血红素激活含pyrin结构域NOD样受体家族蛋白3(NLRP3)炎性体诱导肾小管上皮细胞焦亡

目的研究血红素是否通过活化肾小管上皮细胞含pyrin结构域NOD样受体家族蛋白3(NLRP3)炎性体引起焦亡而损伤肾脏功能。方法使用血红素处理人肾小管上皮HK-2细胞,通过扫描电镜观察细胞膜上是否有穿孔,免疫荧光染色检测焦亡执行蛋白消皮素D氨基端蛋白(GSDMD-N)的形成情况,明确血红素是否引起人肾小管上皮HK-2细胞焦亡。通过Western blot法检测NLRP3炎性体相关蛋白分子NLRP3、含胱天蛋白酶募集结构域凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、胱天蛋白酶l前体(pro-caspase-1)和剪切体(caspase-1 p20)、白细胞介素1β前体(pro-IL-1β)和IL-1β等确定血红素是否引起人肾小管上皮HK-2细胞中NLRP3炎性体的活化;通过异体输血构建小鼠溶血模型在动物水平进一步验证溶血释放的血红素是否活化NLRP3炎性体而导致肾损伤。采集静脉血进行血涂片进行Wright-Giemsa染色光镜观察,分光光度计比色法检测游离血红蛋白;全自动生化分析仪检测血清尿素氮以及HE染色观察肾组织病变情况确定溶血模型建立是否成功;分离提取溶血小鼠肾小管上皮细胞,Western blot法检测NLRP3、ASC、pro-caspase-1、caspase-1 p20、pro-IL-1β、IL-1β、GSDMD-N蛋白表达情况明确溶血模型中NLRP3炎性体的活化情况以及焦亡执行蛋白的表达。结果血红素造成肾小管上皮HK-2细胞损伤,细胞膜上出现小孔,焦亡执行蛋白GSDMD-N表达增高,HK-2细胞中NLRP3炎性体相关蛋白caspase-1 p20、IL-1β表达上调;溶血模型小鼠的肾脏功能受损,小鼠肾小管上皮细胞中NLRP3炎性体相关蛋白caspase-1 p20、IL-1β、GSDMD-N表达上调。结论血红素活化肾小管上皮细胞的NLRP3炎性体,诱导焦亡,进而导致肾功能损伤。

含pyrin结构域NOD样受体家族3(NLRP3)炎性体抑制剂及其作用机制研究进展

含pyrin结构域NOD样受体家族3(NLRP3)炎性体是由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)及胱天蛋白酶1(caspase-1)组成的蛋白复合体,主要介导白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18的前体成熟参与炎症反应。NLRP3炎性体的异常活化与代谢紊乱、神经退行性疾病、自身免疫性疾病等炎症性疾病的发生发展关系密切。寻找并开发NLRP3炎性体的有效抑制剂成为治疗炎症性疾病的新策略。我们总结了已报道的在NLRP3炎性体活化的起始阶段和激活阶段发挥作用的抑制剂及其作用机制,期望为开发以NLRP3炎性体为靶点的抗炎药物提供新思路。

核苷酸结合寡聚结构域样受体(NLR)在免疫代谢中的研究进展

固有免疫中的核苷酸结合寡聚结构域样受体(NLR)家族对免疫功能的发挥起着至关重要的作用。含pyrin结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白3(NLRP3)、核苷酸结合寡聚结构域样受体X1(NLRX1)和含CRAD结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白3(NLRC3)是NLR家族中的关键成员,它们与免疫代谢之间的关联成为研究的新焦点。NLRP3的激活可促进炎性小体的组装,导致白细胞介素1β(IL-1β)的激活,进而引发炎症反应。NLRC3则能抑制核因子κB(NF-κB)和干扰素基因刺激物/TANK结合激酶1(STING/TBK1)信号通路的激活,以及炎性小体的形成,进而调控免疫反应。而NLRX1则通过调节Ⅰ型干扰素、NF-κB信号传导以及自噬等过程,对免疫应答进行精细调控。这些NLR成员不仅参与病原体的识别,更与免疫代谢的调控密切相关。对NLR家族的深入研究将有助于揭示免疫代谢的奥秘,为疾病的治疗提供新的思路。

