内吞蛋白家族的研究近况

内吞蛋白是最近发现的一类功能蛋白质 ,主要参与细胞膜的物质运输和信息交流。内吞蛋白具有特殊的结构 ,家族成员之间有很高的同源性 ,成员蛋白一般多具有C端的SH3结构域和N端的溶血磷脂酸脂酰基转移酶结构域。C端的SH3结构域可与许多能结合SH3的蛋白质相结合 ,N端则参与细胞膜的内凹形成囊泡。内吞蛋白在神经递质的回收过程中发挥重要的作用 。

褐飞虱吞蛋白的基因克隆、多克隆抗体制备及表达定位

【目的】探析吞蛋白(endophilin)在褐飞虱Nilaparvata lugens生长繁殖过程中的作用。【方法】克隆褐飞虱吞蛋白基因,并进行生物信息学分析;在大肠杆菌Escherichia coli Rosetta中诱导表达褐飞虱吞蛋白基因,融合蛋白经Ni柱亲和层析法纯化后,免疫新西兰兔子,获得相应的多克隆抗体;将所得的抗体用于检测褐飞虱卵巢中吞蛋白的表达和定位。【结果】克隆得到褐飞虱两个吞蛋白基因endophilin A(Endo A)和endophilin B(Endo B),GenBank登录号分别为KY126096和KY126095,分别编码387个和352个氨基酸,都含有吞蛋白典型的BAR结构域和SH3结构域,但它们在结构上存在差异。ELISA和Western blot检测结果表明,制备的兔抗血清效价达1∶1 000 000,并表现出较好特异性。将获得的抗体应用于免疫荧光实验表明,Endo A和Endo B蛋白在褐飞虱卵巢中普遍表达,在卵巢滤泡细胞的细胞间隙、细胞膜、细胞质中广泛分布,而且与脂类物质的分布模式类似,与正在侵入褐飞虱卵巢的类酵母共生菌共定位。【结论】获得了褐飞虱吞蛋白基因Endo A和Endo B序列,并明确了其生物信息学特征,成功制备了Endo A和Endo B多克隆抗体,分析了Endo A和Endo B在褐飞虱卵巢中的表达情况,认为其可能与褐飞虱卵巢发育和成熟以及类酵母共生菌入侵褐飞虱卵巢有关。这些结果为进一步研究Endo A和Endo B在褐飞虱中的生物学功能奠定了基础。

内吞蛋白A1参与神经元突触囊泡循环及对部分神经精神疾病影响的研究进展

脑内神经元之间的信息交流依赖于突触囊泡的循环,该循环的有效运行离不开突触囊泡的内吞作用。内吞蛋白A1能够限制囊泡脱膜及突触囊泡的循环速率,神经元中缺乏内吞蛋白A1会导致神经元之间信息交流减少。内吞蛋白A1是一种中枢神经系统和睾丸组织特有的蛋白,其在神经元发育中的含量增加而显著影响个体的认知功能。此外,内吞蛋白A1在突触囊泡循环中发挥的主要作用是调节膜曲率并形成网格蛋白包被囊泡、收集突触相关蛋白并回收网格蛋白、释放突触小泡等,它参与调控的突触囊泡循环出现问题,会导致神经系统功能障碍,产生多种神经、精神疾病。本文系统地综述了内吞蛋白A1在部分神经、精神疾病中的研究进展,重点阐述内吞蛋白A1介导的突触囊泡循环与神经、精神疾病发病的关系,并对其前景进行展望。

电针对硫酸卡那霉素慢性损害后豚鼠听皮层抑制素和吞蛋白-A1表达的影响

目的探讨硫酸卡那霉素慢性损害后豚鼠听皮层蛋白质组的变化,以及电针对抑制素和吞蛋白-A1表达的影响。方法105只成年健康杂色豚鼠随机分为对照组(7只)、硫酸卡那霉素模型组(49只,模型组)、硫酸卡那霉素+电针组(49只,电针组)。模型组与电针组连续注射硫酸卡那霉素7天,电针组注射半小时后予以电针翳风穴和听宫穴15分钟,连续7天,对照组注射等量生理盐水;模型组与电针组根据药物注射后时间再分为注射后1、7、14、28、56、70、140天组(每组7只)。采用双向电泳技术、质谱鉴定分析筛选并切取21个表达差异明显的蛋白点进行鉴定,蛋白质印迹法检测抑制素与吞蛋白-A1的表达。结果①灰度差异2倍以上的差异表达蛋白质有抑制素、吞蛋白-A1等18种。②与对照组相比,模型组注射后第14、28、56天抑制素表达降低(P<0.05),第1、14天吞蛋白-A1表达增高(P<0.05);与模型组相比,电针组注射后第7、70天抑制素表达增高(P<0.05),第14、28、56天吞蛋白-A1表达降低(P<0.05)。结论抑制素等18种蛋白质可能参与了硫酸卡那霉素致豚鼠听皮层慢性损害的过程,电针听宫穴与翳风穴可能通过调节抑制素、吞蛋白-A1的表达促进听皮层的重塑进程。

