同种异体脱细胞神经支架复合脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子转染骨髓间充质干细胞桥接受损坐骨神经

目的:探讨同种异体脱细胞神经支架(CEANA)复合脑源性神经营养因子(BDNF)和睫状神经营养因子(CNTF)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)桥接修复周围神经缺损的优缺点及可行性。方法:取2只成年雄性犬的骨髓进行BMSCs的分离、培养。取传代培养的第3代细胞,采用电转法将重组表达载体pIRES-BDNF、pIRES-CNTF和pIRES-BDNF-CNTF转染至BMSCs。细胞转染后分成5组,采用反转录半定量PCR(RT-PCR)检测各组BMSCs的BDNF和CNTF的mRNA表达水平;采用免疫印迹检测其蛋白表达水平。取3只雄性实验犬,分离双侧坐骨神经,化学法制备CEANA。取15只雄性实验犬制备坐骨神经缺损模型,随机分为CEANA+BDNF组、CEANA+CNTF组、CEANA+BDNF+CNTF组、CEANA组(采用8cm CEANA端端吻合缺损的坐骨神经)、CEANA+BMSCs组。术后16周观察各组实验犬移植段神经横断面轴突数目、比目鱼肌的动作电位、双侧坐骨神经传导速度的差异。结果:手术后前3组实验犬的切口愈合良好。手术后第8周,前3组的髓鞘厚度、有髓神经纤维总数为CEANA+BDNF+CNTF组>CEANA+CNTF组>CEANA+BDNF组,CEANA+BDNF组和CEANA+CNTF组比较差异有统计学意义。结论:CEANA复合BDNF和CNTF转染BMSCs桥接移植修复犬坐骨神经缺损有良好的作用。

脱细胞同种异体神经移植物修复大鼠坐骨神经缺损的实验研究

目的 观察脱细胞处理的同种异体神经移植物修复大鼠坐骨神经缺损的作用。 方法 用组织工程学方法制备的大鼠同种异体神经移植物桥接大鼠坐骨神经缺损 ,并对再生神经进行电生理学功能测试 ,光镜、电镜观察移植物内的再生神经 ,并进行统计分析。 结果 术后 13周内 ,动物未见炎症及排斥反应。用脱细胞处理的同种异体神经移植物修复神经缺损 ,再生神经的传导功能、纤维数量、轴突直径、有髓纤维占有的面积与自体神经移植对照及计量学上统计分析均无显著性差异。 结论 脱细胞处理的同种异体神经移植物具有良好的组织相容性 ,它对缺损的坐骨神经再生有促进作用。

种植施万细胞的脱细胞同种异体神经移植物对大鼠坐骨神经缺损的修复作用

目的观察种植施万细胞的脱细胞同种异体神经移植物,桥接大鼠坐骨神经缺损后的神经再生。方法应用酶反复消化法与差速贴壁法体外分离培养乳鼠施万细胞;显微注射法将施万细胞种植到脱细胞同种异体神经移植物内;再应用种植施万细胞的脱细胞同种异体神经移植物桥接大鼠坐骨神经10 mm缺损。光镜、透射电镜和扫描电镜观察再生神经的形态结构、有髓神经纤维数量、平均髓鞘厚度并进行统计学分析。结果光、电镜观察到实验组(SCs+ARSN)的施万细胞在再生神经纤维中互相连结纵行排列成类似Büngner带样细胞链,对照组(ARSN)未见到施万细胞的链状排列。实验组再生有髓神经纤维的髓鞘厚度较对照组均匀且较厚,有髓神经纤维数量和平均髓鞘厚度明显多于对照组(P<0.05)。结论种植施万细胞的脱细胞同种异体神经移植物对缺损的坐骨神经再生有更加有效的促进作用。