二甲双胍抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠NLRP3炎性体相关蛋白表达并减轻其炎症

目的探讨二甲双胍(MET)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠含pyrin结构域寡核苷酸结合结构域样受体家族蛋白3(NLRP3)炎性体的调节作用。方法建立EAE小鼠模型同时设正常阴性对照组,在免疫的第14天(小鼠开始出现神经功能缺损),将建模小鼠随机分成EAE组和MET处理组,MET处理组腹腔注射MET,剂量为200 mg/kg,持续给药11 d,模型组及正常阴性对照组腹腔注射等体积PBS。观察小鼠药物干预前后临床评分,免疫组织化学染色观察脊髓病变部位NLRP3、胱天蛋白酶1(caspase-1)、含胱天蛋白酶激活和募集结构域凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的表达情况;HE染色观察脊髓炎症细胞浸润、固蓝(FB)染色观察髓鞘脱失的情况;ELISA检测血清中促炎因子白细胞介素18(IL-18)和抑炎因子IL-10的水平。结果与EAE组相比,MET处理组临床评分显著降低,脊髓组织浸润的炎细胞减少,脱髓鞘明显改善;NLRP3、caspase-1、ASC蛋白表达显著减少;与正常组相比,EAE组IL-18表达明显增加,IL-10表达量下降;而MET处理组IL-18表达量下降,IL-10表达量增加。结论MET抑制NLRP3炎性体相关蛋白的表达,抑制炎症因子的释放,减轻EAE小鼠的炎症反应。

苦豆碱通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3通路改善香烟烟雾诱导的人支气管上皮细胞损伤

目的探究苦豆碱(Alo)对香烟烟雾诱导的人支气管上皮细胞损伤的作用及其可能的作用机制。方法16HBE人支气管上皮细胞经100 mL/L香烟烟雾提取物(CSE)和(50、100、200)μmol/L Alo共处理后,CCK-8法检测细胞活力,试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)活性;原位末端转移酶标记技术(TUNEL)、Western blot法检测细胞凋亡,ELISA检测炎性因子水平;2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针和相关试剂盒检测氧化应激水平;Western blot法检测Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)/含pyrin结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白3(NLRP3)通路相关蛋白表达水平。16HBE细胞经100 mL/L CSE和200μmol/L Alo共处理后,采用上述方法检测过表达TLR4对TLR4/NF-κB/NLRP3通路、细胞LDH活性、凋亡、炎症反应及氧化应激的影响。结果CSE暴露可降低16HBE细胞活力,增加LDH释放和细胞凋亡,增强炎症反应和氧化应激水平,且激活TLR4/NF-κB/NLRP3通路;经Alo处理后,细胞活性升高,LDH释放减少、凋亡降低、炎症减轻、氧化应激水平下降,且TLR4/NF-κB/NLRP3通路失活;TLR4过表达可逆转Alo处理对CSE诱导的16HBE细胞损伤的保护作用。结论Alo可通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3通路减轻CSE诱导的人支气管上皮细胞损伤。

蛋白磷酸酶C1-TEN在急性髓系白血病细胞中的表达及抑制FLT3-ITD对其表达的影响

目的:本研究旨在揭示急性髓系白血病(AML)细胞中具有C1结构域并与TENsin同源的蛋白磷酸酶(C1-TEN)的表达情况,并探讨中间串联重复突变FMS样酪氨酸激酶3(FLT3-ITD)抑制条件下C1-TEN的表达水平。方法:利用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)索拉菲尼、米朵妥林作用于AML细胞系HL-60细胞、MV4-11细胞,采用MTT实验评价AML细胞对TKI的敏感性;TKI对AML细胞FLT3活化作用及对C1-TEN表达的影响采用Western blot(WB)分析;CCK-8实验分析C1-TEN抑制对AML细胞活性的影响;WB、流式(FACS)检测细胞凋亡情况。结果:相比FLT3野生型(FLT3-WT)HL-60细胞,FLT3-ITD突变MV4-11细胞对TKI显著敏感(P<0.05)。WB结果显示,经TKI作用后MV4-11细胞的酪氨酸激酶FLT3活化较HL-60细胞显著下降(P<0.05)。与阴性对照组比较,TKI处理组MV4-11细胞C1-TEN表达显著下降,而HL-60细胞的变化不明显。C1-TEN抑制剂DHTS作用后,MV4-11细胞活性显著下降(P<0.05),且DHTS与TKI具有协同抑制作用。WB、FACS结果显示,DHTS处理组MV4-11细胞凋亡显著高于阴性对照,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:本研究首次报道AML细胞C1-TEN表达情况,揭示FLT3-ITD能上调AML细胞C1-TEN表达,而抑制C1-TEN可通过细胞凋亡机制杀伤FLT3-ITD突变的AML细胞,因此提示该蛋白磷酸酶可能是FLT3-ITD下游分子,有望成为AML治疗的新靶点。

