磷酸吡哆醛补救途径两个关键酶的研究进展

维生素B_6(VB_6)包括6个可相互转换的吡啶衍生物。其中,磷酸吡哆醛(PLP)作为140多种细胞酶的辅酶,在生物体内发挥重要作用。动物从食物中获得VB_6,通过由吡哆醛激酶和磷酸吡哆醇氧化酶构成的补救途径合成PLP。PLP依赖酶的正常功能乃至人体最佳健康状态,依赖于细胞中PLP的平衡供给。然而,就PLP的动态平衡和调节机制以及PLP合成后的转移机制而言,目前还知之甚少,是一个富有挑战性的研究领域。为此,综述PLP补救途径两个关键酶的研究进展。

产磷酸吡哆醛转移酶微生物菌株的筛选

筛选产磷酸吡哆醛转移酶微生物菌株,应用微生物产生的磷酸吡哆醛转移酶转化生产磷酸吡哆醛,以焦磷酸为磷酸基团供体磷酸化吡哆醛合成磷酸吡哆醛,采用HPLC法检测反应液,紫外吸收波长388nm,出峰时间为1.75min。得到1株转化效率较高的菌株C2-300,其转化效率达到64μg/mL。

吡哆醛激酶研究进展

吡哆醛激酶(PLK)属于核糖激酶超家族成员,广泛存在于生物有机体中,它是维生素B6的关键代谢酶,PLK能够催化维生素B6的磷酸化,使之转化为有活性的吡哆醛磷酸(PLP),而PLP在氨基酸合成分解代谢中发挥着重要的作用。本文从PLK结构、分类、生物学功能及其与某些疾病的联系等方面,进行详细的综述,为了解这一激酶、开展相关研究提供便利。

家蚕吡哆醛激酶基因干扰降低转氨酶基因的转录表达

【目的】维生素B_6在氨基酸代谢中是多种酶的辅酶,维持氨基酸代谢的正常运行。磷酸吡哆醛（pyridoxal-5＇-phosphate,PLP）是维生素B_6的主要辅酶形式,吡哆醛激酶（pyridoxal kinase,PLK）是PLP的重要生成酶,本研究试图明确PLK基因与PLP依赖酶之间转录水平的调节关系。【方法】本研究采用RNA干扰（RNA interference,RNAi）方法对家蚕Bombyx mori的PLK基因进行干扰,通过体外合成PLK基因的3个干扰片段（siRNA1,siRNA2和siRNA3）,将siRNA从体腔注入5龄第3天的家蚕幼虫体内诱导RNAi。利用荧光定量PCR测定不同干扰片段、不同时间点及不同组织中PLK基因表达量的变化;并测定家蚕体内磷酸丝氨酸转氨酶（phosphoserine aminotransferase,Ser B）和天门冬氨酸氨基转移酶（asparate aminotransferase,AST）基因的表达量。【结果】注射干扰片段后48 h干扰效果达到最佳。3个干扰片段干扰效果从高到低依次为siRNA1,siRNA2和siRNA3。RNAi效果最好的是中肠组织,其PLK基因的相对表达量下降了55%。RNA干扰PLK基因后,后部丝腺中Ser B和AST基因相对表达量分别下降了90%和29%。【结论】本研究通过RNAi实现了家蚕PLK基因干扰,并进一步证明了家蚕PLK基因和Ser B基因及AST基因存在联动调节关系。

家蚕磷酸吡哆醛激酶cDNA的克隆和酶活表征(英文)

吡哆醛激酶 (EC 2.7.1.35) 在 ATP 和 Zn2+的存在下,催化吡哆醛的磷酸化反应生成磷酸吡哆醛 (PLP)。在生物体内许多酶促反应中,PLP 是一种重要的辅酶因子。家蚕和哺乳动物一样,需依赖食物中的维生素 B6前体来合成 PLP。文章描述了利用家蚕基因组数据库序列信息及使用 PCR 方法,克隆出编码家蚕吡哆醛激酶的 cDNA (GenBank 登录号:DQ452397)。克隆到的 cDNA 含有一个 894 bp 的完整可读框,编码一条分子量为 33.1 kDa,含 298 个氨基酸残基的蛋白质。序列比对显示此蛋白质序列与人类吡哆醛激酶蛋白序列具有 48.6%的同一性,包含吡哆醛激酶家族共有的特征保守序列,但其氨基酸残基数比哺乳动物和植物克隆到的吡哆醛激酶残基数均少 10 多个残基。多序列比对结果显示,吡哆醛激酶中几个有关键功能且在哺乳动物和植物中均保守的氨基酸残基在此蛋白中被替换为其他种类氨基酸残基。采用 T7 启动子和 T7 聚合酶表达系统对克隆到的 cDNA 进行了原核表达并对表达粗提产物进行了酶活检测。实验结果显示表达得到的可溶性蛋白产物占其总蛋白量为 10%,细胞粗提物具有活力为 30 nmol/min/mg 的吡哆醛激酶活性,结果证实了克隆到的 cDNA 编码家蚕中的吡哆醛激酶。