KLF7对小鼠脱细胞异体神经支架移植后运动功能的影响

目的:探讨核转录因子KLF7对脱细胞异体神经支架(ANA)移植修复坐骨神经缺损后小鼠运动轴突再生和运动功能恢复的影响。方法:制作C57BL/6小鼠坐骨神经缺损模型,用ANA进行桥接修复,在ANA注射腺相关病毒2(AA2)或腺相关病毒2-KLF-7(AAV2-KLF7,2μl,1×10^(11)病毒颗粒)。于修复术后4周,Western Blot和免疫荧光染色检测ANA内KLF7蛋白表达,NF和S100免疫荧光染色检测ANA内轴突再生和髓鞘生成,神经示踪剂荧光金(FG)逆行标记检测运动轴突再生,坐骨神经运动功能指数(SFI)和电生理检测运动功能的恢复。结果:AAV2-KLF7注射ANA后4周,ANA内KLF7蛋白表达显著增高,NF和S100表达显著增加,FG阳性标记脊髓运动神经元的数量增加,坐骨神经功能指数增加,电生理动作电位波幅增大,潜伏期缩短(P<0.05)。结论:KLF7促进小鼠脱细胞异体神经支架修复坐骨神经缺损后运动轴突再生和髓鞘形成,有助于运动功能恢复。

BDNF在脱细胞同种异体神经移植物修复神经缺损后不同组织中的表达

目的探讨脱细胞同种异体神经移植物(ANA)修复大鼠坐骨神经缺损后促神经再生的分子作用机制。方法将36只Wistar大鼠随机分成6组:正常对照组,自体移植组,桥接2,4,8,12周组,每组6只,分别观测患侧L4脊髓及胫前肌内脑源性神经营养因子(BDNF)蛋白及mRNA表达。结果ANA桥接大鼠坐骨神经缺损后2周患侧脊髓内BDNF表达增高,4周时达高峰,持续到8周,然后逐渐降低,12周时仍显著高于正常对照组,与自体移植组相比无差异。而患侧胫前肌最初4周内逐渐降低,然后逐渐升高,12周时达到正常水平,与自体移植组相比无差异。BDNF mRNA的表达基本与蛋白表达一致。结论ANA具有良好的组织相容性,也许可替代自体神经修复大鼠坐骨神经长距离缺损,此作用可能与上调脊髓BDNF蛋白及mRNA表达有关。

ChABC联合脂肪源性干细胞对大鼠脱细胞异体神经支架移植后功能恢复的影响

目的:探讨硫酸软骨素酶ABC(chondroitinase ABC,ChABC)与脂肪源性干细胞(Adipose-derived stem cell,ADSC)联合应用对脱细胞异体神经支架移植修复坐骨神经缺损后大鼠运动和感觉功能恢复的影响。方法:成年大鼠随机分为脱细胞坐骨神经(acellular rat sciatic nerve,ARSN)组、ChABC组、ADSC组、ChABC+ADSC组;应用坐骨神经功能指数(SFI)、电生理和胫前肌湿重比检测神经再生和运动功能的恢复;脊神经节HRP逆行标记及患侧足掌皮肤触觉小体HE染色检测感觉功能的恢复。结果:与ARSN组比较,ChABC组、ADSC组和ChABC+ADSC组SFI显著增高,神经传导速度显著增高,动作电位波幅增大,胫前肌湿重比率增高,HRP阳性标记感觉神经元和触觉小体的数量增高(P<0.05)。其中ChABC+ADSC组作用显著优于单独治疗组(P<0.05)。结论:ChABC联合ADSC移植对大鼠坐骨神经缺损脱细胞异体神经支架修复后运动和感觉功能恢复的作用优于单独治疗组。

脱细胞同种异体神经移植物的制备及成分分析

目的 探讨脱细胞同种异体神经移植的制备方法及其含有的成分。方法 采用组织工程化低渗脱细胞方法制备神经异体移植物 ,光电镜观察其结构特征 ;用免疫组织化学法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析神经异体移植物的成分。结果 正常的 (天然的 )周围神经经脱细胞处理后 ,清除了雪旺细胞、神经外膜和束膜的细胞 ,以及神经纤维的髓鞘和轴突 ,保存了由雪旺细胞基底膜管以及神经外膜和束膜的细胞外基质构成的三维支架结构。成分分析结果显示 ,含有LN、FN以及生长相关蛋白GAP 4 3和 6 5kDa蛋白等促进和诱导受体损伤神经再生的重要成分。结论 脱细胞异体神经移植物含有诱导和促进神经再生的相关蛋白 ,有利于受损神经的再生。