炎性体成分NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3对重型颅脑损伤患者预后评估的价值

目的探讨炎性体成分NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）对重型颅脑损伤患者预后评估的价值。方法采用酶联免疫吸附法检测20例重型颅脑损伤患者脑脊液NLRP3浓度，结合格拉斯哥预后评分（GOS）等临床资料对比分析。结果重型颅脑损伤患者脑脊液NLRP3浓度为（33．8±11．6）μg/L，明显高于中型颅脑损伤组[（11．4±2．9）μg/L，P〈0．01]和正常对照组[（1．1±0．3）μg/L，P〈0．01]；预后不良组NLRP3浓度为（42．8±14．4）μg/L，明显高于预后良好组[（29．9±7．9）μg／L，P〈0．05]；患者NLRP3浓度与CT表现（r=0．601，P〈0．01）及GOS评分（r=0．665，P〈0．01）明显相关。结论脑脊液中NLRP3水平可以反映脑损伤程度，可作为评估颅脑损伤患者预后的标志物。

二甲双胍通过腺苷酸活化蛋白激酶-Nod样受体家族包含pyrin结构域蛋白3对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

目的观察二甲双胍通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)-Nod样受体家族包含pyrin结构域蛋白3(NLRP3)对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响。方法成年SD大鼠随机数字表法分为对照组、模型组和二甲双胍组,采用结扎左冠状动脉前降支构建大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。二甲双胍组大鼠建模前灌胃给于二甲双胍250 mg/kg,对照组和模型组给与等体积生理盐水。3组大鼠再灌注2 h后,采用生化酶法检测心肌损伤标志物酸激酶(CK-MB)和肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ);采用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色和原位缺口末端标记法(TUNEL)染色分析大鼠心肌组织梗死面积和凋亡指数;采用酶联免疫吸附测定(ELISA)分析白细胞介素(IL)-1β和IL-18的表达水平;采用蛋白质印迹法(Western blot)分析大鼠心肌组织AMPK、NLRP3和半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-1表达水平。计量组数比较采用单因素方差分析。结果二甲双胍组大鼠心肌梗死比例[(26.14±4.71)%]明显低于模型组大鼠心肌梗死比例[(43.74±15.00)%],差异有统计学意义(t=3.540,P<0.05)。二甲双胍组大鼠血清CK-MB和cTnⅠ水平[(1821.88±213.52)U/L、(1.45±0.13)ng/L]明显低于对照组[(3100.87±149.41)U/L、(3.08±0.25)ng/L],差异有统计学意义(t=15.520、18.240,P<0.05)。二甲双胍组大鼠心肌凋亡比例[(10.56±2.36)%]明显低于模型组大鼠心肌凋亡比例[(27.43±3.90)%],差异有统计学意义(t=11.710,P<0.05)。二甲双胍组大鼠心肌组织磷酸化AMPK表达水平(1.22±0.11)明显高于对照组和模型组大鼠心肌组织(0.59±0.08、0.81±0.06),差异有统计学意义(t=14.370、10.510,P<0.05)。二甲双胍组大鼠心肌组织NLRP3和Caspase-1蛋白表达水平(1.19±0.15、1.24±0.10)明显低于模型组大鼠心肌组织(1.78±0.12、1.82±0.16),差异有统计学意义(t=9.895、9.554,P<0.05)。二甲双胍组大鼠血清IL-1β和IL-18水平[(98.20±7.25)、(94.90±8.57)pg/ml]明显低于模型组大鼠血清IL-1β和IL-18水平[(148.70±15.33)、(156.10±21.03)pg/ml],差异有统计学意义(t=9.414、8.633,P<0.05)。结论二甲双胍通过激活AMPK,抑制NLRP3介导的炎性反应,对缺血再灌注损伤心肌起保护作用。

