基于吕氏泰勒虫4种靶基因的PCR检测方法比较

为筛选特异、敏感的吕氏泰勒虫(Theileria luwenshuni)PCR检测基因,本试验分别以吕氏泰勒虫核糖体小亚基RNA(18S rRNA)基因、主要表面蛋白(MPSP)、内转录间隔区(ITS)基因和线粒体细胞色素C氧化酶1(Cox 1)基因为靶基因进行PCR检测,并对特异性、敏感性和临床样本检出率进行对比。结果显示,4种靶基因引物均只可扩增出吕氏泰勒虫DNA,扩增不出卵形巴贝斯虫、中华泰勒虫和附红细胞体DNA,具有较好的特异性。以18S rRNA为靶基因的PCR检测方法的敏感性最高,检测量为9.82×103 copies/μL;以cox 1为靶基因的PCR检测方法的敏感性最低,检测量为9.82×105 copies/μL。在此基础上对18S rRNA基因PCR扩增引物进行筛选,引物P3具有较好的特异性和敏感性,为最佳检测引物。临床绵羊血液样本的检测结果显示,以18S rRNA为靶基因的PCR检测方法的检出率最高,为33.33%(15/45),高于MPSP、ITS基因的26.67%(12/45)和cox 1基因的22.22%(10/45)。结果表明,以18S rRNA为靶基因的吕氏泰勒虫的PCR检测方法具有较好的特异性和敏感性,可用于吕氏泰勒虫病的诊断和流行病学调查。

吕氏泰勒虫cDNA表达文库的构建及其抗原基因的免疫筛选

【目的】构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库,并从中筛选抗原候选基因。【方法】从吕氏泰勒虫裂殖子直接提取和纯化mRNA,采用oligo(dT)引物合成双链cDNA,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将所产生的cDNA分子定向克隆到具有EcoRⅠ/HindⅢ粘性末端的λSCREEN载体的两臂之间。用PhageMaker extract对连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,并用之转染大肠杆菌ER1647,从而构建成吕氏泰勒虫的cDNA表达文库。用吕氏泰勒虫阳性血清和兔抗绵羊IgG-AP筛选得到阳性克隆,经测序和Blast软件分析并获得新基因。【结果】成功构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库,其初级库容量约为1.0×106PFU,扩增文库的滴度为8.2×108PFU·ml-1,文库重组率为100%;通过免疫学筛选、测序和Blast软件分析,共获得30个新基因,其中15个基因已登录GenBank/NCBI。【结论】为研究泰勒虫疫苗、新型医药和诊断抗原,以及发展可持续性防制羊泰勒虫病提供基本材料。

吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫内转录间隔区基因序列的测定与系统进化分析

自试验感染吕氏泰勒虫（渭源株）和尤氏泰勒虫（隆德株）绵羊的血液中纯化虫体，提取虫体基因组DNA，通过PCR扩增内转录间隔区（ITS1-5．8S-ITS2 rRNA）基因，然后进行测序，构建了系统发生树并与GenBank中各种动物梨形虫的ITS1-5．8S-ITS2 rRNA基因序列进行比较。结果显示，这两种泰勒虫的ITS1-5．8S-ITS2 rRNA基因大小为817-842bp，同源性高达96．8％，分布在同一大枝上。通过比较ITS基因的同源性，尤其是ITS2基因的变异性，可以区别这两种泰勒虫与其他梨形虫。

吕氏泰勒虫主要表面蛋白P32基因的克隆与序列分析

从吕氏泰勒虫宁县株中提取RNA,用RT-PCR方法扩增主要表面蛋白P32基因的cDNA片段,克隆后测定其核苷酸序列,并推导了相应的氨基酸序列。结果表明,扩增的P32基因长度为875个核苷酸,共编码284个氨基酸。核苷酸序列与已发表的牛的4种泰勒虫的主要表面蛋白基因相比较,其与瑟氏泰勒虫俄罗斯株、日本株、中国辽阳株的核苷酸和氨基酸序列相似性均在98.9%以上。其推导的氨基酸序列中有3个糖基化位点。

