外源CRE顺式元件对慢性吗啡作用SK-N-SH细胞CREB蛋白表达及DNA结合活性的影响

目的: 研究以cAMP反应元件结合蛋白 (cAMPresponseelementbindingprotein,CREB)为靶点的CREB转录因子诱骗 (CRE transcriptionfactordecoyoligodeoxynucleotide、CRE decoyODN)对慢性吗啡作用SK N SH细胞CREB相关指标的影响.方法: 体外合成含cAMP反应元件 (cAMPresponseelement,CRE)的单链寡核苷酸,以DOTAP为转移介质,将CRE decoyODN与慢性吗啡作用和纳络酮催促戒断的SK N SH细胞共同孵育,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影检测CRE decoyODN细胞掺入;EMSA检测CRE decoyODN与转录因子CREB结合的特异性以及其对慢性吗啡作用SK N SH细胞CREB的DNA结合活性影响;WesternBlot检测CREB 1及磷酸化CREB 1蛋白表达.结果: 以DOT AP为介质,将CRE decoyODN成功导入SK N SH细胞;慢性吗啡作用及纳络酮催促戒断使SK N SH细胞CREB的DNA结合活性和磷酸化CREB 1 蛋白表达明显增高 (P值均<0 01),CREB 1蛋白无明显改变,CRE decoyODN可抑制CREB的DNA结合活性和磷酸化CREB 1蛋白表达的改变(P<0 01),对CREB 1蛋白表达无明显影响.结论: CRE de coyODN可特异抑制慢性吗啡作用及纳络酮催促戒断SK N SH细胞CREB的DNA结合活性和磷酸化CREB 1蛋白表达的增高,对CREB 1蛋白表达无明显影响.

CREB_1蛋白在大鼠急、慢性吗啡依赖和戒断中的表达变化

目的研究急、慢性吗啡依赖和戒断对大鼠脑组织cAMP反应元件结合蛋白(CREB1)的表达调节作用。方法雄性SD大鼠36只,随机分为急性对照组、急性吗啡依赖组、急性吗啡戒断组、慢性对照组、慢性吗啡依赖组、慢性吗啡戒断组,每组6只。采用免疫组化方法测定不同脑区和核团CREB1蛋白表达水平。结果急性吗啡依赖和戒断抑制蓝斑CREB1蛋白表达。慢性吗啡依赖和戒断增加皮质、海马、蓝斑等脑区核团CREB1蛋白的表达,但是在慢性吗啡依赖和戒断时,伏隔核CREB1蛋白表达下降。结论急、慢性吗啡依赖和戒断时CREB1在大鼠皮质、海马、下丘脑、蓝斑、伏隔核等脑区的表达存在差异,可能与介导阿片类药物依赖信号转道通路的反应性不同有关。

转录因子CREB激活介导吗啡依赖SK-N-SH细胞的nNOS及fosB基因表达的调控机制

目的 探讨吗啡依赖的SK- N -SH细胞表达神经元型一氧化氮合酶 (neuronalnitricoxidesynthase ,nNOS)及fosB基因的调控机制。方法 建立吗啡依赖及戒断细胞模型 ,体外合成含cAMP反应元件 (cAMPresponseelement ,CRE)序列的寡核苷酸 ,经硫代磷酸化修饰 ,作为单链寡核苷酸 (CRE transcriptionfactordecoyoligodeoxynucleotide ,CRE decoyODN)。分别采用电泳迁移率改变分析 (electrophoresismobilityshiftassay ,EMSA)及RT -PCR技术 ,检测CRE decoyODN对吗啡依赖及纳络酮急性戒断诱导的CREB的DNA结合活性、nNOS及fosBmRNA表达的影响。结果 吗啡依赖及纳络酮急性戒断使SK- N- SH细胞的CREB的DNA结合活性、nNOS及fosBmRNA明显升高 ,CRE decoyODN可特异抑制上述指标升高。结论 CREB的激活介导了吗啡依赖SK- N

环磷酸腺苷反应元件结合蛋白在吗啡依赖及戒断大鼠脑区的表达

目的 研究吗啡依赖及吗啡戒断时环磷酸腺苷反应元件结合蛋白 (CREB)在大鼠脑内的表达。方法 将 1 5只雄性Sprague Dawley大鼠随机分为正常对照组、吗啡依赖组和吗啡戒断组 ,每组各 5只。于大鼠背部皮下注射吗啡 ,第 1天注射 2 0mg/kg ,逐日递增剂量 ,至第 5天达 1 0 0mg/kg ,形成大鼠吗啡依赖模型。吗啡戒断组大鼠在末次注射吗啡后 1 6h皮下注射纳洛酮 1mg/kg。采用免疫印迹法观察各组大鼠的前额叶皮质、伏隔核和海马等脑区CREB的表达。结果 (1 )在前额叶皮质 ,吗啡依赖组和吗啡戒断组CREB的含量 (为相对光密度值 )分别为 [(1 31± 1 1 ) % ]和 [(1 33± 1 5) % ] ,均高于正常对照组 [(1 0 0± 1 4 ) % ] ,差异有显著性 (P <0 0 5) ;(2 )在伏隔核 ,三组CREB的差异无显著性(P >0 0 5) ;(3)在海马 ,吗啡戒断组CREB的含量 [(1 4 1± 1 8) % ]高于正常对照组 [(1 0 0± 1 4 ) % ] ,差异有非常显著性 (P <0 0 1 )。结论 大鼠处于吗啡依赖和戒断时CREB的表达在前额叶皮质和海马发生改变 。