Nod样受体家族包含pyrin结构域蛋白-3 mRNA在儿童类风湿关节炎中的表达对比研究及临床意义

目的检测儿童类风湿关节炎亚型（S-JIA、JIA少关节型）外周血Nod样受体家族包含pyrin结构域蛋白-3（NLRP-3） mRNA基因表达差异，探讨NLRP-3 mRNA表达水平差异与患儿临床表现特征的相关性。 方法收集28例初治类风湿关节炎（S-JIA13例，JIA少关节型15例）住院患儿及20例同期正常体检患儿的外周血标本，提取标本总RNA，实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测外周血标本中NLRP-3 mRNA表达的差异。 结果在外周血中NLRP-3 mRNA在S-JIA组的相对表达量为0.066 7±0.004 4，高于JIA少关节型组（0.010 7±0.001 5）及正常对照组（0.021 3±0.003 2），差异有统计学意义（F＝5.491，P＝0.010）；正常对照组与JIA少关节型组之间比较时，差异无统计学意义（F＝1.745，P＝0.105）。 结论NLRP-3 mRNA水平升高，是导致S-JIA产生炎性反应的重要影响因素之一。

青蒿素抑制Nod样受体家族包含pyrin结构域蛋白3复合物对心肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的探讨青蒿素抑制Nod样受体家族包含pyrin结构域蛋白3(NLRP3)复合物对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法选用SD大鼠,结扎左冠状动脉前降支,构建大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,并随机分为对照组、模型组和青蒿素组,每组10只。其中10只不结扎的大鼠作为假手术组。青蒿素组大鼠建模前灌胃25 mg/kg青蒿素,模型组和对照组建模前灌胃等体积生理盐水。3组大鼠造模1 d后采用生化酶法检测心肌损伤标志物酸激酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ);采用TTC染色分析3组大鼠梗死百分比;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)分析白细胞介素(IL)-1β和IL-18的表达水平;采用蛋白质印迹法(Western blot)分析大鼠心肌组织半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-1/NLRP3表达水平。组间比较采用单因素方差分析。结果青蒿素组大鼠血清CK-MB、LDH和cTnⅠ水平[(2424.30±199.06)U/L、(1128.30±118.46)U/L、(35.26±3.56)pg/ml]明显低于模型组[(4105.10±191.55)U/L、(1682.00±155.21)U/L、(73.46±8.67)pg/ml],差异有统计学意义(t=19.240、8.968、12.890,P<0.05)。青蒿素组大鼠心肌梗死百分比[(28.05±4.51)%]明显低于模型组[(46.07±4.27)%],差异有统计学意义(t=9.163,P<0.05)。青蒿素组大鼠血清IL-1β和IL-18水平[(92.80±7.94)、(81.40±4.50)pg/ml]明显低于模型组[(172.60±11.62)、(117.70±7.89)pg/ml],差异有统计学意义(t=17.930、12.640,P<0.05)。青蒿素组大鼠心肌组织Caspase-1和NLRP3表达水平(1.37±0.10、1.34±0.05)明显低于模型组(1.80±0.11、2.00±0.13),差异有统计学意义(t=9.542、14.670,P<0.05)。结论青蒿素通过抑制NLRP3复合物活性,降低IL-1β和IL-18表达水平,进而对大鼠缺血再灌注损伤心肌组织起保护作用。

小鼠抗NLRP3单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备小鼠抗含pyrin结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白3(NLRP3)的单克隆抗体(mAb)并检测其特异性。方法 将编码小鼠NLRP3基因外显子3(Ms-N3)的基因片段插入载体p36-G3-throhFc中构建重组质粒Ms-N3-throhFc,然后将该质粒转染到HEK293F细胞中,进行真核蛋白表达。进一步利用蛋白A亲和层析柱纯化得到Ms-N3蛋白并免疫NLRP3基因敲除(NLRP3^(-/-))小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞。进而通过ELISA和免疫荧光方法筛选能够分泌特异性识别小鼠NLRP3的mAb的杂交瘤细胞。结果 成功构建Ms-N3-throhFc重组质粒并证明该质粒能在HEK293F细胞中稳定表达。ELISA初步筛选获得12株杂交瘤细胞,经过免疫荧光实验检测发现其中的9-B8-3-2-C5分泌的mAb能够特异性识别非变性的小鼠NLRP3蛋白,该mAb的重链亚型为IgM,轻链亚型为κ。结论 成功获得小鼠抗NLRP3 mAb。

