大豆吡哆醛激酶基因的克隆与表达分析

以拟南芥吡哆醛激酶基因（PK）的蛋白质序列为信息探针,对大豆（Glycine max）EST数据库进行同源搜索和序列拼接,获得了全长为1 102 bp的大豆吡哆醛激酶基因的cDNA序列,经RT-PCR克隆和序列分析验证,结果表明与电子克隆序列一致（GenBank登录号为DQ006813）。该cDNA序列的开放阅读框（ORF）位于第119-1 045位,推测编码308个氨基酸。采用半定量RT-PCR方法研究了该基因的组织特异性表达情况和对强光逆境的反应,结果表明该基因在大豆根茎叶中都有表达,对强光逆境不敏感。将大豆PK基因编码的蛋白序列与马铃薯（Solanum tuberosum,AAY85186）、拟南芥（Arabidopsis thaliana,AAK94021）、水稻（Oryza sativa,ABA99785）、小麦（Triticum aestivum,AAR00318）和油菜（Brassica napus,ABE73472）的吡哆醛激酶蛋白序列进行比对,发现其一致性分别为：81%,75%,78%,79%和76%。比对结果说明在植物中该基因编码的蛋白质存在显著的相似性。根据蛋白比对结果绘制的系统发育树基本代表了它们在经典分类上的地位。

家蚕吡哆醛激酶cDNA的克隆、表达和基因结构分析

吡哆醛激酶(pyridoxal kinase,PLK,EC2.7.1.35)是维生素B6关键代谢酶,其cDNA的克隆在昆虫类还未见报道。利用生物信息学原理和使用PCR方法,克隆出编码家蚕Bombyx mori吡哆醛激酶的cDNA(GenBank登录号DQ452397),体外原核表达成功,并对表达粗提产物进行了酶活检测。克隆到的cDNA含有一894bp的完整可读框,编码一条分子量为33.1kD,含298个氨基酸残基的蛋白质。序列比对显示此蛋白质与人类吡哆醛激酶具有52.84%的同一性,包含吡哆醛激酶家族共有的特征保守序列,但比哺乳动物和植物克隆到的吡哆醛激酶均少10多个氨基酸残基,几个有关键功能且在哺乳动物和植物中均保守的氨基酸残基在此蛋白中被替换。依据家蚕基因组数据库信息和PLK的cDNA,家蚕PLK基因包含5个外显子和4个内含子,跨越10kb DNA序列,所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则,基因的5′端启动子调控区发现有TATA-box和CAAT-box保守基序。

吡哆醛激酶研究进展

吡哆醛激酶(PLK)属于核糖激酶超家族成员,广泛存在于生物有机体中,它是维生素B6的关键代谢酶,PLK能够催化维生素B6的磷酸化,使之转化为有活性的吡哆醛磷酸(PLP),而PLP在氨基酸合成分解代谢中发挥着重要的作用。本文从PLK结构、分类、生物学功能及其与某些疾病的联系等方面,进行详细的综述,为了解这一激酶、开展相关研究提供便利。

家蚕吡哆醛激酶基因干扰降低转氨酶基因的转录表达

【目的】维生素B_6在氨基酸代谢中是多种酶的辅酶,维持氨基酸代谢的正常运行。磷酸吡哆醛（pyridoxal-5＇-phosphate,PLP）是维生素B_6的主要辅酶形式,吡哆醛激酶（pyridoxal kinase,PLK）是PLP的重要生成酶,本研究试图明确PLK基因与PLP依赖酶之间转录水平的调节关系。【方法】本研究采用RNA干扰（RNA interference,RNAi）方法对家蚕Bombyx mori的PLK基因进行干扰,通过体外合成PLK基因的3个干扰片段（siRNA1,siRNA2和siRNA3）,将siRNA从体腔注入5龄第3天的家蚕幼虫体内诱导RNAi。利用荧光定量PCR测定不同干扰片段、不同时间点及不同组织中PLK基因表达量的变化;并测定家蚕体内磷酸丝氨酸转氨酶（phosphoserine aminotransferase,Ser B）和天门冬氨酸氨基转移酶（asparate aminotransferase,AST）基因的表达量。【结果】注射干扰片段后48 h干扰效果达到最佳。3个干扰片段干扰效果从高到低依次为siRNA1,siRNA2和siRNA3。RNAi效果最好的是中肠组织,其PLK基因的相对表达量下降了55%。RNA干扰PLK基因后,后部丝腺中Ser B和AST基因相对表达量分别下降了90%和29%。【结论】本研究通过RNAi实现了家蚕PLK基因干扰,并进一步证明了家蚕PLK基因和Ser B基因及AST基因存在联动调节关系。

