含溴结构域和ET域蛋白抑制剂对结肠癌细胞哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路和有氧糖酵解的影响

目的观察抑制含溴结构域和ET域(BET)蛋白能否影响结肠癌细胞的有氧糖酵解,并进一步探讨其影响机制是否通过下调哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路活性实现。方法选择人结肠癌RKO、LS174T、HCT116细胞株。实验分成DMSO组和JQ1组。DMSO组分别于RKO、LS174T、HCT116细胞株中加入溶媒DMSO处理,JQ1组分别于RKO、LS174T、HCT116细胞株中加入BET蛋白抑制剂JQ1(将1μmol/L JQ1溶于DMSO中)处理,每组每个细胞株设3个副孔。测定两组各细胞株的乳酸含量和计算糖耗量,通过细胞计数观察RKO细胞的增殖密度。为研究JQ1能否协同低糖环境发挥其效应,另取未经处理的HCT116细胞株加入低糖DMEM培养基(葡萄糖浓度6.1 mmol/L)中培养,进行细胞计数。采用Western印迹法测定mTOR下游蛋白表达情况。结果JQ1组RKO、LS174T、HCT116细胞株的乳酸含量和糖耗量均显著低于DMSO组同细胞株(P值均<0.01)。JQ1组RKO细胞株和LS174T细胞株的细胞计数均显著少于DMSO组(P值均<0.01)。高糖或低糖培养基中,JQ1组HCT116细胞株的细胞计数均显著少于DMSO组(P值均<0.05)。光学显微镜下见,JQ1组RKO细胞增殖密度明显减少。Western印迹法结果显示,JQ1组RKO细胞株mTOR下游蛋白(抗磷酸化的核糖体S6蛋白)、HCT116细胞株mTOR下游蛋白(抗磷酸化的核糖体S6蛋白、抗4E结合蛋白1、抗S6蛋白激酶1蛋白)表达的灰度值均显著低于DMSO组(P值分别<0.05、0.01)。结论抑制BET蛋白可能通过抑制mTOR通路影响结肠癌细胞有氧糖酵解,从而抑制结肠癌细胞增殖。

dBET1降解溴结构域蛋白4抑制α突触核蛋白寡聚体的神经毒性作用研究

目的探究用dBET1降解溴结构域蛋白4(BRD4)能否抑制α突触核蛋白(α-syn)寡聚体导致的神经炎症及氧化应激。方法dBET1与α-syn寡聚体共同处理BV2细胞或SH-SY5Y细胞,分为对照组、α-syn组、α-syn+500 nmol/L dBET1组,α-syn+1000nmol/L dBET1组,1000nmol/L dBET1组。定量聚合酶链反应检测炎性因子及抗炎因子,蛋白质免疫印迹检测BRD4、核因子E2相关因子2(Nrf2)、磷酸化核转录因子κB(p-NF-κB)及磷酸化α-syn(p-α-synuclein)等。结果α-syn+1000nmol/L dBET1组炎性因子mRNA、BRD4、p-NF-κB、p-α-synuclein表达低于α-syn组,而抗炎因子mRNA、细胞核Nrf2表达显著高于α-syn组[(2.02±0.14)vs(0.96±0.24),P<0.05]。结论dBET1通过p-NF-κB及Nrf2在一定程度上能抑制α-syn导致的神经炎症及氧化应激等,为进一步运用于治疗帕金森病等疾病提供理论基础。