敲低IL-33下调炎症因子和NLRP3表达抑制哮喘小鼠炎症反应

目的探讨白细胞介素33(IL-33)对哮喘小鼠炎症反应的调控机制。方法利用10μg/mL脂多糖(LPS)构建小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSC)的体外细胞炎症模型,根据是否转染IL-33的小干扰RNA(si-IL-33)质粒和过表达(IL-33-OE)质粒,将细胞分成si-IL-33组,IL-33-OE组和模型组。实时荧光定量PCR检测IL-33、含pyrin结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白3(NLRP3)、IL-1β和IL-6的信使RNA(mRNA)表达水平。钙离子荧光探针检测试剂盒(Fluo-3 AM)检测钙离子含量,JC-1线粒体膜电位检测试剂盒检测线粒体膜电位变化。利用腹腔注射致敏剂和激发剂的方法建立小鼠哮喘模型,根据处理方案的不同,将哮喘小鼠分成si-IL-33组、IL-33-OE组和模型组,每组5只。ELISA试剂盒检测小鼠血清IL-1β、IL-6和NLRP3含量,HE染色和Masson染色检测肺组织的病变情况。结果与模型组相比,si-IL-33组的IL-33、NLRP3、IL-1β和IL-6的mRNA表达量均降低,IL-33-OE组的IL-33、NLRP3、IL-1β和IL-6的mRNA表达量增加。BMMSC中钙离子荧光降低,而IL-33-OE组中钙离子荧光升高。si-IL-33组细胞线粒体中JC-1以聚合物形式存在,呈明亮的红色荧光,细胞中的绿色荧光非常弱;说明si-IL-33组细胞线粒体稳定,线粒体功能尚在。使用IL-33-OE质粒处理使线粒体膜电位下降后,JC-1不能以聚合物形式存在于线粒体基质中,此时线粒体内红色荧光强度显著降低,而细胞质中的绿色荧光显著增强。si-IL-33组小鼠血清中IL-1β、IL-6、NLRP3的含量明显降低,而IL-33-OE组小鼠血清中IL-1β、IL-6、NLRP3的含量明显升高。si-IL-33组几乎未见炎细胞浸润,炎症缓解,上皮细胞正常。si-IL-33组肺组织的纤维增生部分趋于正常。与模型组相比,si-IL-33组的支气管壁总面积(WAt)/支气管基底膜周径(Pbm)和气管壁平滑肌面积(WAm)/Pbm降低,IL-33-OE组的WAt/Pbm和WAm/Pbm增加。结论敲低IL-33通过下调NLRP3、IL-1β、IL-6表达抑制哮喘小鼠的炎症反应。

猪颈动脉粥样硬化斑块易损性与Nod样受体家族包含pyrin结构域蛋白3炎性小体的关系

目的 观察小型猪颈动脉粥样硬化模型中斑块组织Nod样受体家族包含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）炎性小体的表达.方法 高脂高胆固醇饮食联合部分结扎颈动脉方法,在6头小猪建立双侧颈动脉粥样硬化模型.3个月后观察颈动脉粥样硬化斑块中NLRP3蛋白的表达.结果 12根小猪颈动脉片段中可形成不同程度的粥样硬化改变.早期斑块中,NLRP3主要表达在新生内膜的内皮细胞;进展期斑块中,NLRP3主要分布在斑块的内皮细胞、斑块基底部和脂质核心周围.NLRP3的阳性表达评分与斑块破裂[（6.65±4.32）分比（1.77±3.15）分,P＜O.01]、斑块内出血[（6.18±4.31）分比（1.83±3.30）分,P＜0.05]和血管新生[（6.10±4.56）分比（3.69±3.57）分,P ＜0.05]密切相关.结论 小型猪动脉粥样硬化斑块中NLRP3蛋白的高表达反映了斑块易损性特征.