脱细胞同种异体神经移植物桥接大鼠坐骨神经缺损的形态学观察

目的: 研究脱细胞处理的同种异体神经移植物桥接大鼠坐骨神经缺损后, 再生神经的形态学变化。方法: 光镜、电镜观察移植物内再生神经的超微结构变化, 免疫组织化学技术观察再生神经中S-100蛋白表达,并对再生神经的纤维数量、髓鞘厚度等进行统计学分析。结果: 实验组和自体神经移植对照组的移植段内见有由束膜和外膜包被的大量再生神经纤维, 两组比较再生神经的纤维数量、髓鞘厚度、有髓纤维占有的面积均无显著性差异; 两组移植段神经中的S-100阳性施万细胞数、形态和排列等方面也无明显差异。结论: 脱细胞同种异体神经同自体神经一样,对缺损的坐骨神经再生具有促进作用。

同种异体脂肪干细胞复合脱钙骨支架材料修复尺骨缺损:CT扫描及组织学检测

背景:脂肪干细胞具有来源广泛、含量丰富、容易获取,培养条件简单且扩增能力强等优点,有可能成为继骨髓间充质干细胞之后最具前景的骨组织工程种子细胞。目的:探讨兔脂肪干细胞与脱钙骨支架材料复合修复尺骨缺损的可行性。方法:构建兔尺骨缺损动物模型,将单纯脱钙骨材料植入右侧缺损区,设为对照组,将成骨诱导后的兔脂肪干细胞-脱钙骨支架材料复合物植入左侧缺损区,设为实验组。植入后12周,获取骨缺损处组织标本进行CT扫描和组织学检测。结果与结论:经CT扫描,实验组骨缺损断端与材料的接合部位已不能清晰分辨,断端外侧可观察到平行骨痂。对照组脱钙骨未完全降解,可观察到清晰的骨断端,未观察到连续骨痂,骨缺损处大多为纤维连接,未出现骨性修复。经组织学检测,实验组缺损处为典型再生骨组织,存在骨细胞和骨陷窝以及骨小梁结构,骨细胞和骨陷窝数量较多,仅有部分骨小梁结构形成,并有少量胶原样结构穿插于再生骨组织之间;对照组有脱钙骨基质残留现象,并存在部分胶原纤维样组织,在边缘可观察到一定的骨膜成骨反应,但程度较轻,且未出现大片再生骨样组织。以上结果表明兔脂肪干细胞成骨诱导后与脱钙骨支架材料复合可以用于修复尺骨缺损。

人胎盘羊膜包裹的脱细胞同种异体神经移植修复犬坐骨神经缺损

目的:探讨人胎盘羊膜包裹的脱细胞同种异体神经移植技术的可行性。方法:12只犬分为脱细胞同种异体神经移植组和人胎盘羊膜包裹的脱细胞同种异体神经移植(B)组,每组6只,均建立坐骨神经缺损动物模型。制备人胎盘羊膜和脱细胞同种异体神经。A和B组分别行同种异体神经移植术和人胎盘羊膜包裹的同种异体神经移植术。术后16周运用电生理学、髓鞘HE染色等观察2组犬移植段神经比目鱼肌诱发电位的波幅和时限、双侧坐骨神经传导速度的差异。结果:术后16周,A组犬足部及小腿红肿;B组犬神经功能恢复,小腿肌肉肌力恢复,犬右后肢能够站立。A和B组犬移植段神经连续性好,B组犬移植段神经周围炎症反应轻。B组与A组相比可见较多雪旺细胞增殖及大量再生的神经纤维。B组轴突密度和比目鱼肌诱发电位波幅、时限明显高于A组(t=10.195、4.825和6.323,P<0.001)。结论:人胎盘羊膜包裹的脱细胞同种异体神经移植术可改善神经形态学变化,提高移植神经的修复质量。