家蚕吡哆醛激酶的融合表达与纯化

【目的】吡哆醛激酶（pyridoxal kinase,PLK,EC2.7.1.35）是维生素B6的关键代谢酶。本研究原核表达家蚕Bombyxmori重组PLK,为进一步开展家蚕PLK的催化作用机制和表达调控机制的研究奠定基础。【方法】构建家蚕PLK基因融合表达质粒,转化大肠杆菌Escherichia coli诱导表达,经Ni2＋亲和层析纯化后,对融合蛋白的催化活性进行分析。【结果】纯化后的家蚕重组PLK经SDS-PAGE鉴定为单一条带,比活力为1800U/mg,纯化倍数为40倍。在底物过量的条件下,该重组酶的体外最适反应温度是50℃;最适pH为5.5~6;Zn2＋是酶促反应有效的激活剂。【结论】重组家蚕PLK与来源于家蚕组织的PLK具有相同的催化性质。

吡哆醛激酶(PDXK)促进浆液性卵巢癌细胞增殖并与不良预后相关

目的探讨吡哆醛激酶(PDXK)对浆液性卵巢癌(SOC)细胞株HEY细胞增殖的影响,分析PDXK表达水平与SOC患者临床病理特征及生存之间的相关性。方法通过实时定量PCR、Western blot法检测PDXK在IOSE80正常卵巢细胞株与3AO、A2780、OVCAR3、ES-2、HEY卵巢癌细胞的表达水平。在高表达PDXK的HEY卵巢癌细胞敲低PDXK,用CCK-8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期。免疫组织化学染色法检测PDXK在正常卵巢上皮组织及SOC组织中的表达,分析PDXK表达与SOC患者临床特征及预后的关系。结果PDXK在卵巢癌细胞株中表达高于正常卵巢细胞株,敲低PDXK可以抑制HEY细胞的增殖,阻滞细胞周期由G1期向S期转化。PDXK在SOC组织中表达高于正常卵巢组织,且与卵巢癌的FIGO晚期、肿瘤低分化、多糖抗原125(CA125)表达呈正相关,与更短的无进展生存(PFS)时间相关。结论PDXK促进SOC细胞增殖,与临床预后差相关。

家蚕磷酸吡哆醛激酶cDNA的克隆和酶活表征(英文)

吡哆醛激酶 (EC 2.7.1.35) 在 ATP 和 Zn2+的存在下,催化吡哆醛的磷酸化反应生成磷酸吡哆醛 (PLP)。在生物体内许多酶促反应中,PLP 是一种重要的辅酶因子。家蚕和哺乳动物一样,需依赖食物中的维生素 B6前体来合成 PLP。文章描述了利用家蚕基因组数据库序列信息及使用 PCR 方法,克隆出编码家蚕吡哆醛激酶的 cDNA (GenBank 登录号:DQ452397)。克隆到的 cDNA 含有一个 894 bp 的完整可读框,编码一条分子量为 33.1 kDa,含 298 个氨基酸残基的蛋白质。序列比对显示此蛋白质序列与人类吡哆醛激酶蛋白序列具有 48.6%的同一性,包含吡哆醛激酶家族共有的特征保守序列,但其氨基酸残基数比哺乳动物和植物克隆到的吡哆醛激酶残基数均少 10 多个残基。多序列比对结果显示,吡哆醛激酶中几个有关键功能且在哺乳动物和植物中均保守的氨基酸残基在此蛋白中被替换为其他种类氨基酸残基。采用 T7 启动子和 T7 聚合酶表达系统对克隆到的 cDNA 进行了原核表达并对表达粗提产物进行了酶活检测。实验结果显示表达得到的可溶性蛋白产物占其总蛋白量为 10%,细胞粗提物具有活力为 30 nmol/min/mg 的吡哆醛激酶活性,结果证实了克隆到的 cDNA 编码家蚕中的吡哆醛激酶。

