定向编辑CTLA4基因的向导RNA体外合成体系的构建及其编辑效率

目的:基于CRISPR/Cas9基因编辑技术原理体外合成定向编辑细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4,CTLA4)基因的向导RNA(small guide RNA,sgRNA)。方法:(1)使用Crispr网站对CTLA4位点的sgRNA进行预测并设计出3个sgRNA(sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3),构建sgRNA重组质粒,将其转染293T细胞,48 h后提取基因组DNA,利用T7EN1核酸内切酶筛选活性较高的sgRNA序列;(2)以筛选到的sgRNA重组质粒为模板,设计引物并用PCR扩增体外合成sgRNA的DNA模板片段,进一步优化体外转录条件,转录出sgRNA,并利用Cas9核酸酶体外检测转录纯化sgRNA的切割效率;(3)将sgRNA与转录得到的Cas9 mRNA电转化入肺癌患者CD3^+T细胞,实现靶基因敲除。结果:T7EN1核酸内切酶实验证实了sgRNA2序列靶向敲除效率最高,效率达到66%;优化体外合成体系后,转录得到的CTLA4 sgRNA2产量高,具有较高的活性,在靶点上成功切开了DNA双链,Cas9核酸酶检测出其切割效率达到了65%;最终可在肺癌患者CD3^+T细胞中有效敲除CTLA4基因,CTLA4分子的表达从46%降低到22%,T7E1核酸内切酶实验进一步证实了其编辑效率为56%。结论:体外成功构建了具有较高编辑效率的定向编辑CTLA4基因的sgRNA,为后续针对该基因制定相应的免疫治疗策略奠定了基础。

计算机辅助CRISPR向导RNA设计

基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑已被成功应用于多种细胞类型中。计算机辅助的向导RNA(Guide RNA)设计是使用CRISPR系统成功进行基因编辑的关键步骤之一。目前的计算工作主要致力于利用计算模型来提高sgRNA的打靶效率并降低其脱靶。文中对于目前存在的sgRNA设计工具进行综述,并且说明可以通过建立高效的计算模型,对当前的异质基因编辑数据进行整合挖掘,以获得无偏差的sgRNA设计规则,并预测影响sgRNA设计的关键特征。笔者认为,对于sgRNA打靶和脱靶效果的系统总结和评价,将有助于使用CRISPR系统进行更加精准的基因编辑和基因治疗。

靶向猪基因组单链向导RNA快速筛选以及利用图案微阵列收获单克隆细胞的研究

规律性短重复回文序列簇(CRISPR)和CRISPR辅助蛋白9(Cas9)构成的CRISPR/Cas9基因编辑技术快速推进了基因修饰猪作为医学研究模式动物的广泛应用。而高效的靶基因单链向导RNA(sgRNA)是利用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑成功的关键,对于猪等繁殖周期较长的大动物,则需要在实施动物实验前,在体外筛选出高效的sgRNA以避免时间和资源成本浪费。另外,如何高效获得阳性基因编辑单克隆细胞是目前尚待解决的难题。本研究建立了靶向猪基因组的sgRNA快速筛选方法,利用荧光载体富集基因编辑细胞,同时探索利用图案微阵列培养技术快速获得单克隆细胞的方法,在此基础上高效获得延胡索酰乙酰乙酸酶(Fah)基因编辑细胞,为后续生产作为人类肝细胞生物反应器的Fah基因敲除猪奠定基础。

BE-dot:为单碱基编辑设计sgRNA及预测脱靶图谱的工具

目的 单碱基编辑器作为修复基因组点突变的有力工具,在生物技术开发和临床应用中具有极大潜力。对于目标改造的单核苷酸变异(SNV),首先要选择可用于编辑的单碱基编辑器(base editors,BEs)和单向导RNA (single guide RNA,sgRNA)。目前,尽管有较多工具实现了设计sgRNA,但缺少将设计sgRNA与评估单碱基编辑器特异性完整结合起来的工具。方法 纳入主流的27种胞嘧啶碱基编辑器(CBEs)和12种腺嘌呤碱基编辑器(ABEs)对SNV设计编辑方案,并通过调用第三方工具BE-Hive对编辑方案进行效率预测。综合使用多个脱靶预测工具对编辑方案的脱靶图谱进行评估。最后结合BEs类型和脱靶位点,分析得到所有可能的脱靶编辑产物,再调用ANNOVAR这一变异注释工具进行脱靶产物的功能分析。结果 本文提出了一个综合性工具BE-dot,它可以实现对目标编辑的SNV从设计sgRNA到预测脱靶图谱的完整过程,并对脱靶产物进行功能注释。利用密码子的简并性,BE-dot除了提供DNA水平上的精确校正方案,还可以在蛋白质水平进行同义校正。在对单碱基编辑系统做脱靶图谱的预测时,BE-dot综合了Cas-OFFinder、CALITAS、CFD、u CRISPR、BEdeepoff等多个工具,可以更全面地评估单碱基编辑系统的特异性,为用户选择BEs和sgRNA提供参考。此外,BE-dot可以自动分析得到脱靶位点处所有可能的编辑产物,并转换为avinput格式供ANNOVAR进行功能注释,避免了以往手工注释的繁琐。结论 BE-dot能为单碱基编辑技术应用于纠正或引入SNV设计编辑方案,并且能够从编辑效率、脱靶图谱、脱靶带来的功能影响等方面对编辑方案进行全面的评估。