大豆吡哆醛激酶基因的克隆与表达分析

以拟南芥吡哆醛激酶基因（PK）的蛋白质序列为信息探针,对大豆（Glycine max）EST数据库进行同源搜索和序列拼接,获得了全长为1 102 bp的大豆吡哆醛激酶基因的cDNA序列,经RT-PCR克隆和序列分析验证,结果表明与电子克隆序列一致（GenBank登录号为DQ006813）。该cDNA序列的开放阅读框（ORF）位于第119-1 045位,推测编码308个氨基酸。采用半定量RT-PCR方法研究了该基因的组织特异性表达情况和对强光逆境的反应,结果表明该基因在大豆根茎叶中都有表达,对强光逆境不敏感。将大豆PK基因编码的蛋白序列与马铃薯（Solanum tuberosum,AAY85186）、拟南芥（Arabidopsis thaliana,AAK94021）、水稻（Oryza sativa,ABA99785）、小麦（Triticum aestivum,AAR00318）和油菜（Brassica napus,ABE73472）的吡哆醛激酶蛋白序列进行比对,发现其一致性分别为：81%,75%,78%,79%和76%。比对结果说明在植物中该基因编码的蛋白质存在显著的相似性。根据蛋白比对结果绘制的系统发育树基本代表了它们在经典分类上的地位。

泛酸钙、吡哆醛、叶酸及生物素对热暴露果蝇的保护作用

目的 :观察泛酸钙、吡哆醛、叶酸及生物素四种维生素对热暴露环境下果蝇的平均生存时间的影响 ,探索其对果蝇保护作用的可能机制。方法 :以果蝇为热暴露动物模型 ,36 .5℃为热暴露温度 ,观察高、中、低剂量上述维生素干预下的果蝇的平均生存时间。同时进行SDS -PAGE电泳测定相应的热应激蛋白 (HSP70 )含量。结果 :除吡哆醛外 ,其余的维生素均有一种或几种剂量能显著延长热暴露果蝇的平均生存时间和HSP70的含量。结论 :能显著延长果蝇热环境生存时间的维生素可使果蝇的HSP70水平显著升高 ,反之 ,HSP70的增加亦不显著 ,提示前者的保护作用可能与它们诱导HSP增加有关。

吡哆醛异烟酰腙与铝荧光反应的研究

合成了新荧光试剂吡哆醛异烟酰腙,研究了该试剂与铝的荧光反应体系,反应在pH4.85水溶液介质中进行,络合物的荧光激发波长λ_(ex)=410nm;发射波长λ_(em)=453nm。铝量在0～0.8μg/10ml范围内,荧光强度与铝量成正比,方法灵敏度为0.2ng/ml。络合物组成比1:1。实验了28种离子存在下的干扰情况。方法直接应用于化学试剂中痕量铝的测定,精密度好,结果令人满意。

磷酸吡哆醛对血清ALT、AST测定的影响及相关参考值的初步建立

目的研究磷酸吡哆醛(PLP)对测量表观健康人群(未排除脂肪肝患者)丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)催化活性浓度的影响,初步建立血清ALT和AST的参考值。方法以问卷调查方式收集研究对象基本资料,并分为脂肪肝组和非脂肪肝组;将ALT、AST参考测量程序转移至生化分析仪;检测试剂含和不含PLP时的ALT、AST:ALT1(PLP+)、ALT2(PLP-)、AST1(PLP+)、AST2(PLP-);分析PLP对研究对象血清ALT和AST活性测定的影响,并建立参考值。结果总人群、非脂肪肝组男、女间ALT1、ALT2、AST1、AST2差异均有统计学意义(P均<0.05)。总人群男、女间ALT、AST激活程度差异均有统计学意义(U分别为17 985.5、19 111.0,P<0.05);非脂肪肝组男、女间ALT激活程度差异无统计学意义(U=9 616.0,P>0.05),AST激活程度差异有统计学意义(U=8 947.0,P<0.05);脂肪肝和非脂肪肝人群的ALT激活程度和AST激活程度的差异有统计学意义(U分别为8 552.0、16 502.5,P<0.01)。若排除脂肪肝人群,试剂中加入PLP,男性ALT参考值为9.6～43.6 U/L,女性为7.0～30.2 U/L;男性AST参考值为19.8～39.6 U/L,女性为17.9～34.3 U/L。结论若在纳入参考人群时严格排除脂肪肝患者,试剂中添加PLP后ALT及AST参考值与现行参考值较接近,可考虑推广加入含PLP的试剂。

超声波催化二氧化锰氧化吡哆醇为吡哆醛的简便方法

研究了在超声波辐射条件下,市售二氧化锰在5%HCl溶液中氧化吡哆醇为吡哆醛的反应.结果表明,商品二氧化锰可在温和的条件下被超声波辐射活化,在氧化反应中具有良好的氧化性能.与非超声辐射条件下相比,二氧化锰氧化吡哆醇的氧化速率大大提高,反应时间由5h减至30min.