外源激素处理后家蚕吡哆醛激酶和磷酸吡哆醇氧化酶转录水平的变化

【目的】研究家蚕Bombyx mori经蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20-E）和保幼激素类似物（juvenile hormone analogue,JHA）处理后引起吡哆醛激酶（pyridoxal kinase,PLK）和磷酸吡哆醇氧化酶（pyridoxine-5＇-phosphate oxidase,PNPO）的转录水平变化,为进一步研究激素对蚕体营养代谢等工作奠定基础。【方法】以20-E和JHA分别喂食不同发育时期（5龄第1,3和5天）的家蚕幼虫,以喂食蒸馏水的家蚕为对照,采用实时荧光定量PCR（realtime quantitative PCR）方法在处理后24和48 h对各组幼虫后部丝腺中PLP合成酶PLK和PNPO的转录水平进行分析。【结果】5龄第1天幼虫经20-E处理24和48 h后,PLK和PNPO的转录水平出现上调且与对照的差异达到极显著（P〈0.01）;5龄第3天幼虫经20-E处理,PLK的转录水平在48 h出现下调且与对照的差异达到显著（P〈0.05）,PNPO的转录水平在24和48 h均出现上调且与对照的差异达到极显著（P〈0.01）;5龄第5天幼虫经20-E处理后PLK和PNPO的转录水平无变化。5龄第1天幼虫经JHA处理后PLK和PNPO的转录水平未受到影响;5龄第3天幼虫经JHA处理后,PLK的转录水平在48 h出现显著下调且与对照的差异达到显著（P〈0.05）,PNPO的转录水平在24和48 h后均出现显著下调且与对照的差异达到极显著（P〈0.05）;5龄第5天幼虫经JHA处理24和48 h后,PLK和PNPO的转录水平出现下调且与对照的差异达到极显著（P〈0.01）。【结论】20-E和JHA显著影响家蚕5龄幼虫PLK和PNPO的转录水平,20-E提高5龄前期家蚕PLK和PNPO的转录水平,JHA降低5龄后期它们的转录水平,为深入研究激素对VB_6的调控奠定基础。

家蚕吡哆醛激酶基因定点突变及突变体功能

【目的】吡哆醛激酶(pyridoxal kinase,PLK)是维生素B6关键代谢酶。前期研究克隆出家蚕Bombyx mori吡哆醛激酶cDNA,经序列比对发现几个重要且保守的氨基酸残基在此蛋白中被替换。为明确家蚕吡哆醛激酶分子若干特定位置上氨基酸残基在酶功能上的作用进行本研究。【方法】采用重叠延伸法对家蚕吡哆醛激酶Thr47,Asn121,Ile54,Arg88和Trp230氨基酸残基进行定点突变,构建表达载体pET-22b(+)-PLK并转入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta中进行诱导表达,经亲和层析对重组蛋白进行纯化,通过酶活性检测进行功能鉴定。【结果】家蚕吡哆醛激酶Thr47,Ile54和Arg88氨基酸突变后酶的催化活力分别下降82%,58%和85%;Asn121突变对酶的催化活力几乎没有影响;而Trp230突变导致酶丧失催化活性。【结论】本研究明确了选定氨基酸侧链基团在家蚕吡哆醛激酶催化功能上的意义。

吡哆醛激酶基因在家蚕体内的时空表达特征

【目的】了解家蚕Bombyx mori维生素B6关键代谢酶吡哆醛激酶(pyridoxal kinase,PLK)在家蚕不同组织间的表达差异。【方法】原核表达家蚕重组PLK,获得目的蛋白制备多克隆抗体,利用Western blot方法对PLK在家蚕不同发育时期、5龄第3天幼虫不同组织及5龄不同日龄幼虫表皮、头部和马氏管中的表达进行分析;并采用实时荧光定量PCR的方法对PLK基因在家蚕不同组织中的mRNA转录水平进行比较。【结果】PLK在家蚕5龄幼虫的表达水平最高,在5龄第3天幼虫各组织中的表达由高到低依次为:精巢、马氏管、表皮、中肠、头部、卵巢、脂肪体、丝腺;5龄期不同日龄幼虫表皮组织的表达差异最大,头部和马氏管中均为前期表达量稍高于后期。在转录水平方面,精巢的表达量最高,其次是马氏管和头部。【结论】PLK在家蚕不同发育时期及组织中的差异表达进一步证实PLK在家蚕VB6代谢中的生物学功能的重要性。