湘西地区吕氏泰勒虫的遗传多样性及遗传进化分析

为了探究湖南湘西地区吕氏泰勒虫的基因变异情况、遗传多样性及其遗传进化关系,试验以采集于湘西地区的16株羊源吕氏泰勒虫为研究对象,运用PCR技术扩增其核糖体18S rRNA和线粒体cox1基因序列,以此对其遗传多样性及遗传进化关系进行研究。结果表明:所获得的16株羊源吕氏泰勒虫核糖体18S rRNA基因序列的长度均为384 bp,共包含9个变异位点,种内差异为0~1.8%,种间差异为5.4%~62.1%;cox1基因序列的长度均为1092 bp,其内共含2个变异位点,种内差异为0~0.2%,种间差异为16.7%~20.4%。此外,在基于18S rRNA和cox1基因序列所构建的遗传进化树中均发现,来自于湘西地区的16株羊源吕氏泰勒虫共位于进化树的同一分支上。说明湘西地区吕氏泰勒虫之间尽管存在一定程度的基因变异,但具有较近的亲缘关系,未出现明显的遗传分化。

羊吕氏泰勒虫PCR检测方法的建立与应用

为建立一种准确、敏感的羊吕氏泰勒虫检测方法,根据Gen Bank上发表的羊吕氏泰勒虫18S rRNA基因序列(登录号:KC735166.1),设计1对特异性引物,建立了PCR检测方法。筛选该方法的最佳反应条件及体系,并进行了敏感性、特异性、重复性试验及临床血液样品检测。结果表明,该方法能扩增出大小为962 bp的羊吕氏泰勒虫特异性片段,与GenBank收录的相关参考序列同源性高达99.4%~99.9%;与绵羊泰勒虫、尤氏泰勒虫、环形泰勒虫、莫氏巴贝斯虫和弓形虫基因组DNA均无交叉反应;DNA最低检测量为29.13 fg·μL^(-1);具有良好的重复性;对76份羊临床血液样品检测结果表明,羊吕氏泰勒虫感染率为77.63%,高于已报道的常规PCR检测结果。

中国不同地区羊吕氏泰勒虫分子流行病学调查及遗传进化分析

为了解吕氏泰勒虫在中国不同地区山羊和绵羊中的流行情况,本研究应用基于吕氏泰勒虫18S rRNA基因位点的PCR检测方法,对采自中国河南、甘肃、陕西、山西、贵州、云南、新疆7个地区的281份羊血液样品进行检测,并对阳性样品测序以进行序列分析。结果显示,羊吕氏泰勒虫总感染率为35.23%(99/281)。不同采样点羊吕氏泰勒虫感染率差异极显著(P<0.01),其中河南省羊吕氏泰勒虫感染率最高(98%,49/50),新疆最低(0)。绵羊和山羊吕氏泰勒虫感染率分别为51.67%(31/60)和30.77%(68/221),差异极显著(P<0.01);放牧羊吕氏泰勒虫感染率(41.55%,86/207)极显著高于舍饲羊(17.57%,13/74)(P<0.01);羊吕氏泰勒虫感染率在春、夏、秋及冬四季分别为56.00%(28/50)、42.75%(59/138)、9.43%(5/53)和17.50%(7/40),差异极显著(P<0.01);≥12月龄和<12月龄羊吕氏泰勒虫感染率分别为33.50%(67/200)和39.51%(32/81),差异不显著(P>0.05)。此外,遗传进化分析表明,本研究获得的羊吕氏泰勒虫分离株与中国流行的吕氏泰勒虫分离株同源性高达99.60%以上,且位于同一分支上。本研究为进一步了解中国不同地区羊吕氏泰勒虫的流行现状及分布提供了重要参考依据。

陕西麟游县山羊吕氏泰勒虫感染调查及其遗传进化分析

为了解陕西麟游县山羊吕氏泰勒虫感染情况,应用聚合酶链反应(PCR)方法对采自陕西麟游的209份山羊血液样品进行吕氏泰勒虫18S小亚基核糖体核糖核酸基因扩增,并对部分阳性样品进行遗传进化分析。调查显示,吕氏泰勒虫总感染率为61.2%(128/209);不同饲养方式、不同年龄、不同季节山羊的吕氏泰勒虫感染率均差异性显著(P<0.05,P<0.05,P<0.05)。遗传进化分析表明,研究获得的泰勒虫分离株与吕氏泰勒虫(GenBank登录号:LC326009)位于同一分支上。该调查结果丰富了我国吕氏泰勒虫流行病学资料,并为该地区及同类地区羊泰勒虫病的防控提供科学依据。