含溴结构域蛋白4加重高糖诱导的内皮细胞损伤机制探讨

目的 探讨含溴结构域蛋白4(BRD4)对高糖诱导的血管内皮细胞损伤的作用及机制。方法 培养脐静脉内皮细胞(HUVECs),分为对照组、高糖刺激组(HG)、BRD4沉默组(BRD4 siRNA组)、BRD4沉默的HG组(BRD4 siRNA+HG组)。采用ELISA法检测各组炎症细胞因子水平,采用试剂盒检测细胞内活性氧(ROS)水平,采用试剂盒检测各组超氧化物歧化酶2(SOD2)和谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx)活性以及丙二醛(MDA)水平,采用一氧化氮(NO)检测试剂盒检测NO含量,采用免疫荧光染色检测核因子E2相关因子2(NRF2)的表达以及核转位情况。结果 对照组和BRD4 siRNA组细胞促炎症因子、ROS、MDA、NO水平、SOD2和Gpx活性、细胞活性、细胞凋亡数量、NRF2表达及核转位水平差异无统计学意义(P>0.05)。HG组及BRD4 siRNA+HG组细胞促炎症因子、ROS、MDA水平高于对照组,SOD2、Gpx、NO水平、细胞活性、NRF2表达以及核转位水平低于对照组,且BRD4 siRNA+HG组细胞促炎症因子、ROS、MDA水平低于HG组,SOD2、Gpx、NO水平、细胞活性、细胞NRF2表达以及核转位水平高于HG组(P<0.05)。HG组及BRD4 siRNA+HG组细胞凋亡数量多于对照组,与HG组相比,BRD4 siRNA+HG组细胞凋亡数量减少(P<0.05)。结论 BRD4通过抑制NRF2的核转位加重高糖诱导的内皮细胞损伤,BRD4可能参与糖尿病并发症的发生发展。

睾丸特异性含溴结构域的蛋白作为潜在男性抗生育药物靶标的研究进展

哺乳动物的四种含溴结构域蛋白(BET)基因在精子发生不同阶段均有表达,其中睾丸特异表达的bromodomain-containing protein(BRDT)对精子发生必不可少。BRDT在核染色质重组中起关键作用,也参与基因转录和共转录调节。BRDT的第一个溴结构域缺失导致圆形精子细胞错误伸长、精子形态严重缺陷,而圆形精子细胞的错误伸长与减数分裂之后染色质结构异常相关。另外,BRDT是形成圆形精子细胞染色质核仁所必需的;精母细胞和精子细胞缺乏全长的BRDT将会导致转录和可变剪接过程发生改变。动物实验证实一种小分子的BRDT抑制剂(JQ1),具有良好的抗生育作用,这为进一步开发可逆的男性抗生育药物开辟了新思路。

筛选人睾丸特异性含溴结构域蛋白(BRDT)的小分子抑制剂

目的睾丸特异性含溴结构域的蛋白(BRDT)在睾丸中特异表达,参与精子生成的染色质重组过程。本文虚拟筛选基于结构的人BRDT小分子抑制剂。方法从PDB(Protein Data Bank)下载BRDT核心结构域与小分子抑制剂JQ1结合结构域的晶体结构(PDB ID:4FLP),利用分子模拟软件Discovery Studio 3.0,构建了其活性位点抑制剂的药效团模型。运用最佳药效团模型对10 000个化合物的数据库进行初筛,随后运用Libdock分子对接方式对初筛得到的潜在目标化合物进行复筛;最后运用BRDT Bromodomain TR-FRET Assay方法,对虚拟筛选得到的化合物进行实物筛选。结果运用虚拟筛选和蛋白水平筛选相结合的方法,从40 000个化合物中最终得到1个对BRDT有较高抑制作用的小分子抑制剂T480。结论利用一种基于结构的集合虚拟筛选与蛋白水平筛选的BRDT抑制剂的高通量筛选方法,筛选到BRDT的一个小分子抑制剂。