CRISPR／Cas系统：RNA靶向的基因组定向编辑新技术

CRISPR/Cas系统广泛存在于细菌及古生菌中,是机体长期进化形成的RNA指导的降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统。对Ⅱ型CRISPR/Cas系统的改造使其成为继锌指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs)以来的另一种对基因组进行高效定点修饰的新技术,与ZFNs和TALENs相比,CRISPR/Cas系统更简单,并且更容易操作。文章重点介绍了Ⅱ型CRISPR/Cas系统的基本结构、作用原理及这一技术在基因组定点修饰中的应用,剖析了该技术可能存在的问题,展望了CRISPR/Cas系统的应用前景,为开展这一领域的研究工作提供参考。

靶向叉头框蛋白J2的CRISPR/Cas9基因敲除质粒的构建及其对肝癌细胞转化生长因子β/Smads表达和增殖的影响

目的构建靶向叉头框蛋白J2(FOXJ2)的规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)基因敲除质粒,探讨干扰FOXJ2基因后对小鼠肝癌细胞Hepa1-6的信号通路转化生长因子β/Smads家族蛋白(TGF-β/Smads)表达和增殖的影响。方法设计小鼠FOXJ2的小向导RNA(sgRNA)序列,与PX458载体连接并转化感受态大肠埃希菌,挑取单克隆扩增提质粒。利用脂质体将重组质粒PX458-FOXJ2-sgRNAs转染入肝癌细胞Hepa1-6,对照组只转染空载体,48 h后RT-PCR检测对Hepa1-6细胞FOXJ2的抑制作用,同时检测FOXJ2被抑制后TGF-β和Smads的表达情况;MTT法检测干扰FOXJ2后对肝癌细胞增殖能力的影响。结果成功构建3个FOXJ2的CRISPR/Cas9基因敲除质粒PX458-FOXJ2-sgRNAs,其中质粒PX458-FOXJ2-sgRNA2可以有效抑制FOXJ2的表达,同时检测到干扰了FOXJ2的细胞的TGF-β、Smad2和Smad4的表达均高于对照组,差异显著;并且FOXJ2被抑制组肝癌细胞的增殖能力明显提高。结论小鼠肝癌细胞中的FOXJ2基因在一定程度上抑制TGF-β、Smad2和Smad4基因的表达,抑制细胞的增殖,推测在体情况下,肝癌细胞的增殖和TGF-β信号通路的激活与FOXJ2基因的负调控有一定的相关性,FOXJ2可以作为肝癌预防和治疗的靶点分子进行干预。

提高CRISPR/Cas9系统靶向编辑效率方法的研究进展

近年来,CRISPR/Cas9系统经过一系列改造后已成为继锌指核酸酶ZFNs和TALENs后的新型高效定点编辑的新技术,目前,该技术已成功应用于人类细胞、斑马鱼、小鼠以及细菌的基因组精确编辑,但是该技术在农作物等植物中的应用还比较受限,且其脱靶效应等问题还有待解决。本文首先简要综述了CRISPR/Cas9系统的发展历程、结构组成和作用机制及其在农作物中的应用,进而综述了近年来探索出的提高CRISPR/Cas9系统靶向编辑效率的方法。最后,对基因组编辑技术在农作物和作物育种上的应用进行了展望。

规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9靶向Rho GDIα基因敲除质粒的构建及其对小鼠肝癌细胞系Hepa 1-6迁移的影响