脊髓ERK—CREB信号通路在吗啡依赖大鼠戒断反应中的作用

目的评价脊髓背角神经元细胞外信号调节激酶-cAMP反应元件结合蛋白（ERK-CREB）信号通路在吗啡依赖大鼠戒断反应中的作用。方法健康雄性SD大鼠，体重200～250g，2月龄。经枕骨大孔行鞘内置管，取置管成功的50只大鼠，采用随机数字表法，将其随机分为5组（n=10）：对照组（C组）、吗啡依赖组（MD组）、吗啡戒断组（MW组）、U0126组和二甲基亚砜组（DMSO组）。皮下注射吗啡10mg／kg，2次／d，隔天每次增加10mg／kg，至第6天末次注射50mg／kg，建立吗啡依赖模型。末次注射后4h，MW组、U0126组和DMSO组腹腔注射纳洛酮激发吗啡戒断反应。给予纳洛酮前30min时，U0126组和DMSO组分别鞘内注射U0126（溶于10ulDMSO中）150btg和DMSO10ul。于注射纳洛酮后1h内行戒断反应评分和促诱发痛评分，注射纳洛酮后1h处死大鼠，取脊髓组织，分别采用免疫组织化学法和Westernblot法测定脊髓背角磷酸化ERK（p-ERK）和磷酸化CREB（p-CREB）的表达。结果与c组比较，MW组脊髓背角p-ERK和p-CREB表达上调（P〈0．05）；与MD组比较，MW组、U0126组和DMSO组戒断反应评分和促诱发痛评分升高（P〈0．05）；与MW组比较，U0126组戒断反应评分和促诱发痛评分降低，脊髓背角p-ERK和p-CREB表达下调（P〈0．05），DMSO组上述指标差异无统计学意义（P〉0．05）。结论脊髓背角神经元ERK—CREB信号通路参与了吗啡依赖大鼠的戒断反应。

急性或慢性吗啡依赖和戒断对大鼠脑组织CREB-1表达的影响

目的研究急性或慢性吗啡依赖和戒断大鼠脑组织环腺苷酸反应元件结合蛋白-1 (CREB-1)表达的变化。方法雄性SD大鼠30只,随机分为5组(n=6):空白对照组、急性吗啡依赖组、急性吗啡戒断组、慢性吗啡依赖组、慢性吗啡戒断组。急性吗啡依赖组每次背部皮下注射吗啡5 mg/kg,间隔2 h,连续8次;急性吗啡戒断组在急性吗啡依赖后3 h腹腔注射纳洛酮5 mg／kg,催促戒断30 min后处死大鼠。慢性吗啡依赖组每日吗啡用量分3次腹腔注射,从第一天用量5 mg/kg起,直到第12天递增至260 mg／kg,慢性吗啡戒断组在慢性吗啡依赖后的次日腹腔注射纳洛酮5 mg/kg,催促戒断24h后处死大鼠。用Western-blot法测定大脑皮层、伏隔核及海马CREB-1表达。结果与空白对照组比较,急性吗啡依赖、戒断组皮层、伏隔核和海马CREB-1表达差异无统计学意义(P>0．05),慢性吗啡依赖、戒断组皮层、海马CREB-1表达上调,伏隔核CREB-1表达下调(P<0．05);与慢性吗啡依赖组比较,慢性吗啡戒断组伏隔核CREB-1表达下调(P<0．05)。结论急性吗啡依赖、戒断对脑组织CREB-1表达无影响;而慢性吗啡依赖、戒断后不同脑区CREB-1表达不同。

脊髓神经元ERK5/CREB信号通路在吗啡依赖大鼠戒断反应中的作用

目的 评价脊髓神经元细胞外信号调节蛋白激酶5/cAMP反应元件结合蛋白（ERK5/CREB）信号通路在吗啡依赖大鼠戒断反应中的作用.方法 取鞘内置管成功的成年雄性SD大鼠96只,体重200～ 250 g,采用随机数字表法,将其分为4组（n=24）：正常对照组（A组）、吗啡戒断组（B组）、二甲基亚砜＋吗啡戒断组（C组）和ERK5抑制剂BIX02188＋吗啡戒断组（D组）.B组、C组和D组皮下注射吗啡,第1天剂量10 mg/kg,第2～5天剂量每天增加10 mg/kg,第6天剂量50 mg/kg,建立大鼠吗啡依赖模型,A组给予等容量生理盐水.B组和D组于末次注射吗啡后4h腹腔注射纳洛酮4mg/kg,建立吗啡戒断模型,D组给予纳洛酮前1h鞘内注射BIX02188 10 μg,C组给予等容量二甲基亚砜.给予纳洛酮后1h内进行戒断反应评分和戒断反应诱发痛觉过敏评分.处死大鼠,取L4.5节段脊髓组织,测定CREB和磷酸化CREB（p-CREB）的表达水平.结果 与A组比较,B组、C组和D组戒断反应评分和痛觉过敏评分升高,脊髓p-CREB表达上调（P＜0.05）;与B组比较,D组戒断反应评分和痛觉过敏评分降低,脊髓p-CREB表达下调（P＜0.05）,C组上述指标差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 脊髓神经元ERK5/CREB信号通路参与了吗啡依赖大鼠戒断反应.