湘西地区吕氏泰勒虫的单倍型多样性及种系发育关系分析

为探究湘西地区吕氏泰勒虫的单倍型多样性及其种系发育关系,以采自于湘西地区的16株羊源吕氏泰勒虫为研究对象,PCR扩增其核糖体18S rRNA、线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cox1)基因序列,并分析其单倍型多态性及种系发育关系。结果表明,湘西地区吕氏泰勒虫核糖体18S rRNA基因序列的长度为384 bp,含9个变异位点、7个单倍型(A1—A7),单倍型多样性Hd为0.775;cox1基因序列的长度为1 092 bp,存在2个变异位点、4个单倍型(B1—B4),单倍型多样性Hd为0.625;在18S rRNA+cox1重组的基因序列中,共含有11个变异位点、10个单倍型(C1—C10),单倍型多样性Hd为0.925;其中,A1、A4、B1、B3、B4、C1、C8与C9均为古老单倍型。系统发育分析结果显示,供试的16株羊源吕氏泰勒虫均处于系统发育树的同一分支上。这说明来自于湘西地区的16株羊源吕氏泰勒虫之间尽管存在一定程度的基因变异现象和单倍型多样性,但它们之间存在共同古老的单倍型,表明其个体之间和单倍型之间均具有较近的亲缘关系,未出现遗传分化。

吕氏泰勒虫与尤氏泰勒虫形态学、标签基因选择及其遗传进化分析

为比较吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫形态学及选择合适基因标签,以期探究它们间的遗传进化关系。借助光学显微镜观察2种泰勒虫的形态结构;利用PCR技术分别扩增了吕氏泰勒虫与尤氏泰勒虫的cox1、18S rRNA及28S rRNA等3个标签基因的部分序列,分别比对它们相应基因的同源性,分析吕氏泰勒虫与尤氏泰勒虫基因差异,并利用其cox1、18S rRNA和28S rRNA基因序列分别构建了它们的遗传进化树。研究结果表明,吕氏泰勒虫多呈圆点形、卵圆形和短杆状,而尤氏泰勒虫多呈逗点状、十字架状及三叶草形;吕氏泰勒虫cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列的长度分别为1122、1303、1995 bp;尤氏泰勒虫cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列的长度分别为1123、1303、1990 bp;两者cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列比对,其相似度分别为80.32%、95.87%及88.64%;所构建的3个遗传进化树均显示吕氏泰勒虫与尤氏泰勒虫未处于进化树一分支。提示吕氏泰勒虫与尤氏泰勒虫尽管形态极为相似,但它们间存在较远的亲缘关系,且cox1、18S rRNA及28S rRNA基因序列适用于泰勒虫种属的鉴别。

吕氏泰勒虫抗原蛋白PIP的表达及抗原性分析

本研究通过构建原核表达系统对吕氏泰勒虫(Theileria luwenshuni)抗原蛋白PIP进行表达,并利用生物信息学软件对该蛋白的抗原表位和功能进行分析。以吕氏泰勒虫DNA为模板成功扩增目的基因PIP,构建的重组表达载体pTYB12-PIP在大肠杆菌BL21(DE3)中表达得到重组蛋白CBP-PIP。生物信息学分析结果表明,该蛋白具有一定的抗原性,41~48位、68~75位、110~116位、122~129位、147~149位及151~158位氨基酸可能为B淋巴细胞抗原表位,而T淋巴细胞抗原表位可能有8个。通过Western Blot试验验证,表明该蛋白与吕氏泰勒虫阳性血清有免疫反应,具有良好的抗原性。

云南绵羊感染吕氏泰勒虫的鉴定及其遗传进化分析

为了解云南高海拔地区绵羊泰勒虫的分型,从临床上出现焦虫可疑临床症状的绵羊养殖场采集病料,通过形态学和分子生物学相结合的方法对16份来自高海拔地区昭通永善县的绵羊血液样品进行检测。血液涂片染色后形态学检测结果表明,其中4份血液涂片的红细胞内虫体直径约0.5~1.5μm,呈圆点形、卵圆形或短杆状。血液样品DNA PCR扩增、焦虫18S序列比对及基于核糖体小亚基RNA(small subunit ribosamal RNA,SSU rRNA)基因位点分析结果表明,本次可疑送检绵羊的血液病原为吕氏泰勒虫,检测株与国内报道的感染株同源性为99.6%~100%,属同一亚型,未出现变异虫株。