脱细胞处理的同种异体神经移植研究进展

周围神经损伤的修复是创伤外科难题之一，筛选促进神经再生理想的移植物，是解决这一难题的关键。近年来，在修复周围神经缺损研究中采用脱细胞处理的同种异体神经作为移植物，已取得促进神经再生的效果，展示了较好的应用前景。本文对脱细胞处理移植体的脱细胞处理方法，脱细胞处理后的细胞外基质所含的生物活性物质，以及这些物质的对促进神经再生的生物效应进行综述，以期为此种移植体的深入研究提供参考资料。

同种异体脂肪干细胞复合脱钙骨支架材料修复兔胫骨缺损的实验研究

目的探讨同种异体脂肪干细胞复合脱钙骨支架材料修复兔胫骨缺损的实验研究。方法购自北京生物有限公司(动物实验中心)新西兰大白兔8对,其中2对白兔进行脂肪干细胞分离培养,并采用反复滴加方法将细胞均匀分布于支架材料上,获取脂肪干细胞复合脱钙骨材料。其中6对构建兔胫骨骨缺损模型,造模后即刻将单纯脱钙骨材料植入右侧缺损区设为对照组,将诱导后的兔脂肪干细胞-脱钙骨支架复合物植入左侧缺损区设为实验组。于术后12周采用空气栓塞处死大白兔,获取大白兔双侧后肢胫骨修复骨及其周围软组织,行Micro-CT和组织学检测,了解实验组和对照组白兔骨组织生长情况,兔脂肪干细胞-脱钙骨材料成骨表型测定体内降解情况和组织学检测结果。结果大体观察显示实验组白兔后肢骨缺损区可见骨样组织修复,对照组白兔为纤维样组织充填未见骨样组织覆盖;三维CT影像学显示实验组白兔骨缺损断端和材料接合部已充分融合且骨轮廓、光滑的骨塑形清晰可见,对照组白兔骨缺损处多为纤维性连接;HE染色下可见实验组白兔有典型再生骨组织、大量骨陷窝、骨细胞及部分骨小梁结构,对照组白兔为胶原纤维样组织和残留脱钙骨基质、无大片再生骨样组织。两组白兔Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均呈阳性,细胞胞浆及胞外基质呈棕黄色,胞核呈蓝色,证实修复细胞表达Ⅱ型胶原,为软骨细胞。实验组和对照组白兔修复组织评分分别为(2.41±0.40)、(2.70±0.45)分,实验组白兔组织修复得分高于对照组白兔,差异有显著性(P<0.05)。结论兔脂肪干细胞接种于脱钙骨材料,经成骨诱导后具有较强成骨分化能力,能较好地修复兔胫骨骨缺损,具有较高临床疗效。

脱细胞异体神经移植物联合电针对坐骨神经损伤大鼠脊神经节的保护作用及机制

目的探讨脱细胞异体神经移植物(ANA)联合电针对坐骨神经损伤(SNI)大鼠脊神经节的保护作用及机制。方法选取50只雄性SD大鼠,10只制备ANA;40只随机分为正常组、模型组、ANA组和联合组,每组10只。分离右侧坐骨神经,于梨状肌下缘5 mm处去除10 mm制备SNI模型。ANA组将制备好的ANA连接在损伤神经的两断端处。联合组于ANA连接术后2 d采用电子针疗仪电针“环跳穴”和“阳陵泉穴”,15 min/d,7 d为1个疗程,共4个疗程。电生理检测各组大鼠坐骨神经传导速度,评估受损轴突再生情况;尼氏染色观察脊神经节中神经元的形态结构;Western blotting和免疫荧光法检测脊神经节中神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)的表达。结果与正常组比较,模型组大鼠坐骨神经传导速度明显降低(P<0.01);神经节神经元中的尼氏体因肿胀、溶解导致结构不完整,数量显著减少(P<0.01);NGF和BDNF蛋白表达量明显降低(P<0.01)。与模型组比较,ANA组和联合组大鼠坐骨神经传导速度明显增加(P<0.01);神经节神经元中尼氏体损伤减弱,数量明显增加(P<0.01);NGF和BDNF蛋白表达量显著升高(P<0.01)。与ANA组比较,联合组大鼠坐骨神经传导速度显著增加(P<0.01);神经节神经元中尼氏体形态较规则,数量明显增加(P<0.01);NGF蛋白表达量显著升高(P<0.01)。结论ANA联合电针可提高大鼠坐骨神经传导速度,改善神经节中神经元的形态结构,发挥对脊神经节神经元的保护作用,其机制可能与提高神经元中NGF和BDNF蛋白的表达,尤其是NGF蛋白的表达相关。