锰-过氧化氢-吡哆醛异烟酰腙动力学荧光分析法的研究

合成了新荧光试剂吡哆醛烟酰腙。详细研究了锰-H_2O_2-吡哆醛异烟酰腙动力学荧光新体系,发现催化氧化产物的荧光激发波长为350nm,发射波长为440nm,反应在pH9.5介质中进行。在固定时间下,锰量在0～50ng/ml范围内,荧光强度与锰量成正比,方法检出下限为0.05ng/ml,试验了34种离子存在下的影响,绝大部分离子允许量在250倍以上,说明该法有良好的选择性。方法直接应用于水样分析,结果令人满意。

磷酸吡哆醛丁咯地尔胶囊治疗慢性脑供血不足临床分析

为观察磷酸吡哆醛丁咯地尔胶囊治疗慢性脑供血不足（chronic cerebral circulation insufficiency,CCCI）的疗效,我院神经内科在2009年6月至2010年6月使用磷酸吡哆醛丁咯地尔胶囊治疗CCCI 50例,并设丁咯地尔片对照组比较,证明其疗效确切、显著,报告如下。1临床资料1.1一般资料选择2009年6月至2010年6月在我科门诊和住院CCCI患者。磷酸吡哆醛丁咯地尔胶囊治疗组,50例,男22例。

离子液体中壳聚糖磷酸吡哆醛席夫碱衍生物的合成与表征

引言壳聚糖是自然界中唯一含有氨基的碱性多糖,具有多样的生物活性、极好的生物相容性、生物可降解性以及无毒性等特性,是一种新兴的生物功能材料[1-3]。磷酸吡哆醛是维生素B6参与多种代谢反应的一种活性形式。磷酸吡哆醛作为一种辅酶参与所有转氨基反应及一些氨基酸的脱羧及脱氢反应。研究表明,磷酸吡哆醛不但可以用于预防治疗高血压、心血管疾病及糖尿病等,还可用于治疗迟发性运动障碍和治疗难治性儿童期癫痫[4-5]。王涛等[6]以壳聚糖微球为载体,然后固定磷酸吡哆醛等制备得到了低密度脂蛋白亲和吸附剂。

探讨丙氨酸氨基转移酶IFCC法检测试剂中加入5＇-磷酸吡哆醛对结果的影响

目的探讨丙氨酸氨基转移酶（ALT）IFCC法检测试剂中加入5’-磷酸吡哆醛对结果的影响。方法依据IFCC公布的酶学测定参考方法（37C）的SOPL]，使用该室建立的测定系统进行丙氨酸氨基转移酶测定，比较加入5’-磷酸吡哆醛和未加5’-磷酸吡哆醛两种试剂检测结果的相关性，并探讨加入5’-磷酸吡哆醛对结果的影响。结果在参考实验室用加5’-磷酸吡哆醛和未加5’-磷酸吡哆醛的ALT试剂分别用参考方法检测22份临床标本，对检测结果进行比较，回归方程为y=0．854X＋1．3059，R2=0．9758，两种试剂的检测结果相关性良好，但两种方法的捡测结果差异有统计学显著性意义（P〈0．05）。用两种试剂分别检测14份混合血清，加入5’-磷酸吡哆醛ALT试剂的检测结果：平均值（x）=104．1536U／L；标准差（s）-1．5820；变异系数（CV）=1．5％，而未加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂的检测结果：平均值（i）=88．7231U／L；标准差0）-0．5542；变异系数（CV）-0．6％。结论加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂与未加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂有较好的相关性，但两组结果的差异有统计学意义。加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂测试结果比未加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂测试结果约高20％，加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂测试结果的变异系数比未加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂测试结果的变异系数高。

家蚕吡哆醛激酶cDNA的克隆、表达和基因结构分析

吡哆醛激酶(pyridoxal kinase,PLK,EC2.7.1.35)是维生素B6关键代谢酶,其cDNA的克隆在昆虫类还未见报道。利用生物信息学原理和使用PCR方法,克隆出编码家蚕Bombyx mori吡哆醛激酶的cDNA(GenBank登录号DQ452397),体外原核表达成功,并对表达粗提产物进行了酶活检测。克隆到的cDNA含有一894bp的完整可读框,编码一条分子量为33.1kD,含298个氨基酸残基的蛋白质。序列比对显示此蛋白质与人类吡哆醛激酶具有52.84%的同一性,包含吡哆醛激酶家族共有的特征保守序列,但比哺乳动物和植物克隆到的吡哆醛激酶均少10多个氨基酸残基,几个有关键功能且在哺乳动物和植物中均保守的氨基酸残基在此蛋白中被替换。依据家蚕基因组数据库信息和PLK的cDNA,家蚕PLK基因包含5个外显子和4个内含子,跨越10kb DNA序列,所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则,基因的5′端启动子调控区发现有TATA-box和CAAT-box保守基序。