凡纳滨对虾含溴结构域蛋白基因cDNA序列的克隆和表达特征

含溴结构域蛋白(bromodomain/BRD-containing protein, BCP)是一种高度保守的蛋白,属于含溴结构域和额外终端域(bromodomain and extraterminal, BET)蛋白超家族成员。该蛋白在有丝分裂过程中通过募集不同的染色体修饰蛋白,达到了广泛调控基因复制及转录的作用,其表达水平的变化常与肿瘤及炎症的发生相关联。本研究根据实验室前期转录组结果提示信息,首次获得了凡纳滨对虾2 229 bp的BCP基因cDNA序列(LvBRD, GenBank注册号:MH638256),利用在线软件进行了生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR (qPCR)技术分析了该基因的组织表达特征和其在对虾白斑综合征病毒(WSSV)、苏云金芽孢杆菌以及副溶血性弧菌侵染过程中的表达变化特征。结果显示,LvBRD编码的蛋白质有一个保守的可以参与细胞周期调控过程的溴结构域(bromodomain,BRD);组织表达分析表明该基因主要在凡纳滨对虾血细胞、肝胰腺和鳃组织中表达;在WSSV和病原菌感染后早期(0.5～12 hours past infection,hpi),Lv-BRD的表达可以被显著诱导,在血细胞中呈明显上调的表达趋势,表明该基因在一定程度上参与了对虾体内由病原引发的天然免疫应答反应。上述研究结果为进一步研究Lv-BRD基因在对虾抗病毒免疫及干扰素调控过程中的功能和作用机制奠定了基础。

溴结构域蛋白4在心血管疾病中的研究进展

溴结构域蛋白(bromodomain protein,BRD)4是溴结构域和额外终端域家族蛋白中的一员,因其在表观遗传学层面调控基因表达中起到重要作用而在癌症等研究领域受到广泛关注。本文对近年来BRD4在动脉粥样硬化、心肌梗死、心力衰竭和肺动脉高压等心血管疾病中的研究进展进行综述,为心血管疾病的研究提供新的认识和思考。

结直肠癌中含溴结构域蛋白9的亚细胞定位模式及其临床意义

目的探讨结直肠癌(colorectal cancer,CRC)中含溴结构域蛋白9(bromodomain containing 9,BRD9)的蛋白表达水平、亚细胞定位模式及其临床意义。方法收集CRC手术切除标本,采用免疫组织化学技术EnVision法检测BRD9的蛋白表达水平及其亚细胞定位,并分析其与患者临床病理特征及预后的关系。结果在508例CRC组织标本中,BRD9高表达患者为71.46%(363/508),BRD9细胞核阳性患者为80.31%(408/508);BRD9的表达与患者肿瘤大小(P=0.025)、淋巴结转移(P=0.004)、神经侵犯(P=0.043)、分化程度(P=0.017)及TNM分期(P=0.002)相关,BRD9的亚细胞定位与患者淋巴结转移(P=0.040)及TNM分期(P=0.026)相关,差异有统计学意义;BRD9高表达可作为患者的独立不良预后因素(HR=1.994,P=0.002),同时,在BRD9低表达患者中,BRD9细胞浆阳性可作为患者的独立不良预后因素(HR=8.056,P=0.001)。结论在CRC患者中BRD9的亚细胞定位模式具有异质性,其高表达及细胞浆定位与CRC的发生发展密切相关,并能够作为独立预测因子预测患者的生存预后。

含溴结构域蛋白4在心血管疾病发病机制中的研究进展

心血管疾病(cardiovascular diseases)一直以来都是我国乃至全球疾病负担的主要原因,其生存率低,发病率一直呈现上升趋势[1]。据推测,我国目前心血管疾病患者高达3亿,导致的死亡人数约占全国死亡人数的40%,有数据显示,我国每年因心血管疾病产生的费用高达1700亿元,给医疗卫生保健资源带来了极大的负担[2-3]。心血管疾病涉及冠心病、心律失常、高血压、心肌病和心力衰竭等,虽然临床表现存在差异,但在发病机制中仍有许多相似之处。溴结构域和额外终端域(bromodomain and extra-terminal domain,BET)家族蛋白是一种表观遗传调控蛋白,由含溴结构域蛋白2(bromodomain-containing protein 2,BRD2)、BRD3、BRD4和睾丸特异性含溴结构域蛋白(testis-specific bromodomain-containing protein,BRDT)组成[4]。

含溴结构域和额外终端域家族蛋白——表观遗传领域的新型治疗靶点

BET(bromodomain and extraterminal)是一类能解读表观遗传密码的蛋白,通过识别和结合乙酰化的组蛋白或非组蛋白,在调节基因转录中发挥重要的作用。BET抑制剂在肿瘤和炎症等临床前疾病模型中表现出良好的疗效,且已有部分抑制剂进入临床阶段,这表明以BET为治疗靶点的药物研发具有可观前景。本文将对BET蛋白的结构功能、BET抑制剂与疾病治疗以及其作为治疗靶点的分子机制等方面进行阐述。