吞蛋白A2在非网格蛋白内吞中的作用研究进展

内吞作用是细胞从细胞外空间和内化横跨膜的细胞表面蛋白转运物质到细胞内的过程.吞蛋白(endophilin)一直被认为参与了网格蛋白介导的细胞内吞作用,2015年《自然》(Nature)发表的两篇研究论文报道了一种由endophilin A标记和控制的独立于网格蛋白的有被囊泡内吞作用.本文主要综述近年来endophilin A2的研究,着重介绍endophilin A2在非网格蛋白介导的内吞作用中的功能和机制.

网格蛋白介导型内吞作用与广谱抗病毒药

病毒性疾病对人类的健康造成了巨大的威胁,虽然有很多药物用于临床治疗,但由于病毒的易变异性,对现有的抗病毒药物极易产生耐药性,而新发病毒又层出不穷,因此研发新的抗病毒药物尤其是广谱且不易产生耐药的抗病毒药物对于病毒性疾病的治疗就显得尤为重要。网格蛋白介导型内吞是许多病毒和病原体进入宿主细胞的主要途径,抑制此途径可阻断病毒进入宿主细胞,从而抑制病毒感染,由于其功能和机制与病毒自身无关,不易产生耐药,是近年来广谱抗病毒药物的潜在作用靶标。本文结合国内外最新研究报道,简要综述了病毒依赖网格蛋白介导型内吞入胞的机制,网格蛋白介导型内吞抑制剂的研究现状,及其在广谱抗病毒药物研发中的潜在应用前景。

网格蛋白介导的内吞作用机制

受体介导的内吞作用是目前公认的生物体摄取生物大分子的途径,而网格蛋白介导的内吞又是最主要的受体介导方式.结合国内外最新报道,介绍了网格蛋白和衔接蛋白的结构、分子特性和功能;从衔接蛋白、网格蛋白的招募;包被小凹的内陷、缢缩和包被液泡的芽殖和包被液泡的脱壳等过程,阐释了网格蛋白介导的内吞作用机制.

网格蛋白内吞途径在轮状病毒感染对Caco-2细胞钠氢交换蛋白3调控中的作用

目的研究轮状病毒(RV)感染对表达钠氢交换蛋白3(Na^+-H^+exchanger 3,NHE3)的Caco-2细胞表面NHE3蛋白水平和生物活性的影响及其调控机制。方法构建表达NHE3的Caco-2细胞模型,分为对照组(CTL组)、RV组、网格蛋白(clathrin)拮抗剂氯丙嗪(CPZ)组和CPZ+RV组,采用BCECF-AM法和细胞表面NHE3生物素化法测定Na^+-H^+交换活性和细胞表面NHE3水平,Western blot法测定细胞clathrin水平。结果与CTL组相比,RV感染可引起细胞Na^+-H^+交换活性以及细胞表面NHE3水平明显降低,此抑制作用不能被clathrin拮抗剂CPZ完全抵消,此外RV感染可引起clathrin水平升高,这一作用也可被CPZ取消。结论 RV感染对NHE3水平及生物活性的调控与clathrin依赖性内吞途径有一定关系,但也可能还受到其他内吞途径的影响。

肠道病毒71型(EV71)通过网格蛋白介导的内吞途径入侵人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞

目的研究肠道病毒71型(EV71)入侵人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的内吞机制。方法利用氯丙嗪(CPZ)、制霉菌素(NT)分别预处理SK-N-SH细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)检测靶细胞中EV71 mRNA水平,免疫荧光细胞化学染色检测靶细胞病毒蛋白1(VP1)蛋白表达水平;EV71感染SK-N-SH细胞后,激光共聚焦显微镜检测EV71与入侵途径标志分子网格蛋白的共定位。结果 CPZ能抑制靶细胞内EV71 mRNA和VP1蛋白的表达,而NT对其无影响;激光共聚焦显微镜发现EV71与网格蛋白共定位。结论 EV71是通过网格蛋白介导的内吞途径入侵人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞。