X线辐照激活NLRP3炎性体引起损伤肺组织细胞焦亡(pyroptosis)

目的建立放射性肺损伤模型,研究胱天蛋白酶1(caspase-1)依赖的程序性细胞死亡即细胞焦亡(pyroptosis)在放射性肺炎发病机制中的作用。方法 BALB/c小鼠胸腔15 Gy X线辐照5 d,处死小鼠。HE染色观察肺组织形态变化,原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测辐照后肺组织细胞凋亡情况,Western blot法检测肺组织γ组蛋白2AX(γ-H2AX)、抗原KI-67(ki67)、含pyrin结构域NOD样受体家族3(NLRP3)、caspase-1和含CARD结构域凋亡相关斑点样蛋白(ASC/TMS-1)的表达情况,实时荧光定量PCR检测肺组织白细胞介素6(IL-6)、IL-8、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、含pyrin结构域NOD样受体家族3(NLRP3)、caspase-1、白细胞介素1β(IL-1β)、IL-18的m RNA水平,采用免疫组织化学染色检测肺组织NLRP3、caspase-1和TMS1的表达情况,使用caspase-1活性检测试剂盒检测caspase-1活性;ELISA检测血清IL-1β和IL-18水平。结果辐照后小鼠肺泡壁毛细血管扩张充血,炎性细胞浸润,肺泡壁增厚;肺组织细胞TUNEL染色阳性指数升高,γ-H2AX和ki67的表达增强,提示细胞DNA遭到破坏且细胞增殖活性降低;肺组织细胞中IL-6、IL-8、TNF-α和MCP-1 m RNA水平增加;血清IL-1β和IL-18水平增加,肺组织NLRP3、caspase-1、ASC/TMS-1表达水平增加,caspase-1活性增强。结论辐照后,激活小鼠肺组织NLRP3炎性体诱导肺组织的细胞发生pyroptosis。

C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白6(CTRP6)介导庆大霉素所致大鼠急性肾损伤

目的探讨抗炎细胞因子C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白6(CTRP6)在庆大霉素所致急性肾损伤(AKI)中的作用。方法SD大鼠分为5组,对照组、模型组和3个实验组。模型组和实验组皮下注射庆大霉素400 mg/(kg·d),连续注射2 d,建立庆大霉素中毒性AKI动物模型;3个实验组大鼠在注射庆大霉素前2 d,分别给予(0.5、5、50)mg/kg的CTRP6腺病毒表达载体。苦味酸比色法检测肌酐(Cr)含量,紫外分光光度法检测血清尿素氮(BUN)含量,ELISA检测血清CTRP6的水平以及肾组织匀浆中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平。Western blot法检测肾脏组织中CTRP6、NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3(NLRP3)和caspase-1的表达。结果与对照组相比,模型组大鼠AKI指标血清BUN和Cr水平较对照组显著增高,炎症因子IL-1β和TNF-α的分泌量以及NLRP3和caspase-1蛋白表达水平也显著增加。与模型组相比,实验组大鼠血清BUN和Cr水平降低,IL-1β和TNF-α的分泌减少,NLRP3和caspase-1的表达水平下降。随着注射CTRP6腺病毒表达载体注射剂量的增加,抑制效果逐渐增强。结论 CTRP6以剂量依赖的方式减弱庆大霉素所致的大鼠急性肾功能损伤。