羊吕氏泰勒虫陕西分离株的鉴定及遗传进化分析

为了对陕西省羊血液样品中的泰勒虫（Theileria sp．）进行种类鉴定和遗传学分析，本试验利用形态学方法对采集的血液样品通过涂片和姬姆萨染色后进行显微镜观察，发现红细胞内存在大小1．0～1．5μm、原生质呈淡蓝色、染色质呈红色并处于红细胞内侧边缘的多形性虫体。利用分子生物学方法，对梨形虫主要表面蛋白（major piro—plasm surface protein，MPSP）基因进行PCR扩增、序列分析以及进化树构建，发现有2份DNA样品（TL001和TL002）扩增出大小约800bp的目的条带。序列比对和种系发育树表明，分离到的2个虫株与GenBank中neileria luwenshuni（GQ281044）序列相似性分别为100％和99％，且位于同一进化支，提示本试验所分离到羊血液原虫为吕氏泰勒虫（T．luwenshuni），同时也为该地区羊泰勒虫病的防制奠定基础。

吕氏泰勒虫TlSP基因的克隆和原核表达

为克隆表达吕氏泰勒虫TlSP基因的功能区片段并对其表达蛋白进行免疫印迹分析,以吕氏泰勒虫cDNA表达文库为模板,PCR扩增出TlSP基因片段,克隆至pET-30a载体。将成功构建的重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21trxB(DE3)pLysS,诱导表达产物用镍柱进行亲和层析纯化,并用Western-blot分析TlSP表达蛋白与尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫以及环形泰勒虫阳性血清是否产生交叉反应。结果表明,TlSP基因获得了可溶性表达蛋白,并且重组表达蛋白TlSP分别与上述3种泰勒虫阳性血清存在交叉反应。证实TlSP同源基因也存在于环形泰勒虫、尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫,这为今后深入研究TlSP蛋白在羊泰勒虫病的免疫学诊断和亚单位疫苗研究中的作用奠定了基础。

吕氏泰勒虫TlSP基因在真核细胞中的表达与定位

为研究吕氏泰勒虫TlSP基因在真核细胞中的表达与亚细胞定位,构建了pEGFP-N1-TlSP重组表达质粒,经脂质体转染Vero细胞后,用Western-blot验证了该蛋白在Vero细胞的表达;用荧光显微镜和激光共聚焦显微成像技术确定了TlSP重组蛋白在真核细胞中的分布及亚细胞定位。结果表明重组质粒pEGFP-N1-TlSP在Vero细胞中获得了表达,绿色荧光主要聚集于细胞浆,而在空载体pEGFP-N1转染组,绿色荧光弥散性分布于细胞核。吕氏泰勒虫TlSP融合基因在外源真核细胞Vero中成功进行了表达,表达蛋白主要定位于Vero细胞的细胞浆。

与吕氏泰勒虫TlSP蛋白互作的绵羊淋巴细胞蛋白酵母双杂交系统的筛选

为研究吕氏泰勒虫入侵绵羊淋巴细胞的机理,用绵羊外周血淋巴细胞构建酵母双杂交文库,筛选与TlSP蛋白互作的蛋白。以密度梯度离心法分离出未感染泰勒虫的绵羊淋巴细胞,TRIzol法提取总RNA,建立酵母双杂交cDNA文库。结果显示,对文库进行评定,细胞密度为1.075×109/mL,插入片段长度在250~3 000bp之间,文库滴度为1.088×108 CFU,重组率为92%。利用诱饵质粒pGBKT7-TlSP对文库进行筛选,结果筛选到9种蛋白。生物信息学分析结果显示,这些蛋白主要参与调控基因转录、mRNA翻译、细胞的增殖、分化和凋亡等过程。上述结果表明,通过酵母双杂交技术筛选出与TlSP互作的蛋白,据此推测TlSP蛋白可能与吕氏泰勒虫在绵羊淋巴细胞内的增殖相关。

吕氏泰勒虫TlSP无跨膜区重组蛋白的表达及反应原性分析

提取吕氏泰勒虫裂殖子的总RNA,采用RT-PCR方法扩增其表面蛋白TlSP(Theileria luwenshuni surface protein)基因的cDNA片段,结合生物信息学方法,对TlSP蛋白抗原表位和跨膜区进行预测,设计表达引物,分别扩增得到TlSP全长及逐一去除跨膜区的4个片段,并将其分别克隆至pET-30a原核表达载体,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S感受态细胞进行诱导表达,并对融合蛋白的反应原性进行分析。结果表明,TlSP融合蛋白的N端具有较好的抗原性,而在C端存在3个跨膜区:185~207 aa、228~250 aa和255~277 aa;SDS-PAGE结果表明,只有去除全部跨膜区的重组载体可成功表达。Western-blot分析表明,TlSP融合蛋白能与吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫及环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与巴贝斯虫、羊无浆体阳性血清无交叉反应。本研究为今后TlSP候选亚单位疫苗的研究奠定了基础。