内吞适配蛋白Epsin3在乳腺癌中的表达及预后分析

目的 基于癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据库,分析内吞适配蛋白Epsin3(EPN3)在乳腺癌中的表达及临床意义。方法 应用TCGA数据库门户网站UALCAN、c Bio Portal、Oncomine等分析EPN3在乳腺癌中的表达变化及预后关系;应用癌症多组学分析数据平台Linked Omics分析在乳腺癌中EPN3的表达变化与临床指标的关系。结果 乳腺导管癌中EPN3基因表达较正常乳腺组织显著上调(P<0.01)且EPN3高表达不利于患者预后;乳腺癌中EPN3的表达受组织学类型、病理阶段、病理T阶段、病理N阶段、原癌基因人类表皮生长因子受体、雌激素受体、孕激素受体、PM50类型、患者种族、肿瘤纯度、年龄和淋巴结数量的影响(P<0.05)。结论 EPN3高表达不利于乳腺癌预后,可作为筛选和治疗乳腺癌的相关靶点。

RNA干扰endophilin A2抑制大鼠海马神经元突触囊泡内吞

目的:探讨内吞蛋白(endophilin)A2对大鼠海马神经元突触囊泡内吞的影响。方法:设计干扰endophilin A2的小分子干扰片段,通过Western blot的方法筛选出针对endophilin A2有效的特异性干扰片段;用免疫荧光的方法验证干扰片段对神经元内源性endophilin A2的干扰效果;利用双全细胞膜片钳的方法,记录不同刺激方案下的兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic currents,EPSCs)的情况,以明确endophilin A2对突触囊泡循环的影响。结果:(1)免疫荧光结果显示endophilin A2的干扰片段能显著减少海马神经元内源性endophilin A2的表达(P<0.05);(2)双全细胞膜片钳结果显示,0.1 Hz的低频刺激下,干扰endophilin A2表达的神经元EPSCs大小与阴性对照组没有明显差异;而无论是单串高频刺激下还是多串高频刺激下,干扰endophilin A2表达的神经元标准化EPSCs的下降程度都明显增强(P<0.05)。结论:(1)成功筛选出特异性干扰endophilin A2的有效干扰片段;(2)干扰endophilin A2的表达不影响海马神经元突触囊泡胞吐;(3)干扰endophilin A2的表达可抑制大鼠海马神经元突触囊泡内吞。

NGAL蛋白诱导食管癌细胞发生自噬

以往研究证明,中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL(neutrophil gelatinase-associated lipocalin)与食管癌密切相关,改变NGAL表达能够对癌细胞的形态结构产生明显影响,但确切的作用机制不明.在酵母细胞中表达NGAL蛋白,柱层析分离纯化.筛选NGALR(NGAL receptor)高表达与弱表达的人食管癌细胞系EC1.71和EC109作为实验细胞模型.5-FAM标记NGAL蛋白,加入到细胞培养上清中,对比研究NGAL蛋白入胞情况、细胞形态学改变、细胞自噬体产生、自噬相关基因表达、细胞内铁离子与铁蛋白水平以及相关细胞信号转导激酶的活性等.结果表明,NGAL蛋白可经由内吞途径进入食管癌细胞发挥作用,致使细胞发生典型的自噬性形态结构变化,自噬体大量产生,自噬相关基因的表达发生相应变化,ERK被激活,但细胞内的铁离子与铁蛋白未受明显影响.上述结果提示,诱导细胞发生自噬是外源性NGAL蛋白经由内吞途径进入食管癌细胞发挥作用的机制之一,与NGAL蛋白跨膜转铁未见直接关联,而ERK信号转导途径可能参与了这一过程.

新城疫病毒利用网格蛋白和小窝蛋白受体途径感染鸡骨髓来源树突状细胞

新城疫病毒(NDV)可以通过多种内吞途径感染细胞,且其入胞途径可能具有细胞类型特异性。本研究以鸡骨髓源树突状细胞(chBM-DCs)为模型,探究NDV入侵该细胞的内吞途径。首先利用CPZ(CME抑制剂)和Dynasore(dynamin1/2抑制剂)预处理DCs,然后感染NDV强毒株Herts/33,通过Western blot和IFA检测NDV NP的胞内表达水平变化。药物预处理组NP的表达水平均显著降低,表明NDV能够通过网格蛋白介导的内吞途径进入DCs。进一步利用甲基-β-环糊精(MβCD)预处理DCs,然后感染Herts/33,通过Western blot和IFA检测NDV NP的胞内表达水平变化。结果显示药物预处理组NP的表达水平显著降低,表明NDV能够通过小窝蛋白介导的内吞途径进入DCs。本研究为全面阐明NDV感染宿主细胞的途径提供了理论基础。

