脊髓c-Jun在NMDA受体NR2B亚基介导的大鼠吗啡镇痛耐受中的作用

目的探讨脊髓c-Jun在N-甲基-D-天冬氨酸(N-meth-yl-D-aspartate,NMDA)受体NR2B亚基介导的吗啡镇痛耐受中的作用。方法取Sprague-Dawley(SD)成年大鼠连续7 d鞘内注射吗啡10μl(1.5 g.L-1)建立慢性吗啡镇痛耐受模型。应用热水甩尾法测定甩尾潜伏期(疼痛指标)以观察痛反应变化。应用免疫组织化学染色法检测磷酸化c-Jun(p-c-Jun)和总c-Jun(t-c-Jun)的表达。结果鞘内注射吗啡7 d,可激活大鼠脊髓的c-Jun,表现为神经元内p-c-Jun表达升高;鞘内注射NR2B选择性拮抗剂10μl Ro256981(2 g.L-1)可以抑制慢性吗啡镇痛耐受时脊髓神经元c-Jun的激活,并明显拮抗吗啡镇痛耐受的形成。结论脊髓神经元c-Jun的磷酸化参与NMDA受体NR2B亚基介导的吗啡镇痛耐受。

脊髓Cx43通过JNK通路介导大鼠慢性吗啡镇痛耐受

目的探讨脊髓缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)在慢性吗啡镇痛耐受中的作用及其是否通过JNK通路介导慢性吗啡镇痛耐受。方法 Sprague-Dawley(SD)成年♂大鼠连续7 d鞘内注射吗啡10μl(1.5 g.L-1)建立慢性吗啡镇痛耐受模型。采用热辐射甩尾法测定甩尾潜伏期以观察吗啡的镇痛效果。应用Western blot法检测Cx43、磷酸化JNK(p-JNK)、总JNK(t-JNK)、磷酸化c-Jun(p-c-Jun)和总c-Jun(t-c-Jun)的表达;免疫组织荧光染色法检测脊髓Cx43的免疫反应性(immnunoreactivity,IR)。结果吗啡耐受引起大鼠脊髓Cx43的表达明显增多;Gap26(特异性Cx43阻断剂,1.5 g.L-1,10μl)可以拮抗吗啡镇痛耐受,并且明显地抑制慢性吗啡镇痛耐受所致的脊髓JNK及c-Jun的激活。结论脊髓Cx43通过JNK通路介导大鼠慢性吗啡镇痛耐受。

Akt通路及细胞凋亡在瘦素介导的大鼠慢性吗啡镇痛耐受中的作用

目的:探讨Akt(又称蛋白激酶B)及活化的caspase-3在瘦素介导的大鼠慢性吗啡镇痛耐受中的作用。方法:在SD大鼠建立慢性吗啡镇痛耐受模型;采用Western blotting法测定脊髓Akt和cleaved caspase-3的水平;免疫组织化学染色法检测脊髓磷酸化Akt(p-Akt)及cleaved caspase-3阳性细胞;免疫双染检测p-Akt及cleaved caspase-3阳性细胞的定位。结果:鞘内慢性注射吗啡(15μg)7 d可明显上调大鼠脊髓p-Akt及cleaved caspase-3的蛋白水平;在注射吗啡前30 min,鞘内注射瘦素拮抗剂(3μg)7 d能显著地抑制慢性吗啡处理对p-Akt和cleaved caspase-3的上调作用;p-Akt只定位在脊髓神经元,而cleaved caspase-3仅定位在星形胶质细胞;瘦素拮抗剂、Akt抑制剂及caspase-3抑制剂均能抑制慢性吗啡镇痛耐受。结论:脊髓Akt通路及活化的caspase-3参与瘦素介导的大鼠慢性吗啡镇痛耐受。