目的利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术构建Rho鸟苷酸解离抑制因子α(GDIα)的基因敲除载体,并探讨干扰Rho GDIα后对小鼠肝癌细胞Hepa 1-6迁移的影响。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计Rho GDIα的向导RNA(sgRNA)序列,并与PX458载体相连,构建Rho GDIα基因敲除重组质粒PX458-Rho GDIα-sgRNA1和PX458-Rho GDIα-sgRNA2;脂质体转染法将重组质粒转染入Hepa 1-6细胞抑制Rho GDIα的基因表达;RT-PCR法检测Rho GDIα被抑制后的mRNA表达情况;划痕法检测Rho GDIα干扰后Hepa 1-6细胞迁移距离的差异;迁移小室法检测抑制Rho GDIα后Hepa 1-6细胞迁移数量的差异。结果成功构建了Rho GDIα的CRISPR/Cas9基因敲除质粒PX458-Rho GDIα-sgRNAs;转染有PX458-Rho GDIα-sgRNA1的Hepa 1-6细胞与对照组只转染空载体PX458的细胞相比,Rho GDIα的表达被明显抑制(P<0.05),而且该组细胞从划痕起始处迁移到空白处距离较远,从迁移小室上端迁移到底端数目明显增多,差异极其显著(P<0.01),说明Rho GDIα被抑制后肝癌细胞的迁移能力提高。结论CRISPR/Cas9法构建的重组质粒PX458-Rho GDIα-sgRNA1可以有效抑制Rho GDIα的基因表达;Rho GDIα被抑制后明显促进小鼠肝癌细胞Hepa 1-6的迁移,提示在体情况下,Rho GDIα的表达可能起到抑制细胞迁移的重要作用,在肿瘤组织中,可以利用过表达Rho GDIα来抑制肿瘤细胞的转移。

CRISPR/Cas9技术的脱靶效应及优化策略

近年,CRISPR/Cas9系统已经迅速成为医学领域最具潜力的基因编辑工具,它是继锌指核酸内切酶(zinc-finger nucleases,ZFNs)和转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effectors nucleases,TALENs)之后的第三代人工改造的核酸内切酶,被喻为"基因魔剪".该基因编辑系统最大优势在于只需要设计一个靶向目标序列的sgRNA(single-guide RNA)就能引导Cas9核酸酶结合到特定的基因序列,并指导Cas9核酸酶切割相应的结合位点,进而完成对靶基因的编辑.由于其设计简单、实施快捷、成本低廉,突变效率高等优点,这一系统在基因组功能鉴定、抗病毒、抗肿瘤、免疫治疗等众多领域已广泛研究.虽然CRISPR/Cas9系统具有如此多的优点,但是其可能存在的脱靶风险影响了该基因编辑技术的深入研究,增加了用于疾病治疗的风险,阻碍了临床的进一步应用.如何保证CRISPR/Cas9基因编辑技术高编辑效率,同时也能降低脱靶效应,这将是未来科学研究者深入研究CRISPR/Cas9技术并开拓其临床应用亟待解决的问题.为此我们在文章中对CRISPR/Cas9系统组成、作用机制及应用进展进行简要综述,着重介绍目前这一领域广受关注的脱靶效应,并归纳优化策略,以期为更多的研究者提供参考.

CRISPR/Cas9的应用及脱靶效应研究进展

CRISPR/Cas9基因编辑技术在生命科学领域掀起了一场全新的技术革命,该技术可以对基因组特定位点进行靶向编辑,包括缺失、插入、修复等。CRISPR/Cas9比锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术更易于操作,而且更高效。CRISPR/Cas9系统中的向导RNA(Single guide RNA,sg RNA)是一段与目标DNA片段匹配的RNA序列,指导Cas9蛋白对基因组进行识别。研究发现,设计的sg RNA会与非靶点DNA序列错配,引入非预期的基因突变,即脱靶效应(Off-target effects)。脱靶效应严重制约了CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛应用。为了避免脱靶效应,研究者对影响脱靶效应的因素进行了系统研究并提出了许多降低脱靶效应的方法。文章总结了CRISPR/Cas9系统的应用及脱靶效应研究进展,以期为相关领域的工作提供参考。