含溴结构域蛋白2结构与功能的研究进展

含溴结构域蛋白2(bromodomain-containing protein 2,BRD2)具有两个串联的溴结构域和一个末端外结构域,是溴结构域和末端外结构域蛋白家族成员之一。BRD2蛋白能够特异性结合组蛋白乙酰化赖氨酸,参与基因的转录调控、染色质重塑和细胞增殖与凋亡等生物学活动。近年来研究表明,BRD2蛋白通过溴结构域和乙酰化组蛋白之间的表观遗传相互作用来调控基因转录和细胞周期、神经发育、炎症和脂肪生成,并且在肿瘤细胞增殖以及病毒感染和复制过程中也有着重要作用。该文主要从BRD2蛋白的结构特征、细胞功能和参与病毒复制的作用机制等方面进行综述,以期为深入研究BRD2蛋白的功能提供参考。

硼替佐米对伯基特淋巴瘤中microRNA-29b与含溴结合域蛋白4基因表达的影响

目的探讨硼替佐米对伯基特淋巴瘤(BL)中microRNA-29b(miR-29b)与含溴结合域蛋白4(BRD4)基因表达的影响。方法将RAJI细胞分为转染试剂组、转染阴性对照组、转染拟似组和转染阻遏组,分别用脂质体转染法转染试剂、miR-29b阴性对照物、miR-29b拟似物和miR-29b阻遏物转染24 h。取对数生长期RAJI细胞分为对照组和低、中、高浓度实验组。对照组给予不加任何药物的培养基;低、中、高浓度实验组分别予以10,20和50 nmol·L^-1硼替佐米20μL。4组细胞均培养24 h。C57BL/6小鼠接种RAJI细胞成瘤后,随机分为对照组和低、中、高浓度实验组。对照组给予0.9%NaCl;低、中、高浓度实验组分别给予10,20和50 nmol·L^-1硼替佐米。4组小鼠每次肿瘤内给药0.2 mL,隔日1次,共给药5次。用实时荧光聚合酶链反应法检测miR-29b和BRD4 mRNA表达,用噻唑蓝法检测细胞的增殖活性。结果在细胞转染实验中,转染miR-29b阻遏物降低miR-29b表达,升高BRD4 mRNA表达,促进细胞增殖,而转染miR-29b拟似物则升高miR-29b表达,降低BRD4 mRNA表达,抑制细胞增殖。在RAJI细胞增殖活性实验中,经硼替佐米处理后,RAJI细胞的miR-29b表达升高,BRD4表达降低,细胞增殖活性受到抑制。在小鼠荷瘤实验中,经硼替佐米处理后,肿瘤组织的miR-29b表达升高,BRD4 mRNA表达降低,肿瘤质量明显缩小。结论硼替佐米可通过调控miR-29b/BRD4的表达水平,从而发挥对BL的治疗作用。

乳头状甲状腺癌中microRNA-599、BRD4表达及与临床病理特征和预后的关系

目的研究乳头状甲状腺癌(PTC)中microRNA-599(miR-599)、含溴结合域蛋白(BRD4)表达及与临床病理特征和预后的关系。方法选取2005年5月-2007年3月云南省第一人民医院接受甲状腺手术的PTC患者52例。其中癌旁正常甲状腺组织41例,分离癌变组织和癌旁正常组织,分别检测组织中miR-599和BRD4的相对表达量,分析癌变组织中miR-599和BRD4表达与患者临床病理特征和预后的关系。结果 PTC患者癌变组织和癌旁正常组织中miR-599、BRD4的相对表达量差异有统计学意义(P <0.05);miR-599、BRD4相对表达量在不同TNM分期、肿瘤直径、肿瘤侵犯包膜、淋巴结转移患者中的差异有统计学意义(P <0.05);miR-599、BRD4高表达和低表达患者5及10年生存率差异有统计学意义(P <0.05);miR-599与BRD4的相对表达量呈负相关(r=-0.872,P=0.000)。结论 miR-599和BRD4与PTC发生、发展及预后密切相关,对临床诊断和治疗PTC及预测预后有重要意义。