吗啡镇痛耐受大鼠背根神经节κ阿片受体mRNA表达下调

目的:测定吗啡镇痛耐受大鼠背根神经节(DRG)中μ、δ、κ阿片受体的mRNA表达,进一步探索吗啡镇痛耐受中DRG阿片受体的作用。方法:健康成年♂Wistar大鼠20只,随机平均分为生理盐水对照组(NS组,n=10)和吗啡组(MS组,n=10)。采用盲法进行给药和疼痛行为测定。每天早、晚两次皮下注射(sc)药物,并于上午注射药物前、后30 min测定大鼠的热甩尾潜伏期(TFL)作为痛阈指标。NS组sc生理盐水1 ml.kg-1,MS组sc吗啡10mg.kg-1,连续注射7 d,d8早晨各组分别取5只处死,剩余大鼠(分别记为NSN亚组和MSN亚组)d8早晚两次sc纳洛酮0.4 mg.kg-1,并在d9处死。以TFL恢复至基础水平作为出现吗啡耐受的标准。大鼠处死后采用实时聚合酶链反应(real time PCR)方法检测L4-S4节段DRG中3种阿片受体的mRNA表达。结果:观察期两组大鼠的体重增加量差异无显著性,两组大鼠每天注射前测定的TFL差异无显著性。MS组大鼠在d1 sc吗啡后,TFL明显升高(P<0.05);d2注射吗啡后TFL达到最高,且明显高于d1用药后水平(P<0.01),随着吗啡用药次数增加,MS组用药后的TFL逐渐下降,d7应用吗啡后TFL降至基础水平(P>0.05),d8应用纳洛酮后,MSN亚组和NSN亚组的TFL并未发生显著性变化。采用real time PCR的2-ΔΔCt方法计算DRG中阿片受体的表达,MS组大鼠L4-S4节段DRG中μ受体和δ受体的mRNA表达与NS组差异无显著性,而κ受体的mRNA表达显著低于NS组;应用纳洛酮前、后,3种阿片受体的mRNA表达水平无明显改变。结论:DRG中κ受体的mRNA表达下调可能参与了吗啡镇痛耐受的形成。

星形胶质细胞在吗啡镇痛耐受过程中的作用

重复给予吗啡能导致其抗伤害效应的时间依赖性降低，此即为吗啡耐受：近年来，许多研究报告显示重复给予吗啡后脊髓背角反应性星形胶质细胞明显增加，其特征表现为GFAP染色阳性细胞数量增加和形态学发生变化。本文就星形胶质细胞参与吗啡镇痛耐受的研究进展进行综述，

大鼠脊髓内大麻素CB2受体在芍药苷拮抗吗啡镇痛耐受中的作用

目的:探讨脊髓内大麻素CB2受体在芍药苷拮抗大鼠慢性吗啡镇痛耐受中的作用。方法:成功鞘内置管清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠60只,随机分为4组(n=15):生理盐水组(NS组),吗啡组(MOR组),芍药苷组(PF组)和吗啡+芍药苷组(MOR+PF组)。连续7 d鞘内注射吗啡(15μg)建立慢性吗啡耐受的动物模型。采用50℃热水甩尾潜伏期法(tail flick latency,TFL)和机械反射阈值法(mechanical withdrawal threshold,MWT)观察鞘内注射芍药苷对吗啡镇痛耐受的影响;应用免疫组织荧光染色法检测芍药苷对腰段脊髓小胶质细胞活化的影响;应用免疫印迹法检测芍药苷对腰段脊髓CB2表达的影响。结果:连续7 d鞘内注射吗啡后,与NS组比较,MOR组大鼠腰段脊髓背角小胶质细胞显著增多,腰段脊髓CB2表达显著增加(P<0.05);而与MOR组比较,MOR+PF组大鼠腰段脊髓背角小胶质细胞显著减少,腰段脊髓CB2表达显著减少(P<0.05)。与MOR组7 d大鼠最大镇痛效应百分率(percent of maximal possible potential effect,MPE)比较,MOR+PF组大鼠MPE显著增加(TFL:19%±4%vs 41%±3%;MWT:18%±6%vs 42%±4%,P<0.05)。结论:芍药苷能显著拮抗大鼠慢性吗啡镇痛耐受,其作用机制可能与抑制脊髓内CB2受体表达增加有关。