细胞内吞循环运输通路及其分子调控机制

内吞运输对于细胞与外界的物质信息交流至关重要,其过程涉及对胞外大分子、膜磷脂、膜蛋白内吞及分选的精细调控。在内吞运输系统中,循环运输通路负责将膜蛋白和磷脂等送回质膜,维持质膜组成的稳定,保障多种细胞生物学过程的正常进行,如营养吸收、细胞极性形成、细胞迁移、细胞分裂、突触可塑性、免疫应答、生长因子受体调控等。真核细胞中存在两大类循环运输通路,分别是网格蛋白依赖内吞货物蛋白的循环运输(CDE货物循环)和非网格蛋白依赖内吞货物蛋白的循环运输(CIE货物循环)。在体内具有重要生理功能的转铁蛋白受体TfR和低密度脂蛋白受体LDLR是CDE循环的代表性货物膜蛋白。近年,受CIE货物循环调控的重功能膜蛋白被逐步发现,如IL2受体α-亚基、主要组织相容性复合体MHCClassⅠ、葡萄糖转运因子GLUT4等。因而,对CIE货物循环调控机制的研究越来越受到学界关注,相关研究既有重要的细胞生物学理论意义,也能为诸如Ⅱ型糖尿病和癌症等重大疾病的诊疗策略提供科学依据和潜在治疗线索。相较于CDE货物循环,学界对CIE货物循环的研究开展较晚,对其调控机制的了解也较少。为此,本文在介绍内吞循环运输通路类型及其特点的基础上,着重关注CIE循环运输调控的分子基础,对CIE货物循环研究领域的新进展、新研究体系进行了归纳和说明。

Endo180半胱氨酸富集区与I型胶原蛋白C末端分子的体外相互作用

I型胶原蛋白（type I collagen）是由2条α1链和1条α2链构成的纤维状异源三聚体.它是构成细胞外基质最主要的成分.I型胶原蛋白和内吞胶原蛋白受体Endo180（Endocytic 180）之间的相互作用在细胞基质的粘附和降解过程中起着关键性作用.但内吞胶原蛋白受体Endo180与胶原蛋白的结合区域尚未有相关的报道.本研究在体外通过酶联免疫吸附、蛋白免疫沉淀和Western印迹等多种定量分析实验发现,用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AP）标记I型胶原蛋白C末端（氨基酸1151~1464）后形成的分泌型三聚体融合蛋白AP-Coll-S,可与用抗体恒定区（antibody constant fragment,Fc）标记的Endo180的半胱氨酸富集区（CysR）结合.从而表明,AP-Coll-S和CysR-Fc之间存在相互作用.本研究结果为进一步研究胶原蛋白和其受体Endo180的分子间相互作用提供新依据.

新城疫病毒Mukteswar株感染鸡巨噬细胞入胞及胞内转运途径研究

新城疫病毒(NDV)可以通过多种内吞途径入侵不同宿主细胞并在内体中逃逸从而避免被宿主天然免疫系统“追踪”。为探究NDV中等毒力疫苗株Mukteswar感染鸡巨噬细胞(HD11)的入胞和胞内转运途径,本研究利用Dynasore、CPZ、MβCD、Baf A1预处理细胞,然后感染NDV Mukteswar株,通过Westem blot和IFA检测NDV NP蛋白的表达变化。结果显示Dynasore、MβCD和Baf A1处理后NP的表达水平降低,表明NDV入侵HD11细胞是利用小窝蛋白介导的内吞途径,且依赖动力蛋白、胆固醇和pH。通过过表达和干扰试验检测调节不同内体囊泡类型运输的Rab蛋白(Rab5、Rab7、Rab11)对NDV感染HD11细胞的影响,结果发现Rab7的表达对NDV感染无影响,而过表达Rab5和Rab11促进NDV感染,表明是由Rab5、Rab11而不是Rab7调节NDV的转运。本研究丰富了NDV入侵宿主免疫细胞的途径及胞内转运的研究,并为全面阐明NDV感染机制提供了理论基础。

流感病毒和冠状病毒的细胞表面结合与内化

病毒是一种在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型生物.不同病毒侵入细胞的方式不同,但大都需要通过结合至细胞表面特定的受体蛋白或脂质结构来实现细胞内化,从而启动入侵程序和感染宿主细胞.因此揭示病毒结合和内化侵入细胞的具体过程及机制有助于从源头上开发靶向药物或疫苗.本文以流感病毒和冠状病毒为例,首先介绍了流感病毒的结构,其与细胞膜上特定种类蛋白或脂质结构的结合方式,其完成细胞内吞的途径及诱导其内化的细胞因子种类,以及侵入细胞后的作用过程,继而对冠状病毒尤其针对目前仍在全球范围内肆意传播的新型冠状病毒(SARS-CoV-2),扼要阐述了其结构特点、与细胞受体血管紧张素转化酶ACE2的结合及实现细胞内化的研究进展.