应用CRISPR/Cas9介导的基因编辑系统研究B细胞中转录因子T-bet的调控作用

目的·通过优化后的CRISPR/Cas9基因编辑系统,研究原代B细胞中转录因子T-bet对抗体类别转换的调控作用。方法·系统性分析GEO公共数据库中体外诱导分化的B细胞转录组测序结果,探索转录因子T-bet对抗体类别转换的调控。构建靶向基因为Tbx21(T-box 21,编码T-bet)的小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)反转录病毒表达载体,使用Plat-E细胞系作为病毒包装细胞系获得装有sg-Tbx21质粒的反转录病毒并对其浓缩。使用B细胞受体抗体、抗CD40抗体和Toll样受体激动剂体外协同刺激Cas9转基因小鼠的脾脏B细胞,感染高滴度反转录病毒颗粒实现基因编辑。流式细胞术分选感染细胞,提取基因组DNA进行PCR扩增后对靶向序列进行测序,利用ICE CRISPR分析工具计算基因敲除效率。体外诱导B细胞分化为浆细胞,采用ELISA检测基因编辑后B细胞培养上清液中IgM、IgG2c、IgG3抗体类别的丰度,通过独立样本t检验比较sg-NC组与sg-Tbx21组细胞上清液中抗体水平的差异。结果·①经分析GEO数据库发现,γ干扰素可以诱导B细胞中Tbx21基因的表达,且在T-bet的转录调控下,B细胞展现抗体类别转换相关通路活化的转录组特征。②使用浓缩后的高滴度病毒感染激活的B细胞,可以构建高效的反转录病毒感染原代B细胞体系。③Cas9转基因小鼠原代B细胞转染sg-Tbx21质粒后成功实现Tbx21基因敲除,敲除效率约为59%。④在体外诱导B细胞分化为浆细胞的条件下,sg-Tbx21转染后的B细胞培养上清液中IgG2c水平显著降低(P=0.000),IgM和IgG3的水平无明显的变化。结论·通过浓缩反转录病毒和协同刺激激活原代B细胞的方式可提高sgRNA递送的效率,在Cas9转基因小鼠原代B细胞中敲除Tbx21基因;应用这一系统证明了T-bet敲除后阻碍了IgG2c抗体类别的产生。

靶向小鼠ATP7B基因的CRISPR/Cas9系统构建与评价

目的使用CRISPR/Cas9系统靶向小鼠ATP7B基因,建立高效的ATP7B基因CRISPR/Cas9编辑系统,模拟人ATP7B基因突变,为更深入地开展威尔逊病(WD)分子机制研究和疾病干预奠定基础。方法选择我国WD的热点突变,对应小鼠ATP7B基因上的突变区域,设计单向导RNA(sgRNA),构建表达质粒,并与Cas9表达质粒共转染到小鼠N2a细胞,采用药物(嘌呤霉素和杀稻瘟菌素)筛选阳性细胞并提取gDNA,将目标位点的DNA片段进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,然后通过TA克隆序列结果分析对目标基因的打靶效率。结果成功设计sgRNAs序列,并使用CRISPR/Cas9系统编辑了小鼠ATP7B基因,编辑效率为53.85%,创建了ATP7B基因突变细胞模型。结论通过靶向小鼠ATP7B基因,成功构建CRISPR/Cas9系统,这对深入研究WD的致病机制、探讨WD的治疗具有重要意义。

CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展

CRISPR/Cas9(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)是最近发现的一种新型的基因组定点编辑技术。CRISPR即成簇的、有规律的、间隔短回文重复序列,是人们在研究大肠杆菌编码的碱性磷酸酶基因时发现的,它原本是存在于细菌和古细菌基因组中含有多个短重复序列的基因位点,能够为自身提供一种特异性免疫保护机制,抵御外来病毒、质粒等遗传元件的入侵。CRISPR系统主要依赖cr RNA(CRISPR RNA)和tracr RNA(Trans-activating chimeric RNA)结合并导向Cas(CRISPR-associated system)蛋白来对外源DNA进行序列特异性降解。目前已经发现了3种类型的CRISPR/Cas系统:Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中Ⅱ型系统组分较为简单,主要依赖的是Cas9核心蛋白,在RNA的介导下,Cas9蛋白能够识别靶序列进行切割造成DNA的双链断裂(Double-strand breaks,DSB)。在此基础上,人们可以对基因组的特定位点进行基因打靶、基因定点插入、基因修复等各种遗传操作。这种新的基因组定点编辑技术比类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)和锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease,ZFN)技术设计更加简单、更容易操作,势必会有更广泛的应用。目前,利用该技术已在多个物种的细胞和个体水平上实现了遗传操作。文中将从CRISPR/Cas9的来源、结构、作用机理方面介绍其研究进展,为开展这一领域的研究工作提供参考。

