后肾间充质细胞作用于VEGFR2/3促进成骨细胞成骨

目的:探讨后肾间充质细胞(MMC)及其上清液和其活性成分VEGF-C所作用受体VEGFR2/3对成骨细胞成骨的影响。方法:将MMC与成骨细胞系MC3T3-E1混合培养,检测成骨标志物碱性磷酸酶(ALP)活性与染色情况;茜素红染色法观察矿化结节形成情况。制备MMC上清液,将成骨细胞分为成骨诱导对照组和MMC上清液组,CCK-8法检测细胞增殖活性;检测ALP活性、染色情况与矿化结节形成情况;蛋白质印记法检测成骨相关蛋白Runx2、OCN、OPN的表达水平。加入VEGFR2和VEGFR3的特异性抑制剂Ki8751和MAZ51后,通过检测上述指标观察其促成骨作用有无减弱。结果:混合培养使成骨细胞ALP活性升高、染色增强,细胞表面矿化结节数量增多、体积增大。加入MMC上清液后,成骨细胞增殖活性升高,ALP活性升高、染色增强,Runx2、OCN、OPN表达升高,矿化结节数量增多、体积增大。抑制VEGFR2/3后,MMC上清液的促成骨作用减弱,ALP活性下降、染色减弱,Runx2、OCN、OPN的表达下降,细胞表面矿化结节数量减少、体积减小。结论:MMC可通过作用于VEGFR2/3促进成骨细胞成骨。

SD大鼠胚胎后肾间充质干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的对SD大鼠胚胎后肾间充质细胞(MMSCs)进行分离培养,并检测其生物学特性。方法采用胚胎后肾微组织块接种培养法,检测其生长曲线和生长周期,并进行细胞表面抗原和成骨能力的鉴定。结果MMSCs体外培养生长状况良好,具有活跃的增殖能力。细胞周期显示90%以上细胞处于G0/G1期。表面抗原检测绝大多数细胞阳性表达波形蛋白(vimen-tin)和纤维连接蛋白(fibronectin),几乎不表达CD34。在体外能够向成骨细胞分化。结论原代分离、培养的细胞为MMSCs,细胞纯度高、扩增迅速、生物学性状稳定,可为组织工程提供比较理想的种子细胞。

胚胎后肾间充质细胞移植对急性肾小管坏死肾功能的修复作用

目的:将体外培养的胚胎后肾间充质细胞,通过尾静脉注射移植给急性肾小管坏死的模型大鼠,观察是否改善对肾功能起修复作用。方法:(1)体外培养、扩增及生物学鉴定大鼠胚胎后肾间充质细胞株(RIMM-18);(2)通过皮下注射总量为900mg/kg庆大霉素,建立急性肾小管坏死的大鼠模型;(3)除空白组外,将造模大鼠随机分为3组:①移植组:造模后通过尾静脉注射移植培养的RIMM-18细胞1～6×107/ml;②培基组:造模后通过尾静脉注射等量的无血清培养基;③急性肾小管坏死组(ATN组):皮下注射总量为900mg/kg的庆大霉素×3d。(4)留取标本:分别于成模后1d、4d、1周、2周及4周杀鼠,留取尿和血标本;(5)生化指标检测:BUN、Scr、尿蛋白、尿肌酐、β2-MG、NAG和RBP等。结果:(1)RIMM-18细胞体外生长良好,保持间充质细胞特性。(2)皮下注射总量900mg/kg的庆大霉素3d成模。(3)移植组大鼠毛发有光泽、脱毛少,体重及尿量的恢复较快,死亡率下降。(4)各组大鼠生化指标比较:移植组尿蛋白于4d时达峰值,2周时下降接近正常;而培基组和ATN组于1周达峰值,持续至4周降至正常。移植组、培基组和ATN组于1周、2周时其值分别为(1.37±0.10)mg/L、(1.97±0.21)mg/L、(2.05±0.19)mg/L,(0.56±0.07)mg/L、(1.59±0.07)mg/L、(1.66±0.11)mg/L,移植组与培基组及ATN组之间差异有统计学意义(P<0.01)。BUN、Scr、NAG、RBP及β2-MG变化规律类似。(5)肾脏病理:移植组4d时肾小管病变最显著,培基组和ATN组则于1周时肾小管病变最明显,恢复较移植组慢。肾小管Paller氏评分显示于1周、2周、4周时移植组与培基组及ATN组之间差异有统计学意义(P<0.01)。结论:胚胎后肾间充质细胞通过尾静脉移植能改善ATN的肾功能。