过表达endophilin A2减轻异丙肾上腺素诱导的心肌肥大

目的:研究过表达吞蛋白A2(endophilin A2,Endo A2)对异丙肾上腺素(isoprenaline,ISO)诱导的心肌肥大的影响。方法:取健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、Ad-EndoA2组、ISO模型组及ISO+Ad-EndoA2组,其中Ad-EndoA2组和ISO+Ad-EndoA2组于给药前1 d左心室壁注射Ad-EndoA2腺病毒,假手术组和ISO组注射磷酸缓冲盐溶液,然后分别连续7 d皮下注射生理盐水或ISO。7 d后用小动物超声测定心功能指标,然后处死大鼠,收集心脏,以心脏重量指数、HE染色及胚胎基因表达水平评价心肌肥大情况,Western blot法检测自噬相关蛋白LC3和P62的表达。结果:小动物超声结果显示,与假手术组相比,ISO组大鼠处于心肌肥大代偿期(左室收缩期前壁厚度、左室收缩期后壁厚度、射血分数和短轴缩短率升高,左室收缩内径及心输出量下降,均P <0. 05),心脏重量指数、HE染色及RT-qPCR结果也均显示心脏发生了明显肥大(P <0. 05),过表达Endo A2可明显减轻ISO诱导的心肌肥大,改善心功能(P <0. 05)。Western blot结果显示,过表达Endo A2明显逆转ISO引起的自噬水平降低(P <0. 05)。结论:过表达Endo A2可减轻ISO诱导的大鼠心肌肥大,可能与加强自噬有关。

Endophilin-A1的功能和作用机制及与认知功能的关系

最近国内外研究提示endophilin-A1在多种认知功能损害性疾病,如阿尔茨海默病(AD)和糖尿病认知功能损害中异常表达。Endophilin-A1是一种广泛表达于脑的突触前神经终末的胞浆蛋白,在突触囊泡的内吞回收,尤其是网格蛋白介导的囊泡内吞(CMVE)过程中起重要作用。研究认为其本身可能调节Aβ的生成,也可能通过CMVE来影响脑内Aβ的生成与释放,提示其与AD的发病有关。此外,endophilin-A1在糖尿病认知功能损害的大鼠脑内表达下调。本文就近年来endophilin-A1的研究进展作一综述。

内吞相关蛋白Myosin Ⅵ/Disabled-2在小鼠耳蜗毛细胞的表达及年龄相关性变化的研究

目的:研究不同年龄小鼠耳蜗毛细胞内吞相关蛋白MyosinⅥ和Disabled-2(Dab2)的表达及分布特点。方法:分别选取出生后2周、5周、9周及16月龄的昆明小鼠各10只,采用免疫荧光标记联合激光共聚焦显微镜扫描耳蜗基底膜铺片,观察MyosinⅥ及Dab2蛋白的表达定位,通过荧光定量逆转录PCR测定并比较不同年龄组小鼠耳蜗2种蛋白mRNA的表达水平。结果:MyosinⅥ及Dab2蛋白在内外毛细胞均有表达,支持细胞未见表达,且内毛细胞2种蛋白均存在局部高表达的亚细胞区域。比较不同年龄组MyosinⅥ荧光染色图像后发现,2周龄和16月龄小鼠荧光强度均低于5周龄和9周龄小鼠。比较不同年龄组小鼠2种蛋白mRNA表达后发现,2周龄小鼠mRNA相对表达水平均低于9周龄小鼠,差异有统计学意义(P<0.01),5周龄及16月龄组小鼠分别与9周龄小鼠相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:调控网格蛋白介导内吞过程的MyosinⅥ及Dab2蛋白表达于内外毛细胞,内毛细胞顶区表皮板及附近胞质可能是这一过程的主要部位。随着年龄的增长,MyosinⅥ及Dab2蛋白的表达可能会发生改变,网格蛋白介导内吞过程效率可能因此相继发生变化,内毛细胞功能损伤可能与此有关。