Crispr/Cas9技术在CHO细胞中基因敲除的应用

Crispr/Cas9技术是近年发展起来的基因编辑技术,已经在人、动物、植物等各类细胞中得到广泛应用。本文基于文献和本实验室研究成果,介绍了Crispr/Cas9技术在CHO细胞中运用的基本操作方法,以及与重组蛋白表达相关的基因敲除实例,对可能遇到的问题做出了技术解释。笔者认为可利用Crispr/Cas9技术对CHO细胞进行改造以创造出新的工程细胞株,为生物药物开发及生产服务。

CRISPR/Cas:新一代基因编辑技术

CRISPR/Cas技术是一项新兴的基因编辑技术,它利用与目标序列互补的向导RNA(sg RNA)引导Cas酶定点切割DNA。由于该技术操作简便、要求低,已成为近几年最受关注的基因编辑技术。而随着该技术的广泛使用和人们对CRISPR/Cas系统了解的不断深入,对该技术优与劣的争论也不断升温。本文就该技术的起源、CRISPR/Cas系统的工作原理,以及目前的主流应用和成果进行了介绍,希望能够帮助人们对CRISPR/Cas技术有一个更全面的了解。

基于CRISPR/Cas9的激活系统研究进展

基因编辑技术自问世以来就一直作为生物技术领域的研究热点。基因编辑工具成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关系统(CRISPR/Cas系统)具有特异性、简便性和灵活性等优点,为研究人员提供了丰富的遗传操作工具,也让CRISPR/Cas系统的应用在多种生物中得到了飞速发展。特别是将转录激活因子与失活的Cas蛋白结合,可在RNA转录水平实现基因表达特异性调控,为生物技术在医学研究及农业领域的发展做出了重要的贡献。外源基因的过表达是验证基因功能和基因调控的常用方法,然而由于载体容量的限制难以实现多基因过表达。基于CRISPR/Cas9激活系统可在不同向导RNA的引导下对多个基因进行调控,实现调控水平验证基因功能。本文通过对CRISPR/Cas9激活系统组成及不同激活策略进行总结,整理针对过度激活的解决方案,为CRISPR/Cas9激活系统应用于棉花遗传改良及除草剂抗性研究提供更多参考。

利用常间回文重复序列丛集及相关蛋白9系统敲除小鼠肾集合管上皮细胞系的水通道蛋白2基因

目的利用常间回文重复序列丛集(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)系统敲除小鼠肾内髓集合管3(m-IMCD3)上皮细胞的水通道蛋白2(Aqp2)基因。方法在小鼠Aqp2基因的第1、4个外显子上各设计两个小向导RNA(sgRNA),分别为sgRNA1-1、sgRNA1-2、sgRNA4-1、sgRNA4-2,并将其成功克隆进常间回文重复序列丛集慢病毒载体2上。将测序正确的质粒转染到m-IMCD3细胞中,提取各单克隆细胞系的基因组DNA,通过聚合酶链反应扩增出sgRNA作用靶点的DNA片段并测序。利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫荧光检测Aqp2的表达。结果成功构建出含有相应sgRNA的载体;4个sgRNA对Aqp2基因的靶点都有切割作用;sgRNA1-1与sgRNA4-2组合能成功把两者间5500bp的DNA片段敲除;应用RT-PCR及免疫荧光证实应用CRISPR/Cas9系统敲除Aqp2后,该m-IMCD3细胞系中的Aqp2mRNA及蛋白几乎未见表达。结论通过CRISPR/Cas9系统可获得Aqp2基因敲除的肾集合管上皮细胞系。

CRISPR/Cas9技术及其在药物研发中的应用

CRISPR/Cas是新近在细菌及古细菌中发现的一种可以降解外源核酸的获得性免疫调节系统,它由成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和蛋白质Cas组成,其中Ⅱ型CRISPR/Cas9系统成分最简单,包括:cr RNA(CRISPR RNA)、tracr RNA(trans-activating cr RNA)、Cas9(CRISPR-associated protein),tracr RNA通过RNaseⅢ功能促进cr RNA的成熟,由cr RNA通过碱基配对识别并向导Cas9结合靶标DNA,最后Cas9蛋白通过自身内切核酸酶的活性剪切DNA,达到定点编辑DNA的作用。该技术已被广泛应用于多项科研领域,仿效CRISPR/Cas9作用机理,人工构建融合了tracr RNA和cr RNA序列的一种特殊小向导RNA(small guide RNA,sg RNA)与Cas9的复合体,即能实现定点编辑基因的效果,且操作简捷、高效。文章综述了CRISPR/Cas9技术在药物研发中的应用,如细胞株改造、基因修复、动物模型构建、药物靶点筛选、遗传疾病治疗等。