血凝素(PHA,2μg/ml)刺激淋巴细胞后,分别以(1×102、1×103、1×104、1×105)细胞/孔数量的异体脂肪干细胞加入反应体系中,观察淋巴细胞增殖情况;另一组在刺激同时加入白介素2(IL2,0.5ng/ml),检测脂肪干细胞抑制作用的逆转。分别以1×102～5细胞/孔数量的“第三者”脂肪干细胞或经IFNγ作用后脂肪干细胞加入混合双向淋巴细胞反应体系中,观察淋巴细胞增殖抑制情况。结果脂肪干细胞表达HLAI类分子,但未检测到HLAII类分子阳性表达。人IFNγ刺激48h后,HLAI表达未见明显增高,HLAII类分子表达明显增高。异体或经IFNγ作用的脂肪干细胞均未能刺激淋巴细胞体外增殖。脂肪干细胞可明显抑制PHA刺激的淋巴细胞增殖,IL2可逆转脂肪干细胞的抑制作用。脂肪干细胞可明显抑制双相混合淋巴细胞反应,抑制作用呈脂肪干细胞细胞数量依赖性;经IFNγ作用后抑制作用未见明显减弱。结论ADSC可在体外抑制淋巴细胞增殖反应,具有一定的调节淋巴细胞反应的能力,有可能成为组织工程或细胞治疗中同种异体细胞来源。

吲哚胺2,3-双加氧酶基因修饰BMSCs在大鼠同种异体复合组织移植免疫排斥反应中的作用研究

目的探讨吲哚胺2，3-双加氧酶（indoleamine2，3-dioxygenase，IDO）基因转染修饰大鼠BMSCs对同种异体复合组织移植免疫排斥反应的影响及其机制。方法以IDO过表达慢病毒IDO[绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）1-Lenti转染供体4～6周龄BN大鼠来源的第3代BMSCs，筛选目的基因高表达、具有生物活性的细胞株IDO-BMSCs。行RT-PCR、Westernblot检测基因修饰前后BMSCs中IDOmRNA及蛋白表达，通过测量培养上清犬尿氨酸生成量检测IDO生物学活性。在混合淋巴细胞反应体系中以IDO-BMSCs、反应细胞（受体4～6周龄LEWIS大鼠来源外周血单个核细胞）和刺激细胞（供体BN大鼠来源外周血单个核细胞）混合培养，细胞比例分别为1：5：5、1：10：10、1：50：50及1：100：100（实验组1、2、3、4）：每个反应体系另设IDO阻断孔，加入1mmol／LIDO特异性抑制剂1-甲基色氨酸（1-methyl．tryptophan，1-MT）；以IDO-BMSCs与反应细胞（1：5）培养为阴性对照组，刺激细胞与反应细胞（1：1）培养为阳性对照组，IDO-BMSCs在RPMll640培养基中单独培养作为空白对照组。于培养5d，采用MTT法检测T淋巴细胞增殖情况。进一步制备大鼠同种异体肢体移植模型，将GFP-BMSCs（A组）、IDO-BMSCs（B组）及生理盐水（C组）分别经尾静脉输入移植模型，观察移植物存活时间及免疫排斥反应。结果基因修饰后，BMSCs中IDOmRNA及蛋白表达显著提高。IDO-BMSCs较GFP-BMSCs可明显提高培养上清中犬尿氨酸含量（P〈0．05）。加入1-MT前，实验组1、2、3的T淋巴细胞增殖率随IDO-BMSCs与反应细胞比例逐渐减少而不断增加，组间比较差异均有统计学意义（P〈0．05）；实验组4的T淋巴细胞增殖率与阳性对照组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。加入1-MT后，除实验组4的T淋巴细胞增殖率与加入前比较差异无统计学意义（P〉0．05）外，其余各实验组均高于加入前（P〈0．05）。体内输入后，IDO—BMSCs可在移植物内定植，抑制免疫排斥反应的发生；A、B、C组移植物存活时间分别为（11．5±0．6）、（14．5±0．8）、（9．0±0.3）d，B组存活时间明显长于A、C组，A组长于C组（P〈0．05）。结论ID0-BMSCs可促进大鼠同种异体复合组织移植物的成活，其机制与抑制T淋巴细胞增殖、促进BMSCs向移植物内定植有关。

阻断第二信号诱导骨移植后对淋巴细胞亚群的抑制作用

目的 研究细胞毒性T淋巴细胞相关抗原 (CTLA4Ig)对新鲜同种异体骨移植后血淋巴细胞亚群的影响。方法 在组织相容性抗原完全不同的两组小鼠间进行异位骨移植 ,于移植后第 0、1天 ,腹腔注射CTLA4Ig 10 0 μg ,分别于术后 2、4、6周取受体外周血 ,利用流式细胞仪技术测定血淋巴细胞亚群CD4 和CD8。结果 术后第 2周 ,骨移植对照组CD4 亚群 (64 .2 6± 5 .69)和CD4 /CD8比值 (4.98± 0 .5 9)较同系对照组 (49.5 0± 2 .3 2 ,6.96± 0 .5 7)明显升高 (P <0 .0 1,P <0 .0 5 ) ,术后第 4周 ,骨移植对照组CD4 亚群 (62 .48± 3 .78)较同系对照组 (5 4.5 1± 3 .44)仍明显升高 (P <0 .0 5 ) ,术后第 6周时 ,各组间淋巴细胞亚群差异已无显著性 (P >0 .0 5 ) ;同种异体骨移植后注射CT LA4Ig组 (第 2周 5 3 .3 7± 4.17,第 4周 5 5 .3 7± 3 .0 6)与注射对照剂组 (第 2周 64 .2 6± 5 .69,第 4周62 .48± 3 .78)比较 ,CTLA4Ig明显抑制了CD4 亚群的增殖 (P <0 .0 5 ) ,与同系骨移植组相似。结论 利用CTLA4Ig阻断第二信号 。