磷酸吡哆醛补救途径两个关键酶的研究进展

维生素B_6(VB_6)包括6个可相互转换的吡啶衍生物。其中,磷酸吡哆醛(PLP)作为140多种细胞酶的辅酶,在生物体内发挥重要作用。动物从食物中获得VB_6,通过由吡哆醛激酶和磷酸吡哆醇氧化酶构成的补救途径合成PLP。PLP依赖酶的正常功能乃至人体最佳健康状态,依赖于细胞中PLP的平衡供给。然而,就PLP的动态平衡和调节机制以及PLP合成后的转移机制而言,目前还知之甚少,是一个富有挑战性的研究领域。为此,综述PLP补救途径两个关键酶的研究进展。

茶树鲜叶中维生素B_6代谢酶PLK的活性分析

吡哆醛激酶(Pyridoxal Kinase,PLK)是维生素B6(VB6)代谢关键酶。从茶鲜叶中直接提取含PLK的粗酶液,经过硫酸铵沉淀、透析处理后,采用苯肼衍生化方法检测定PLK活性,并对其基本酶学性质进行分析。结果表明,提取时加入100%茶鲜重的PVPP,效果最佳。纯化后的茶鲜叶PLK比活力为0.737nmol/(min·mg),纯化倍数为4.0;当有二价金属离子存在时,PLK才具有催化活性,其中Zn2+对其催化作用最强。该酶的最适反应温度为60℃;在pH6.0左右酶活力最高。在最适反应条件下,测得反应底物ATP和PL的Km值分别为19.3μmol/L和53μmol/L。

Expression of a novel pyridoxal kinase mRNA splice variant,PKH-T, in human testis

Aim: To identify the genes specifically expressed in human adult and fetal testes and spermatozoa.Methods: A human testis cDNA microarray was established. Then mRNAs of human adult and fetal testis and spermatozoa were purified and probes were prepared by a reverse transcription reaction with mRNA as the template.The microarray was hybridized with probes of adult and fetal testes and spermatozoa. The nucleic acid sequences of differentially expressed genes were determined and homologies were searched in the databases of GenBank. Results:A novel human testis-specific gene, PKH-T, was identified by hybridizing adult and fetal testis and spermatozoa probes with a human testis cDNA microarray. The cDNA of PKH-T was 1069 bp in length. The cDNA sequence of this clone was deposited in the Genbank (AY303972) and PKH-T was also determined as Interim GenSymbol (Unigene,HS.38041). PKH-T contained most PKH conserved motif. The 239 amino acid sequences deduced from the 719 bp open reading frame (ORF) had a homology with the gene PKH (U89606). PKH-T was specifically and strongly expressed in the testis. Comparison of the differential expressions of PKH and PKH-T in testes of different develop-mental stages indicated that PKH-T was expressed in the adult testis and spermatozoa, while PKH, in the adult, fetal and aged testes. PKH-T had no expression in the testis of Sertoli cell only and partially spermatogenic arrest patients.Conclusion: PKH-T is a gene highly expressed in adult human testis and spermatozoa. It may play an important role in spermatogenesis and could be related to male infertility.

维生素B6与肺癌关系研究进展

目前肺癌是对人类生命健康威胁重大的恶性肿瘤,发病率高、病死率高.全程管理和包括营养治疗的综合治疗尤为重要.维生素B6作为重要B族维生素,广泛参与机体合成与代谢反应.但是,维生素B6在不同疾病的发生、发展和治疗中的作用尚未完全清晰.本文综合国内外进展初步探讨维生素B6对肺癌的发生风险与疾病进展的影响,了解维生素B6的需求情况是否会在肺癌疾病发生、进展和治疗不同的阶段而发生变化.结合这些研究,本文得出以下几点提示:血清维生素B6水平与肺癌发生风险呈负相关,但对于健康人群或者非肺癌人群,膳食补充维生素B6不能减低肺癌发生风险,高剂量补充维生素B6可能有害.机体维生素B6明显缺乏时,罹患肺癌的风险增加.对于肿瘤人群,维生素B6单独或联合其他营养素使用可抑制肿瘤细胞增殖和迁移,诱导抗肿瘤细胞因子产生,发挥抗肿瘤作用.因此维生素B6的摄入和补充应首先进行机体健康状况尤其是机体维生素B6水平的评估.