敲除PTEN改善心肌缺血再灌注大鼠心脏功能并抑制NLRP3介导的心肌细胞焦亡

目的通过敲除第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源蛋白(PTEN),探索其对大鼠心脏功能和含pyrin结构域NOD样受体家族3(NLRP3)介导的心肌细胞焦亡(pyroptosis)的影响。方法建立大鼠心肌缺血/再灌注(I/R)损伤大鼠模型,分为假手术组(野生型健康大鼠)、野生型I/R组(野生型大鼠进行心肌I/R处理)、敲除PTEN(PTEN KO)的I/R组(PTEN KO大鼠进行心肌I/R处理)。反转录PCR检测PTEN mRNA水平,HE染色观察心肌病理损伤;超声心动图仪检测心率(HR)和左心室壁厚度(LVWT)并通过BL-420F生物机能实验系统记录左心室收缩压(LVSP)、左室射血分数(LVEF)、缩短分数(FS);ELISA检测血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌红蛋白(Mb)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)的含量;Western blot法检测心脏组织NLRP3、ELAV样RNA结合蛋白1(ELAVL1)、胱天蛋白酶1(caspase-1)、白细胞介素1β(IL-1β)的蛋白表达,免疫组织化学染色法检测心肌组织中caspase-1的含量;原位末端转移酶标记技术(TUNEL)染色观察心肌组织的凋亡。结果与假手术组相比,野生型I/R组PTEN mRNA和蛋白水平显著增加,HR、LVSP、LVEF、FS和LVWT均显著降低,血清CK-MB、Mb、cTnI含量均显著升高,NLRP3、ELAVL1、caspase-1、IL-1β蛋白表达水平均显著升高,敲除PTEN后PTEN mRNA和蛋白水平显著降低。敲除PTEN心肌细胞病理损伤减轻,HR、LVSP、LVEF、FS和LVWT均显著升高,血清CK-MB、Mb、cTnI含量显著降低。NLRP3、ELAVL1、caspase-1、IL-1β蛋白水平均显著降低,凋亡心肌细胞数量显著减少。结论敲除PTEN减缓心肌病理损伤,抑制NLRP3介导的心肌细胞焦亡,表明敲除PTEN能减轻心肌I/R损伤。

SMYD3过表达对人肝内胆管癌细胞miR-124表达及细胞增殖的影响

目的:探讨肝内胆管癌细胞HCCC-9810中SET和MYND结构域含有蛋白3(SET and MYND domain-containing protein 3,SMYD3)过表达对miR-124表达及细胞增殖能力的影响。方法:瞬时转染SMYD3真核表达质粒后,Western blotting检测细胞中SMYD3蛋白水平的变化;qRT-PCR检测细胞中SMYD3 mRNA和miR-124表达;甲基化特异性PCR检测miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3基因启动子甲基化水平;CCK-8和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力。结果:以空白组为对照,肝内胆管癌细胞HCCC-9810在转染pEGFP-SMYD3质粒后,SMYD3蛋白及mRNA表达均显著上升(P<0.05),miR-124-1、miR-124-2和miR-124-3基因启动子甲基化显著增加(P<0.05),miR-124表达明显下降(P<0.05),细胞增殖能力显著提高(P<0.05)。结论:过表达SMYD3可引起miR-124基因启动子甲基化增加,导致胆管癌细胞中miR-124的表达下降,同时过表达SMYD3可增强细胞增殖能力。

NASH患者外周血单个核细胞TXNIP/NLRP3水平变化及其临床意义探讨

目的探讨非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者外周血单个核细胞(PBMCs)硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)/NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3(NLRP3)水平变化及其临床意义。方法2019年1月~2021年1月我院收治的150例NASH患者和同期体检的单纯性脂肪肝患者45例,取外周血分离PBMCs,并检测TXNIP/NLRP3 mRNA。对NASH患者行两次肝穿刺活检,将肝组织病变程度分为轻度、中度和重度及进展和无进展组。结果NASH患者血清ALT和AST水平分别为(72.2±6.9)U/L和(61.8±5.1)U/L,显著高于单纯性脂肪肝组【分别为(33.4±4.0)U/L和(31.3±3.1)U/L,P<0.05】;NASH组PBMCs TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA和TXNIP/NLRP3比值分别为(1.9±0.1)、(1.5±0.1)和(1.3±0.1),显著高于单纯性脂肪肝组【分别为(0.7±0.1)、(0.6±0.1)和(1.1±0.1),P<0.05】;33例重度NASH组PBMCs TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA和TXNIP/NLRP3比值分别为(2.4±0.2)、(1.9±0.2)和(1.6±0.1),显著高于49例轻度组【分别为(1.5±0.1)、(1.2±0.1)和(1.0±0.1),P<0.05】或68例中度组【分别为(2.0±0.2)、(1.5±0.1)和(1.4±0.1),P<0.05】;31例进展期NASH组PBMCs TXNIP mRNA、NLRP3 mRNA和TXNIP/NLRP3比值分别为(2.1±0.2)、(1.7±0.2)和(1.5±0.1),显著高于119例无进展组【分别为(1.8±0.1)、(1.4±0.1)和(1.2±0.1),P<0.05】。结论NASH患者PBMCs TXNIP/NLRP3基因水平显著升高,与肝功能损害程度明显存在某种关系。积极监测患者PBMCs这些基因的动态变化可能对评估病情和疾病转归有重要的意义,值得深入研究。