芍药苷通过抑制脊髓CC趋化因子配体2拮抗吗啡镇痛耐受

目的探讨脊髓CC趋化因子配体2(CCL2)在芍药苷拮抗大鼠慢性吗啡镇痛耐受中的作用。方法成功鞘内置管清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠60只,随机分为4组(n=15):生理盐水组(NS组),吗啡组(MOR组),芍药苷组(PF组)和吗啡+芍药苷组(MOR+PF组)。连续7d鞘内注射15μg吗啡建立慢性吗啡耐受的动物模型。应用甩尾潜伏期法(tail flick latency,TFL)及机械反射阈值法(mechanical withdrawal threshold,MWT)观察鞘内注射芍药苷对吗啡镇痛耐受的影响;应用免疫组织荧光染色法检测芍药苷对腰段脊髓小胶质细胞活化的影响;应用免疫印迹法(Western blot)检测芍药苷对腰段脊髓CCL2表达的影响。结果连续7d鞘内注射吗啡后,与NS组比较,MOR组大鼠腰段脊髓背角小胶质细胞显著增多,腰段脊髓CCL2表达显著增加(P<0.05);而与MOR组比较,MOR+PF组大鼠腰段脊髓背角小胶质细胞显著减少,腰段脊髓CCL2表达显著减少(P<0.05)。与MOR组大鼠最大镇痛效应百分率(percent of maximal possible potential effect,MPE)比较,MOR+PF组大鼠%MPE显著增加(TFL:19%±4%vs 41%±3%;MWT:18%±6%vs 42%±4%,P<0.05)。结论芍药苷可能通过抑制脊髓内CCL2表达增加拮抗大鼠慢性吗啡镇痛耐受。

足三里和肾俞穴位埋线对大鼠吗啡镇痛耐受和运动行为敏化的影响

目的：探讨足三里和肾俞穴位埋线对吗啡镇痛耐受和行为敏化的影响。方法：用热辐射甩尾法和热板法测定大鼠痛阈，用运动轨迹记录动物自发活动；应用NADPH—d组织化学显示一氧化氮合酶阳性神经元。结果：与对照组相比，足三里埋线减缓慢性吗啡处理的痛阈下降和明显减少大鼠活动度（P〈0．05），而且大鼠大脑伏隔核和背侧纹状体内一氧化氮合酶5H性神经元表达显著减少；肾俞埋线组痛阈和活动度较对照组均未见明显差异（P〉0．05），但背侧纹状体区一氧化氮合酶阳性神经元表达明显减少（P〈0．05）。结论：穴位埋线于足三里可减缓吗啡镇痛耐受，逆转吗啡行为敏化形成，其作用机制可能与抑制伏隔核和背侧纹状体区一氧化氮合酶表达有关。

热休克蛋白在大鼠慢性吗啡镇痛耐受中的作用及机制

目的探讨热休克蛋白60(HSP60)在慢性吗啡镇痛耐受中的作用及机制。方法50只雄性SD大鼠随机分为对照组(n=10)、吗啡组(n=10)、siRNA-阴性对照(siRNA-NC)+吗啡组(n=10)、siRNA-HSP60+吗啡组(n=10)与脂多糖(LPS)+siRNA-HSP60+吗啡组(n=10)。对照组和吗啡组分别于鞘内注射10μl生理盐水和吗啡;siRNA-NC+吗啡组和siRNA-HSP60+吗啡组分别给予10μl siRNA-NC和siRNA-HSP60,然后鞘内注射吗啡;LPS+siRNA-HSP60+吗啡组给予10μl siRNA-HSP60和LPS,然后鞘内注射吗啡。各组均连续处理7 d。采用RT-PCR和Western blotting检测大鼠脊髓组织中HSP60的mRNA和蛋白表达水平;采用水浴甩尾法观察沉默HSP60对疼痛耐受的影响;免疫荧光染色法检测脊髓小胶质细胞标志物OX-42的表达;RT-PCR法检测大鼠脊髓组织中白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA的表达;Western blotting检测大鼠脊髓组织中Toll样受体4(TLR4)和磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)的表达水平。结果鞘内注射siRNA-HSP60可显著下调吗啡诱导的HSP60的表达(P<0.05)。与对照组相比,吗啡组大鼠对疼痛的耐受度降低(P<0.05),HSP60缺失可增强大鼠对疼痛的耐受(P<0.05)。与siRNA-NC+吗啡组比较,siRNA-HSP60+吗啡组大鼠脊髓组织中OX-42阳性细胞数以及IL-1β、TNF-αmRNA的表达显著下调(P<0.05),TLR4和p-p38MAPK的表达水平降低(P<0.05),而LPS处理可上调TLR4和p-p38MAPK的表达(P<0.05),并能逆转HSP60缺失对吗啡耐受的作用(P<0.05)。结论HSP60缺失通过抑制小胶质细胞的活化及炎症反应改善吗啡耐受的形成,其机制可能与抑制TLR4-p38MAPK信号通路有关。