鸡BRD2亚细胞定位及其组织表达特性分析

【目的】明确含溴结构域蛋白2(BRD2)的亚细胞定位及其表达特征,为后续研究BRD2基因调控鸡组织发育的作用机制提供参考依据。【方法】通过构建鸡BRD2基因重组真核表达载体pEGFP-BRD2,转染人胚胎肾细胞(HEK-293T)后检测重组蛋白EGFP-BRD2的表达情况及亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR分别检测鸡胚14胚龄(E14 d)、鸡出壳后1日龄(1 d)、7日龄(7 d)和14日龄(14 d)4个时间点各组织中BRD2基因的表达情况。【结果】重组真核表达载体pEGFP-C1-BRD2转染HEK-293T细胞获得的融合蛋白EGFP-BRD2约115.00 kD,且主要定位在细胞核。实时荧光定量PCR检测结果表明,鸡BRD2基因在E14 d和1 d肌胃中的相对表达量最高,在7和14 d肺脏中的相对表达量最高。BRD2基因在各组织的表达规律为:在眼球内E14 d到14 d的表达先下降后趋于稳定;在脑组织和心脏内的表达在E14 d至14 d间呈先下降后上升的变化趋势;在肝脏内E14 d表达稳定,1 d后开始逐渐增加,至14 d时达最高值;在肺脏中E14 d的表达下降,1 d后急剧上升,至14 d时达最高值;在肌胃和胸肌中,均在7 d时最高,1 d时最低,E14 d和14 d时有较高表达,整体上呈倒N表达模式;在腿肌中,从E14 d到1 d表达减少,而后略有增加,7 d后开始下降,至14 d时降到最低值。【结论】鸡BRD2基因重组真核表达载体能在HEK-293T细胞中正确表达,且融合蛋白主要定位在细胞核;BRD2基因在鸡不同发育阶段的各组织中均有表达,但其表达量呈现不同的变化趋势。

组蛋白乙酰转移酶p300/CBP抑制剂的研究进展

由高度同源的腺病毒E1A相关的300 kDa蛋白(p300)和环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)的结合蛋白(CBP)组成的p300/CBP家族是组蛋白乙酰转移酶(HAT)家族主要成员之一。p300/CBP参与细胞周期进展和细胞的生长、分化和发展,是一类非常重要的辅激活因子,可以调节多种关键转录调节因子的功能。p300/CBP与多种肿瘤疾病密切相关,是一个极具应用前景的肿瘤治疗靶标。综述p300/CBP抑制剂的研究进展,旨在为开发新型选择性p300/CBP抑制剂提供参考。

缺氧微环境下仙连解毒方抑制结直肠癌细胞增殖的作用及机制

目的:观察缺氧微环境下仙连解毒方对含溴结构域蛋白4(Brd4)诱导的核转录因子-κB(NF-κB)信号通路激活的影响,探讨其抑制结直肠癌细胞HT-29增殖的作用机制。方法:于缺氧培养箱或常氧培养箱中培养人结直肠癌细胞HT-29,给予仙连解毒方(0.8、1、1.2、1.6、3.2、6.4、12.8 g·L^(-1))干预细胞48 h,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力;采用线粒体膜电位荧光探针(JC-1)检测仙连解毒方(1.25、2.5、5 g·L^(-1))对细胞线粒体膜电位的影响,采用流式细胞术检测结直肠癌细胞HT-29凋亡情况;细胞克隆形成实验及5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EDU)法检测结直肠癌细胞HT-29细胞增殖能力;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Brd4及其下游蛋白如c-核蛋白类基因(c-Myc)、六亚甲基双乙酰胺诱导蛋白1(HEXIM1)的表达水平,同时检测仙连解毒方对NF-κB信号通路相关蛋白的影响。结果:与空白组比较,仙连解毒方(0.8、1、1.2、1.6、3.2、6.4、12.8 g·L^(-1))组均能抑制结直肠癌细胞HT-29细胞活力(P<0.05,P<0.01),且缺氧培养下细胞半数抑制浓度(IC_(50))>常氧培养组。与空白组比较,仙连解毒方(1.25、2.5、5 g·L^(-1))组细胞线粒体膜电位明显下降、细胞凋亡增多(P<0.05,P<0.01)。与空白组比较,仙连解毒方(1.25、2.5、5 g·L^(-1))组细胞克隆数减少,EDU阳性细胞数减少(P<0.05,P<0.01)。Western blot结果示,与空白组比较,仙连解毒方(1.25、2.5、5 g·L^(-1))组细胞内Brd4、c-Myc蛋白表达量均有不同程度的下降,HEXIM1表达升高(P<0.05,P<0.01);磷酸化(p)-NF-κB p65、磷酸化NF-κB抑制蛋白α(p-IκBα)蛋白表达下调(P<0.05,P<0.01)。结论:缺氧微环境下仙连解毒方可抑制Brd4调控的结直肠癌细胞HT-29增殖,抑制NF-κB信号通路的激活可能是其机制之一。