大黄素调控NLRP3/Caspase-1信号通路对实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠的免疫调节作用

目的分析大黄素调控含有pyrin结构域的蛋白3(NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)信号通路对实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)大鼠的免疫调节作用。方法选取SPF级6~8周龄SD大鼠60只,12只作为对照组,其余48只建立EAT模型,建模成功后剔除死亡大鼠,将剩余40只大鼠随机分为模型组、大黄素低剂量组、大黄素中剂量组、大黄素高剂量组各10只。建模成功后开始灌胃,对照组、模型组给予5 mg/kg生理盐水,大黄素低剂量组给予生理盐水+15 mg/kg大黄素,大黄素中剂量组给予生理盐水+75 mg/kg大黄素,大黄素高剂量组给予生理盐水+150 mg/kg大黄素。观察每组甲状腺球蛋白抗体(TgAb)、白细胞介素-4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)、CD3^(+)CD4^(+)、CD3^(+)CD8^(+)、NLRP3/Caspase-1信号通路蛋白表达量。结果与对照组相比,其他4组TgAb、IL-4、IFN-γ、CD3^(+)CD4^(+)、CD3^(+)CD8^(+)、NLRP3、ASC、Caspase-1水平较高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,大黄素低、中、高剂量组TgAb、IL-4、IFN-γ、CD3^(+)CD4^(+)、CD3^(+)CD8^(+)、NLRP3、ASC、Caspase-1水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);大黄素中剂量组TgAbIL-4、IFN-γ、CD3^(+)CD4^(+)、CD3^(+)CD8^(+)、NLRP3、ASC、Caspase-1水平低于大黄素低、高剂量组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论大黄素可调节EAT大鼠的免疫功能,并通过抑制CD4^(+)、CD8^(+)增殖使IL-4、IFN-γ分泌减少,其作用机制可能与NLRP3/Caspase-1通路有关。

青蒿琥酯通过抑制NLRP3炎性体激活和炎性细胞因子分泌减轻新生大鼠缺氧缺血性脑损伤

目的研究青蒿琥酯对新生大鼠缺血缺氧性脑损伤(HIBD)的保护作用及其作用机制。方法7日龄新生SD大鼠随机分为假手术组、模型组、5 mg/kg青蒿琥酯组、10 mg/kg青蒿琥酯组、20 mg/kg青蒿琥酯组、6 mg/kg地塞米松组,每组18只。除假手术组外,其余各组建立HIBD模型,假手术组只需分离左颈侧总动脉,不行结扎和氮氧混合气体通气处理。在手术后,各组立刻腹腔注射对应药物,假手术组和模型组大鼠注射等体积的生理盐水,之后每日一次,共给药5次。末次给药1 h后,对各组大鼠进行神经功能缺损评分,大鼠处死后检测脑含水量,观察大鼠海马CA1区脑组织病理学改变,原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测神经细胞凋亡情况,ELISA分别检测各组大鼠脑组织和外周血中白细胞介素1β(IL⁃1β)、IL⁃6、肿瘤坏死因子α(TNF⁃α)的水平,Western blot法检测各组大鼠海马CA1区脑组织含pyrin结构域核苷酸结合寡聚结构域样受体家族蛋白3(NLRP3)、含胱天蛋白酶募集结构域凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、胱天蛋白酶1(caspase⁃1)蛋白表达。结果与模型组比较,(10、20)mg/kg青蒿琥酯组和地塞米松组大鼠神经功能缺损评分下降,脑组织病理损伤减轻,脑含水量明显减少,海马神经元细胞凋亡数明显减少,脑组织和外周血中IL⁃1β、IL⁃6、TNF⁃α水平明显降低,NLRP3、ASC、caspase⁃1水平明显降低。结论青蒿琥酯能够改善HIBD新生大鼠的神经功能、缓解脑部损伤、减轻脑水肿,对HIBD起保护作用,这可能与抑制NLRP3炎性体激活,减少炎性细胞因子的分泌有关。