脱细胞同种异体神经移植物组织相容性初探

目的探讨脱细胞大鼠坐骨神经的组织相容性。方法应用低渗脱细胞方法制备脱细胞同种异体神经移植物-脱细胞大鼠坐骨神经(Acel ular Rat Sciatic Nerve,ARSN),进行组织学观察和免疫组织化学方法检测,肌肉埋植术后分别于第4d和第7d进行其组织相容性分析。结果①ARSN保存了雪旺细胞基底膜管以及神经外膜和束膜的细胞外基质结构,清除了轴突、髓鞘及雪旺细胞神经外膜和束膜的细胞结构。于肌肉埋植后第4d,ARSN神经外膜结构吸收明显,周围出现由新生肉芽组织构成的环状包绕;第7d,ARSN神经外膜结构已被吸收,周围肉芽组织趋于成熟,无淋巴细胞。③免疫组织化学法检测FN和LN可见ARSN基底膜管壁分别呈棕黄色和黄色,但较NRSN阳性略弱。结论采用低渗脱细胞方法制备的周围神经细胞外基质支架保留了对神经再生具有促进作用-FN和LN,具有良好的组织相容性,可随着时间的推移逐渐降解。

脱细胞同种异体真皮联合富血小板血浆对糖尿病足溃疡患者的疗效评价

目的评价脱细胞同种异体真皮联合富血小板血浆在修复糖尿病足溃疡中的应用效果。方法选取2020年1月至2022年1月本院收治的120例糖尿病足患者作为研究对象,按随机数字表法分为对照组A40例(单纯应用脱细胞同种异体真皮移植)、对照组B40例(单纯应用富血小板血浆)与试验组40例(脱细胞同种异体真皮移植联合应用富血小板血浆),每3d更换敷料一次,2周后拆线观察创面情况。比较治疗后创面愈合情况、炎症因子水平、细菌增殖情况、皮片排异情况及创面完全愈合时间等指标;随访1年记录三组患者复发情况。采用SPSS21.0软件进行统计学分析,通过χ^(2)检验、t检验和秩和检验对数据进行分析。结果治疗后,试验组总有效率高于对照组A、B(P<0.05),创面细菌检出率低于对照组A、B(P<0.05);治疗后,试验组创面TNF-α、IL-6、FGF2水平、创口复发比例均低于对照组A、B,差异均具有统计学意义(P<0.05);治疗后,试验组创口复发例数明显少于对照组A、B,完全愈合时间明显短于对照组A、B,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论脱细胞同种异体真皮联合富血小板血浆可明显促进糖尿病足溃疡患者创面愈合、减轻患者创面炎症及细菌感染,且复发率低,对于糖尿病足溃疡治疗具有较高的临床应用价值。

干细胞与脱细胞异体神经支架在周围神经长段缺损中的应用

背景:将种子细胞植入合适的载体支架可以构建具有生物活性及相应功能的组织工程神经桥接物,干细胞与脱细胞异体神经构成的组织工程移植物正成为周围神经长段缺损研究领域的重要移植材料,并已初步显示出良好的应用前景。目的:综述近年来干细胞与脱细胞异体神经支架在周围神经长段缺损中的应用。方法:第一、二作者应用计算机检索1998年1月至2014年2月PubMed数据库、中国期刊全文数据库有关干细胞与脱细胞异体神经支架在周围神经长段缺损中应用的文章,英文检索词"stem cells,peripheral nerve defect,acellular allogeneic nerves";中文检索词"干细胞,周围神经缺损,脱细胞异体神经"。共检索到1 013篇相关文献,其中97篇文献符合纳入标准。结果与结论:干细胞因组织损伤后释放的各种趋化因子吸引以及其自身趋化作用聚集到损伤部位,分泌大量的营养物质,促进机体损伤神经功能的修复。干细胞可以在周围环境的诱导和内在分化偏向共同作用下分化并代替人体内损伤或死亡的神经细胞。此外,干细胞联合组织工程材料移植,减少胶质瘢痕的形成也是促进周围神经损伤修复的因素。干细胞可以增强神经突触之间的联系,建立新的神经环路。神经干细胞具有分化为其他神经细胞的潜力,但其分化与调控的确切机制尚不明了。对于如何改善微环境,使更多的干细胞分化为神经元与少突胶质细胞并维持细胞活性尚缺乏有效的方法。故有效的抑制移植早期的免疫排斥反应,应成为研究的重点所在。神经移植后如何提高神经再生速度和质量,维持靶器官的组织结构与功能更需要长期的摸索。