miR-599和BRD4在卵巢癌中的表达及其与临床病理参数和预后的关系

目的检测miR-599、含溴结构域蛋白4 (BRD4)在上皮性卵巢癌组织中的表达情况并探讨其与患者临床病理参数和预后的关系。方法收集2012年1月-2014年3月在该院行切除术的上皮性卵巢癌组织标本47例(卵巢癌组),收集同期良性卵巢上皮组织41例(良性对照组)和正常卵巢上皮组织34例(正常对照组)作为对照。采用实时荧光定量PCR (qRTPCR)检测miR-599和BRD4 mRNA表达情况;采用免疫组化法检测BRD4蛋白表达情况;分析miR-599和BRD4与卵巢癌患者临床病理参数及预后之间的关系。结果 miR-599 mRNA在卵巢癌组、良性对照组、正常对照组中的相对表达量逐渐降低,两两比较,差异均有统计学意义(均P<0. 05); BRD4 mRNA和蛋白相对表达量逐渐升高,两两比较,差异均有统计学意义(均P<0. 05)。miR-599、BRD4表达与卵巢癌患者年龄、是否绝经、组织类型、淋巴结转移情况无关(P>0. 05),与FIGO分期、组织分化有关(P<0. 05)。Spearman检验结果显示,卵巢癌组织中miR-599与BRD4表达负相关(r=-0. 631,P<0. 05)。miR-599低表达者3年存活率明显低于miR-599高表达者(41. 94%vs. 81. 25%,P<0. 05); BRD4阳性表达者3年存活率明显低于BRD4阴性表达者(34. 48%vs. 88. 89%,P<0. 05)。结论 miR-599在卵巢癌组织中明显低表达,BRD4显著高表达,二者与卵巢癌患者病理分化及术后生存率密切相关。

外泌体miR-608通过靶向BRD4促进食管鳞癌细胞的凋亡

目的:探索外泌体微小RNA-608通过靶向BRD4促进食管鳞癌细胞的凋亡。方法:从涟水县人民医院获得了60例食管鳞状细胞癌(ESCC)和邻近正常组织的患者。采用Norgen Biotek试剂盒提取血清外泌体,通过基因表达微阵列分析患者血清外泌体miRNA表达水平与总生存期(OS)之间的关联;通过生物信息学分析预测miR-608靶标;采用荧光实时定量PCR及蛋白质印迹的方法对miR-608及其靶标蛋白进行含量测定;通过双荧光素酶测定mi R-608及其靶标蛋白的结合程度。结果:高水平的miRNA-608表达与更长的OS时间相关(r=-0.874,P<0.05)。转染实验表明,BRD4的上调可能逆转了miRNA-608诱导的凋亡促进作用。结论:miRNA-608通过BRD4的负调控促进ESCC中的凋亡。本研究的结果提供了可改善ESCC患者预后预测的理论基础,也为开发个体化治疗和研究针对这些机制的新疗法提供了机会。