LIF诱导小鼠胚胎后肾间充质细胞分化形成肾上皮细胞

目的观察白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,LIF)能否诱导后肾间充质细胞(metanephric mesenchymal cells,MMCS)分化形成肾上皮细胞,并探讨其机制。方法取孕11.5天的小鼠胚胎,分离后肾间充质组织,去除输尿管芽,Pax-2染色鉴定。对鉴定后的肾间充质细胞进行体外培养,并在培养液中加入细胞因子成纤维细胞生长因子(FGF2)、转化生长因子(TGF-α)和LIF进行诱导,用免疫荧光染色和RT-PCR检测后肾间充质细胞分化形成肾上皮细胞过程中的形态学和基因表达变化。结果经细胞因子LIF处理,后肾间充质细胞由排列杂乱无序的细胞发育形成有连续基底膜的肾小球。RT-PCR检测发现上皮细胞标记因子(E-caderin、CollagenⅣ、podocalyxin)的表达逐渐增高。结论 LIF能诱导后肾间充质细胞分化形成肾上皮细胞,可为肾脏疾病的细胞治疗提供实验依据。

北京鸭胚胎后肾间充质干细胞分离培养及鉴定

建立禽类后肾间充质干细胞(Metanephric mesenchymal stem cells,MMSCs)体外培养体系,研究其生物学特性和多向分化潜能。采用酶消化法分离北京鸭胚胎MMSCs,绘制生长曲线,通过免疫荧光和RT-PCR对MMSCs进行鉴定,诱导MMSCs向脂肪细胞和胰岛细胞分化。结果表明,鸭胚胎MMSCs具有良好的增殖活力,表达间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)特异性标志物,并诱导分化为脂肪细胞和胰岛细胞。北京鸭胚胎MMSCs在体外具有较强的自我更新能力及多向分化潜能,可作为组织工程的种子细胞进行保存。

后肾间充质细胞对高糖诱导的足细胞凋亡损伤的作用

目的研究后肾间充质细胞对高糖诱导的足细胞凋亡损伤的作用效果。方法体外培养小鼠足细胞，加入30mmol／L葡萄糖建立足细胞凋亡损伤模型；从受孕13．5d（E13．5）小鼠胚胎提取后肾间充质细胞，制作后肾间充质细胞条件培养基，用后肾间充质细胞条件培养基治疗高糖诱导的足细胞凋亡损伤；在各时间点采用流式细胞术检测足细胞凋亡率[annexin V／propidiumiodide双染和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）染色]、共聚焦荧光成像技术检测足细胞骨架蛋白synaptopodin表达水平，观察高糖对足细胞影响及后肾间充质细胞条件培养基的治疗效果。结果高糖刺激足细胞后可见足细胞凋亡率明显升高、足细胞表达synaptopodin降低，与对照组相比差异均有统计学意义（均P〈0．05）；从E13．5孕鼠成功提取后肾间充质细胞，在干细胞成骨／成脂诱导液诱导后，具有成骨／成脂分化能力；流式细胞检测显示，后肾间充质细胞条件培养基可以使足细胞凋亡率降低、synaptopodin表达水平升高，并且成剂量依赖性，即随着后肾间充质细胞条件培养基浓度升高效果更明显。结论后肾间充质细胞可减轻高糖诱导的足细胞凋亡损伤。

胚胎后肾间充质干细胞对多柔比星肾病大鼠足细胞Nephrin、Podocin表达的影响

目的探讨胚胎后肾间充质干细胞对多柔比星肾病(ADN)模型(微小病变型)大鼠足细胞Nephrin、Podocin表达的影响。方法将大鼠随机分为模型组、胚胎后肾间充质干细胞注射组(RIMM-18细胞组)和对照组,各18只。模型组、RIMM-18细胞组大鼠一次性尾静脉注射多柔比星5 mg.kg-1,对照组予尾静脉注射9 g.L-1盐水3 mL。造模3 d后RIMM-18细胞组及对照组分别予尾静脉注射1×107L-1RIMM-18细胞和1 mL无血清培养液。造模第6、17、31天检测各组大鼠24 h尿蛋白、血清清蛋白、血清胆固醇及肾脏病理改变,采用免疫荧光及Western blot检测各组大鼠Nephrin、Podocin表达情况。结果在造模第31天RIMM-18细胞组大鼠24 h尿蛋白及血清胆固醇较模型组明显减少,血清清蛋白明显升高,足突融合情况明显减轻,足细胞Nephrin、Podocin表达明显增多(Pa<0.05)。结论尾静脉注射胚胎后肾间充质干细胞可减少ADN大鼠的蛋白尿,减轻ADN大鼠肾组织足细胞足突融合。其可能的机制是通过上调Podocin、Nephrin蛋白的表达从而维持蛋白复合体的结构和功能的完整。