Nω-硝基-L-精氨酸甲酯能够通过抑制一氧化氮／N-甲基-D-天冬氨酸受体系统而延缓大鼠吗啡镇痛耐受的形成

采用热甩尾测痛法观察全身应用非特异性一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）抑制剂-N^ω-硝基-L-精氨酸甲酯（L—NAME）对吗啡镇痛耐受形成的影响，并通过观察脊髓和中脑神经元型NOS（nNOS）和N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体亚单位表达的变化来阐释一氧化氮（nitric oxide，NO）／NMDA受体在吗啡镇痛耐受形成中的作用。将36只健康成年SD大鼠平均分为6组（每组6只）：1组为对照组，皮下注射生理盐水1ml；2组、3组、4组、5组和6组为处理组，分别皮下注射L—NAME 10mg／kg、L—NAME 20mg／kg、吗啡10ms／kg、L—NAME 10mg／kg和吗啡10mg／kg、L—NAME 20mg／kg和吗啡10mg／kg，每天2次。在注射前测量大鼠的热甩尾潜伏期（tail—flick latency，TFL）基础值，随后每天第一次给药后50min测量其TFL。第8天最后一次给药后80min（除2组和5组之外）断头取脊髓和中脑，采用RT—PCR技术测量nNOS以及NMDA受体1A和2A亚单位的表达。结果显示，2组大鼠第1天至第7天的TFL与基础值相比无显著差异；第7天时3组的TFL仍显著性高于基础值；4组的TFL在第1天时最高，在第2至第6天期间逐渐降低，第6天时与基础值相比无显著性差异；5组的TFL在实验过程中呈下降趋势，虽然第7天时较第1天有所降低，但是仍然显著性高于基础值；6组的TFL变化趋势与5组相同。PT—PCR分析结果显示，与1组相比，3组脊髓和中脑的nNOSmRNA表达显著性降低，但NR1AmRNA和NR2AmRNA表达无显著性改变；