磷酸吡哆醛在丙氨酸转氨酶测定中的应用

目的利用含磷酸吡哆醛的Bergmerger改良法的试剂测定血清中的丙氨酸转氨酶(ALT)活性,并与国内不含磷酸吡哆醛的方法作比较,观察磷酸吡哆醛在ALT活性测定中的作用,并建立该方法的参考值。方法用国际临床化学家联合会(IFCC)推荐的Bergmerger改良法与国内试剂同时测定146例患者血清的ALT值,并收集126名健康体检者血清用Bergmerger改良法测定ALT活性,建立该方法的参考值。结果Bergmerger改良法与国内试剂比较其ALT活性增加近20%～50%,参考值范围为:男0～52U/L,女0～42U/L。结论磷酸吡哆醛能有效地激活ALT活性,用含磷酸吡哆醛的Bergmerger改良法测定ALT活性,更能准确地反映患者血液中ALT的实际含量,用该方法测定ALT活性必须建立其相应的参考值。

磷酸吡哆醛的差热分析法鉴定

目的:磷酸吡哆醛进口标准品及合成品的比较与鉴定。方法:应用TG/DTA联用热分析仪分别对磷酸吡哆醛进口和国内合成品进行差热图谱扫描与分析。结果:进口及国内合成的磷酸吡哆醛的热谱特征一致,说明磷酸吡哆醛合成成功;其中的出峰温度、峰面积的差异是由于它们的纯度不同所致。结论:差热分析法用于对物质的鉴定,简便、快速。

烟草磷酸吡哆醛水解酶的分离纯化与表征

采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换、Sephadex G-100凝胶过滤和SP Sephadex C-25阳离子交换柱层析等步骤,对烟草磷酸吡哆醛水解酶进行了分离纯化。结果表明:该酶被纯化了119.6倍,得率为28.49%,经凝胶过滤和SDS-PAGE测得该酶的全分子量为49.6kDa,亚基分子量约为25kDa;该酶最适温度为50℃,最适反应pH为5.5;Mg2+、Ca2+、Mn2+等对该酶有激活作用,金属离子螯合剂EDTA对酶有抑制作用,加入Mg2+后抑制作用得到解除;在最适反应条件下,测得反应底物磷酸吡哆醛(PLP)和磷酸吡哆胺(PMP)的Km值分别为0.23mmol/L和0.56mmol/L。

常规试剂加入磷酸吡哆醛测定丙氨酸转氨酶催化活性浓度的研究

目的探讨在常规试剂中加入磷酸吡哆醛(PPA)测定丙氨酸转氨酶(ALT)催化活性浓度的可行性。方法用加与不加PPA两种常规方法分别比较肝脏患者、心脏患者、透析患者及其表观健康人群血清ALT活性。同时对两种常规方法在参考范围、线性范围、干扰物、精密度、试剂稳定性方面进行比较。结果加入PPA,健康人、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌患者、透析后患者、心绞痛患者和AMI患者的ALT分别升高3.2%、13.2%、23.1%、26.3%、15.2%、35.0%、5.2%和4.0%。结论无论男性还是女性,加入PPA其ALT参考范围仍然在40U/L以内,与目前常规方法的参考范围无差别,临床检验中可以推广加PPA的常规方法。

脂质体催化其表面甘氨酸与磷酸吡哆醛形成希夫碱

利用脂质体的疏水微环境,完成了甘氨酸与磷酸吡哆醛的希夫碱反应。甘氨酸进行双烷基化修饰后,组装到脂质体中。利用肽脂质构建带正电荷的脂质体(pH=7.00),吸附带负电荷的磷酸吡哆醛,增强磷酸吡哆醛与脂质体上甘氨酸的伯胺基团作用,并通过脂质体疏水微环境促进脱水缩合过程。紫外光谱检测结果表明,单独的磷酸吡哆醛吸收峰为387 nm,吸附到脂质体后吸收峰红移到395 nm;当PLP与脂质体上甘氨酸反应转变为希夫碱后,最大吸收峰蓝移到336 nm;希夫碱结合铜离子后,最大吸收峰从336 nm再次红移,出现383 nm吸收峰。脂质体上新形成的希夫碱与乳酸脱氢酶竞争铜离子,解除铜离子对乳酸脱氢酶活性的抑制。