去细胞同种异体神经支架种植许旺细胞的体外培养

背景:前期的研究中分别探讨了使用复合酶消化法及差速贴壁法对许旺细胞培养的影响以及聚氧乙烯辛烷基酚(Triton X-100)制备同种异体神经支架。目的:通过化学萃取法制备同种异体神经支架,并将培养的许旺细胞与支架进行体外结合培养。方法:取Wistar大鼠双侧坐骨神经,运用30g/L三硝基甲苯和40g/L脱氧胆酸钠分别萃取1,2和3次,在萃取神经和未萃取神经的中段取材,行苏木精-伊红染色,S-100及Laminin免疫组织化学染色及透射电镜检测。取SD胎鼠坐骨神经及臂从神经,使用复合酶消化,差速贴壁及Arab-c抑制成纤维细胞生长的培养方法获得大量高纯度的许旺细胞。再把许旺细胞注入同种异体神经支架内,并行透射电镜及扫描电镜观察。结果与结论:用三硝基甲苯和脱氧胆酸钠萃取后,坐骨神经内细胞和髓鞘被清除,神经基底膜被保留。电镜下可见萃取后的神经由空的神经基底膜管和管之间的胶原纤维构成。萃取次数增加后,神经内残留的S-100蛋白显著减少,但反复萃取后支架结构受破坏。去细胞同种异体神经支架适合许旺细胞体外生长,并有迁移排成行的特性。结果提示,用三硝基甲苯和脱氧胆酸钠萃取2次可去除细胞而保留神经基底膜管,是制备具有仿生结构神经支架的理想方法。神经支架种植许旺细胞后可能成为一种理想的神经缺损修复材料。

异种异体脱细胞神经支架制备的实验研究

目的:探讨用化学方法制备异种异体脱细胞神经支架,为周围神经组织工程提供有效的神经支架。方法:A组,SD大鼠5只,体重200～250g,取双侧坐骨神经;B组,家兔1只,体重500～600g,取周围神经10根,与A组等粗等长;C组,家犬1只,取周围神经10根,与A、B组等长等粗。三组神经均采用TritonX-100、脱氧胆酸钠等进行脱细胞处理。用HE染色对去细胞程度、脱髓鞘程度及神经管道完整性进行评价。结果:HE染色A、B、C组轴突及细胞核均消失,神经内膜形成不规则圆形空腔。结论:在TritonX-100、脱氧胆酸钠的处理下,A、B、C组的细胞均被脱净,可以作为组织工程神经的支架。

脱细胞同种异体神经移植的进展

自1870年Philipeaux和Vulpain首次利用游离神经移植术修复舌下神经缺损以来，自体神经移植被认为是周围神经缺损修复的金标准，但自体神经材料存在来源有限，取材将给病人带来新的创伤．取材后可有供区麻木、瘢痕、神经瘤等并发症。异体神经移植及组织工程人工神经导管技术被认为是修复神经缺损新的发展方向，而单纯的异体神经移植也存在着受体免疫排异的问题。

脱细胞同种异体神经移植的进展

自1870年Philipeaux和Vulpain首次利用游离神经移植术修复舌下神经缺损以来，自体神经移植被认为是周围神经损伤的修复最佳选择，但白体神经材料存在来源有限，取材将给病人带来新的创伤，取材后可有供区麻木、瘢痕、神经瘤等并发症。异体神经移植及组织工程人工神经导管技术被认为是修复神经缺损新的发展方向，而单纯的异体神经移植也存在着受体免疫排异的问题。