脊髓CC趋化因子配体2在大鼠吗啡镇痛耐受中的作用

目的 观察脊髓CC趋化因子配体2[chemokine （C-C motif） ligand 2,CCL2）]蛋白在大鼠吗啡镇痛耐受过程中的作用.方法 成功鞘内置管Sprague-Dawley （SD）大鼠按随机数字表法分成10组（每组6只）：IgG＋吗啡（IgG＋MOR）组、CCL2中和抗体＋吗啡（CCL2 neutralizine antibody＋MOR）组、IgG＋生理盐水（IgG＋NS）组、CCL2中和抗体＋生理盐水（CCL2neutralizine antibody＋NS）组、CCL2中和抗体4＋吗啡（CCL2 neutralizine antibody 4＋MOR）组、IgG4＋吗啡（IgG4＋MOR）组、IgG4＋生理盐水（IgG4＋NS）组、CCL2中和抗体8＋吗啡（CCL2 neutralizine antibody 8＋MOR）组、IgG8＋吗啡（IgG8＋MOR）组、IgG8＋生理盐水（IgG8＋NS）组.连续7d鞘内注射吗啡（15 μg）建立吗啡耐受的动物模型.采用50℃热水甩尾潜伏期法（tail flick latency,TFL）和机械反射阈值法（mechanical withdrawal threshold,MWT）观察CCL2在吗啡的镇痛耐受中作用;应用酶联免疫法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测吗啡耐受过程中脊髓背角CCL2免疫活性表达变化.结果 在吗啡注射3、5、7 d时,与IgG＋MOR组大鼠最大镇痛效应百分率（percent of maximal possible potential effect,％MPE）[％MPETFL：3 d（55±6）％、5 d（27±4）％、7 d（17±3）％;％MPENWT：3 d（54±6）％、5 d（27±4）％、7 d（17±4）％]比较,CCL2 neutralizine antibody＋MOR组大鼠％MPE明显增加[（％MPETFL：3 d（65±6）％、5 d（47±4）％、7 d（42±4）％;％MPEMWT：3 d（65±5）、5 d（46±4）、7 d（41±4）（P＜0.01）],与IgG4＋MOR组[％MPETFL：5 d（27.3±3.6）％、7 d（17±3）％;％MPEMWT：5 d（27±4）％、7 d（17±3）％]比较,CCL2 neutralizine antibody 4＋MOR组大鼠％MPE明显增加[％MPETFL：5 d（46±4）％、7 d（43±4）％; ％MPEMWT：5 d（45±4）％、7 d（44±4）％ （P＜0.01）];在吗啡注射9、11 d时,与IgG8 ＋MOR组[％MPETFL：9 d（16±3）％、11 d（15±4）％;％MPEMWT：9 d（16±3）％、11 d（14±3）％]比较,CCL2 neutralizineantibody 8＋MOR组大鼠％MPE明显增加[％MPEFTL：9 d（26±4）％,11 d（36±4）％;％MPEMWT：9 d（26±4）％、11 d（35±4）％（P＜0.05,P＜0.01）],在吗啡注射7d时,与IgG＋NS组比较,IgG＋MOR组大鼠脊髓背角CCL2的表达明显增加;然而,与IgG＋MOR组比较,CCL2 neutralizine antibody＋MOR组大鼠脊髓背角CCL2的表达明显减低.结论 脊髓CCL2可能参与吗啡耐受形成和维持,抑制CCL2可能为临床吗啡镇痛耐受提供一种新的治疗.

脊髓星形胶质细胞通过调控Cx43-JNK通路介导吗啡耐受

目的探讨脊髓星形胶质细胞是否通过调控Cx43-JNK通路介导大鼠慢性吗啡耐受。方法采用SD成年大鼠,连续7 d鞘内注射吗啡(15μg/10μl)建立慢性吗啡镇痛耐受动物模型。采用热水甩尾法测定甩尾潜伏期以观察吗啡的镇痛效果。应用Western blot法检测脊髓Cx43、磷酸化JNK(p-JNK)、磷酸化c-Jun(p-c-Jun)和GFAP的表达;免疫组织荧光染色法检测脊髓GFAP的免疫反应性。结果在吗啡耐受形成的过程中,慢性鞘内注射吗啡引起大鼠脊髓GFAP表达逐渐增多,吗啡耐受时脊髓p-JNK、p-c-Jun和Cx43的表达明显增多;氟代柠檬酸(Fluorocitric acid,1 nmol/10μL)可以拮抗吗啡镇痛耐受,并且明显地抑制慢性吗啡所致的脊髓Cx43的上调,以及JNK及c-Jun的激活。结论脊髓Cx43-JNK通路参与星形胶质细胞介导的大鼠慢性吗啡镇痛耐受。

吗啡耐受过程中脊髓胶质细胞作用机制研究进展

吗啡镇痛耐受是指重复使用吗啡引起抗伤害性效应的时间依赖性抑制。最近,许多报告显示重复使用吗啡后脊髓背角胶质细胞(星形胶质细胞和小胶质细胞)明显增加,其特征是胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞和OX-42阳性细胞数量增加,以及形态学发生变化。此文综述了吗啡镇痛耐受过程中脊髓胶质细胞作用机制的研究进展。