含硫氨基酸基因植物表达载体的构建及对百脉根的转化

在本研究中,用限制性内切酶NcoⅠ和BglⅡ从中间载体pMD18zeolin和pMD18zein上切下zeolin基因(约1600bp)和γ-zein基因(约720bp),将其定向连接在经相同酶切的质粒载体pCAMBIA1302上,构建成植物表达载体pCBzeolin和pCBzein。采用冻融法将pCBzeolin和pCBzein导入根癌农杆菌(Agrobac-terium tumefaciens)菌株LBA4404,利用该菌株转化百脉根(Lotus corniculatusL.)。经过共培养、筛选分化、再生,得到抗性植株。对抗性植株进行了PCR、RT-PCR检测表明,γ-zein和zeolin基因已经整合到百脉根基因组中,在核酸水平得到了表达。含硫氨基酸数据分析表明,转zeolin基因植株含硫氨基酸含量极显著高于转γ-zein基因植株和对照植株的含量(P<0.01),但转γ-zein基因植株与对照植株间差异不显著。

含硫氨基酸蛋白与GFP融合基因的表达分析

提高饲用植物中的含硫氨基酸水平已成为动物营养学家关注的焦点,含硫氨基酸对奶制品、肉类及羊毛产量有重要影响。γ-zein和zeolin(γ-zein和菜豆球蛋白的融合基因)编码2种含硫氨基酸蛋白基因,利用基因轰击法将质粒pCBzein、pCBzeolin和pCAMBIA1302分别转入洋葱(Alliumcepa L.)表皮细胞,激光共聚焦扫描显微结果表明γ-zein和zeolin在洋葱表皮细胞的细胞核、内质网及细胞壁中均有表达。采用冻融法分别将表达载体pCBzein、pCBzeolin和pCAMBIA1302导入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株LBA4404,利用该菌株转化烟草(Nicotianatabacum);在Hygromycin选择压力下获得烟草抗性不定芽和再生植株;激光共聚焦扫描显微结果表明γ-zein和zeolin蛋白以颗粒的形式不均匀地分布在烟草原生质体中,并验证表达载体pCBzein和pCBzeolin的选择基因、目的基因和报告基因均得到了表达,为进一步开展豆科牧草营养品质改良奠定了基础。