吕氏泰勒虫TlSP基因多态性免疫区在毕赤酵母中的高效分泌表达

为研制具有完整抗原性和天然结构的吕氏泰勒虫表面蛋白TlSP（Theileria luwenshuni surface protein）,采用RT-PCR方法从吕氏泰勒虫裂殖子总RNA反转录获得TlSP基因的c DNA序列,将其多态性免疫区域克隆至毕赤酵母表达载体p PIC9K,构建重组质粒p PIC9K-TlSP。p PIC9K-TlSP经SalⅠ酶切线性化后,电转化导入毕赤酵母菌株GS115和KM71中,经遗传霉素G-418筛选后得到高拷贝菌株,对PCR鉴定为阳性的菌株进行甲醇诱导表达。对GS115和KM71两种菌株表达重组蛋白TlSP的效果进行评估,并对TlSP的反应原性进行了分析。结果表明,反转录获得的TlSP基因的c DNA序列长为888 bp,其中多态性免疫区域长为552 bp;筛选得到抗遗传霉素G-418（4.0 mg/m L）的GS115菌株5株,KM71菌株7株,经PCR鉴定为阳性的2种菌株均成功表达了分泌型重组蛋白TlSP,GS115菌株的蛋白表达效果较好;重组蛋白TlSP能与吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫及环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与巴贝斯虫、绵羊无浆体阳性血清无反应。本研究为深入研究TlSP蛋白在羊泰勒虫病免疫学诊断和亚单位疫苗中的应用奠定了基础。

真核表达的吕氏泰勒虫TlSP重组蛋白的免疫保护效果评价

为评价重组吕氏泰勒虫TlSP蛋白的免疫保护效果,以真核表达的不同浓度的重组TlSP抗原分别与等体积的佐剂MONTANIDE ISA 61 VG混合后充分乳化,于首次免疫后第0天和第21天分别免疫绵羊2次,于第35天进行攻蜱试验,通过观察在试验期间各组绵羊的临床症状、红细胞染虫率和特异性抗体效价等来评价免疫保护效果;空白对照组以等量PBS代替抗原进行同步参照分析。结果显示,空白对照组的绵羊出现高热、贫血和淋巴结肿胀等典型的临床症状,而2个重组蛋白免疫组只出现轻微贫血。空白对照组、免疫A组（600 g）和免疫B组（300 g）分别于攻蜱后第20天、36天和29天最早发现血液中出现泰勒虫,最高染虫率分别为8.60%、1.12%和3.00%,特异性抗体最高效价分别为1∶8 192、1∶65 536和1∶32 768。TlSP重组亚单位疫苗能刺激特异性T淋巴细胞的增殖,提高机体IL-2、IL-4和IFN-γ的分泌水平。本研究为今后羊泰勒虫病的防治奠定了基础。

吕氏泰勒虫TlSP重组亚单位疫苗免疫保护效果的评估

为了评价吕氏泰勒虫表面蛋白Tl SP（Theileria luwenshuni surface protein）的免疫保护效果,分别用150 g/只和300 g/只乳化后的Tl SP蛋白免疫试验Ⅰ组和Ⅱ组绵羊,对照组为等量PBS,每组5只。二免后第14天,每只绵羊用50只青海血蜱饥饿成蜱进行攻蜱试验。结果显示,对照组绵羊攻蜱后出现跛行、体温2次升高和淋巴结肿大等症状,发病率为100%,死亡率为40%,染虫率在2.23%~3.50%之间;试验Ⅰ组和Ⅱ组绵羊免疫后产生的最高抗体效价分别为1∶102 400和1∶25 600,发病率均为60%,表现轻度临床症状而未发生死亡,染虫率在1.23%~1.89%之间。上述结果证实,制备的Tl SP重组亚单位疫苗在抗泰勒虫感染上具有良好的免疫保护效果,为进一步开展羊泰勒虫病亚单位疫苗的研制奠定了实验基础。