膀胱输尿管反流基因Robo2在小鼠肾脏发育过程中的表达

目的观察Robo2在小鼠肾脏发育过程中的表达情况,探讨其在肾脏发育中的作用。方法应用实时定量RT-PCR技术对胚龄12.5、13.5、14.5、15.5、16.5、17.5、18.5d和生后日龄1d、1周、5周共10组小鼠肾脏组织中的Robo2 mRNA表达水平进行半定量分析。应用免疫荧光技术检测胚龄12.5、13.5、14.5、15.5、16.5、17.5d和成年小鼠肾脏Robo2蛋白表达部位。结果实时定量RT-PCR结果显示,Robo2蛋白表达水平在胚龄12.5、13.5、14.5d时最高,随后明显下降,在出生后维持低水平表达。免疫荧光染色结果显示,Robo2最初在胚肾的后肾间充质表达,而不在输尿管芽表达,随着胚龄增加及肾脏发育,Robo2表达于后肾间充质细胞膜、围绕输尿管芽的浓缩帽状间充质、逗号形体和S形体以及肾小囊体,最终表达于肾小球足细胞。另外,部分早期肾小管上皮细胞也有微弱Robo2表达。在Robo2基因缺失后,肾单位发育异常,部分肾小管、集合管扩张。结论 Robo2通过调控后肾间充质与输尿管芽相互作用在小鼠肾脏发育过程中对肾单位发育起重要作用。

发育生物学在肾脏组织工程中的应用

肾脏发育生物学的研究成果对采用组织工程技术体外再造肾脏组织具有重要的理论指导意义和推动作用。在以往肾脏发育生物学研究中,取得的有关肾脏发育过程中小管分枝发生、间充质细胞-上皮细胞转换以及胚胎期后肾成分体外培养试验的研究成果,为进一步开展工程化肾脏组织体外构建研究奠定了良好基础,提供了新思路和新方法。本研究对肾脏发育生物学研究、肾脏组织工程研究以及发育生物学在工程化肾脏组织构建中的初步应用进行简要综述。

PBX1基因异常导致先天性肾脏发育不良的研究进展

先天性肾脏和尿路发育异常(congenital anomalies of the kidneys and urinary tracts,CAKUT)是一组以泌尿系统发育缺陷为特征的结构畸形。其中,先天性肾脏发育不良在CAKUT的发生中多见。先天性肾脏发育不良的发病机制是多因素导致的,涉及母体、外界环境、遗传等。随着分子诊断技术的不断进步,遗传因素引起越来越多的重视。PBX1基因最初是由t(1;19)(q23;p13.3)染色体易位而形成E2A-PBX1融合基因,导致前B细胞淋巴细胞白血病而被发现的。PBX1基因突变可以造成先天性肾脏和尿路畸形综合征伴或不伴有听力丧失、耳朵异常和发育迟缓。该文对胚胎肾脏的发育过程、PBX1基因的结构功能异常可能造成肾脏发育不良的发病机制进行阐述,加深对基因在调控肾脏发育作用中的认识,总结PBX1基因突变的表型和基因型,推进对先天性肾脏发育不良的诊治和评估预后。

宫内生理性低氧微环境对哺乳动物胚胎早期肾脏发育的影响

目的研究宫内生理性低氧微环境对哺乳动物胚胎早期肾脏发育的影响。方法采用大鼠胚胎肾脏体外培养的方法建立肾脏发育模型，应用低氧培养箱模拟胚胎发育早期宫内生理性低氧微环境，免疫荧光染色技术标记胚肾输尿管芽分枝和后肾间充质向上皮转分化过程，激光共聚焦显微镜观察胚肾发育形态学变化；原位末端转移酶标记技术（TUNEL法）检测胚-肾细胞凋亡的变化，胸腺嘧啶核苷类似物（EdU）掺人法检测胚。肾细胞增殖的变化，实时荧光定量PCR法检测胚肾发育相关基因表达的变化。结果体外培养条件下低氧（3％～5％O2）微环境显著抑制胚肾发育，输尿管芽分枝和肾小球数目均减少（P〈0．05）。低氧（5％O2）条件下胚肾细胞的凋亡程度较常氧下显著减轻，细胞增殖则受到了显著抑制（P〈0．05）。低氧增强胚肾后肾间充质Six2阳性干细胞的自我更新，上调Six2、Wt-1等发育重要相关基因的表达，下调Wnt9b和Wnt4等诱导分化相关基因的表达。结论宫内生理性低氧微环境可能通过影响哺乳动物胚肾发育相关信号通路抑制胚肾干细胞的增殖和分化，从而促进胚肾干细胞维持自我更新。

膀胱输尿管反流相关基因的研究进展

膀胱输尿管反流是先天性肾脏和尿路畸形中最常见的一种类型，主要与输尿管膀胱连接部发育异常有关。除非伴有尿路感染症状，或是综合征的一部分，多数患儿临床表现不明显。膀胱输尿管反流的确切病因还不清楚，可能是由基因异常引起，也可能受环境因素影响。膀胱输尿管反流患者后代和同胞间的患病率明显高于正常儿童，提示了基因筛查的必要性。该文将对膀胱输尿管反流相关基因的研究进展及相互作用作一综述。