含PR结构域的锌指蛋白5特异性小干扰RNA载体构建及干扰效果评价

目的构建含PR结构域的锌指蛋白5(PRDM5)特异性小干扰RNA(siRNA)干扰载体并鉴定其干扰效果。方法根据小鼠PRDM5基因全长c DNA序列,设计合成6条siRNA干扰片段(si PRDM5-1、si PRDM5-2、si PRDM5-3、si PRDM5-4、si PRDM5-5和si PRDM5-6)和2条对照序列(si CTL-1和si CTL-2),并将前3条干扰片断和si CTL-1克隆插入p Silencer3.1-U6,另3条干扰片断和si CTL-2插入p Silencer4.1-CMV干扰载体中,构建小鼠PRDM5基因的siRNA真核表达载体si PRDM5-1、si PRDM5-2、si PRDM5-3、si PRDM5-4、si PRDM5-5和si PRDM5-6,2个对照序列si CTL-1和si CTL-2,并通过双酶切和测序进行验证,构建成功后转染小鼠黑色素瘤细胞B16F10并采用实时荧光定量聚合酶链反应和Western blot法检测其干扰效率。结果成功构建真核siRNA表达载体,并且所构建的6个干扰载体均可降低小鼠黑色素瘤细胞中PRDM5基因mRNA表达(P<0.05)。其中si PRDM5-2和si PRDM5-6载体干扰效果最好。结论成功筛选出PRDM5特异性siRNA载体,为之后研究锌指蛋白基因PRDM5在小鼠黑色素瘤转移过程中功能及分子机制打下基础。

含GATA锌指结构域1对结肠癌细胞迁移的影响

目的探讨含GATA锌指结构域1(GATAD1)对结肠癌细胞迁移的影响及其机制。方法采用限制性内切酶连接法构建GATAD1干扰质粒SiRNA-GATAD1(Si-GATAD1)。取培养的人正常结肠上皮细胞NCM460及结肠癌细胞Caco-2、HCT-116、HCT-8、HT-29、RKO,应用Western blot法检测细胞中GATAD1蛋白相对表达量,选择其中GATAD1表达水平相对较高的结肠癌细胞HCT-116、RKO用于转染GATAD1干扰质粒Si-GATAD1,另选择其中GATAD1表达水平最低的结肠癌细胞Caco-2用于转染过表达pMZ-GATAD1质粒。取HCT-116、RKO细胞随机分为阴性对照(NC)组和转染Si-GATAD1质粒组(Si-GATAD1组),取Caco-2细胞随机分为NC组、转染过表达pMZ-GATAD1质粒组(pMZ-GATAD1组),Si-GATAD1组HCT-116和RKO细胞分别转染Si-GATAD1质粒,pMZ-GATAD1组Caco-2细转染过表达pMZ-GATAD1质粒,同时将空载体pMZ-MO3质粒转染至NC组HCT-116、RKO和Caco-2细胞。采用细胞划痕实验检测各组细胞划痕愈合率;采用Western blot法检测各组细胞磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路相关蛋白PI3K、Akt、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、细胞周期蛋白-D1(cyclin D1)的相对表达量。结果结肠癌细胞HCT-8、HCT-116、RKO、HT-29、Caco-2中GATAD1蛋白相对表达量均显著高于人正常结肠上皮细胞NCM460(P<0.05);结肠癌HCT-116、RKO细胞中GATAD1蛋白相对表达量显著高于HCT-8、HCT-29和Caco-2细胞(P<0.05),结肠癌Caco-2细胞中GATAD1蛋白相对表达量显著低于结肠癌HCT-8、HCT-29细胞(P<0.05)。Si-GATAD1组HCT-116、RKO细胞中GATAD1蛋白相对表达量均显著低于NC组(P<0.05),pMZ-GATAD1组Caco-2细胞中GATAD1蛋白相对表达量显著高于NC组(P<0.05)。培养12、24 h,Si-GATAD1组HCT-116、RKO细胞的划痕愈合率均显著低于NC组(P<0.01);pMZ-GATAD1组Caco-2细胞的划痕愈合率均显著高于NC组(P<0.01)。Si-GATAD1组RKO、HCT-116细胞中PI3K、p-Akt、cyclin D1蛋白相对表达量均显著低于其NC组(P<0.05);pMZ-GATAD1组Caco-2细胞中PI3K、p-Akt、cyclin D1蛋白相对表达量均显著高于NC组(P<0.05);Si-GATAD1组RKO、HCT-116细胞及pMZ-GATAD1组Caco-2细胞中Akt蛋白相对表达量与NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论GATAD1高表达于结肠癌细胞中,且通过调控PI3K/Akt信号通路促进结肠癌细胞的迁移。

PR结构域蛋白5过表达对人急性髓系白血病细胞系U937迁移侵袭的影响及其机制

目的探讨PR结构域蛋白5(PRDM5)过表达对人急性髓系白血病(AML)细胞系U937迁移侵袭的影响及其机制。方法收集20例AML患者(AML组)和20例健康志愿者(正常组),采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测其骨髓样本中微小RNA(miR)-489-3p和PRDM5 mRNA表达水平。采用脂质体转染技术将人AML细胞系U937分为7组:pcDNA3.1组、pcDNA3.1-PRDM5组、shNC组、shPRDM5组、NC组、miR-489-3p mimics组和miR-489-3p+pcDNA3.1-PRDM5组,采用划痕实验和侵袭迁移小室(Transwell小室)法分别检测各组细胞的迁移和侵袭能力;采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测β-catenin和GSK3β蛋白表达水平。结果AML组受试者骨髓miR-489-3p表达水平低于正常组,PRDM5 mRNA表达水平高于正常组(P<0.05)。pcDNA3.1-PRDM5组和miR-489-3p+pcDNA3.1-PRDM5组PRDM5 mRNA、β-catenin表达水平、穿过基质胶膜的细胞数量及24 h内迁移率分别高于pcDNA3.1组、miR-489-3p mimics组,而GSK3β表达水平分别低于pcDNA3.1组、miR-489-3p mimics组(P<0.05)。shPRDM5组和miR-489-3p mimics组的PRDM5 mRNA、β-catenin表达水平、穿过基质胶膜的细胞数量及24 h内迁移率分别低于shNC组和NC组,而GSK3β蛋白表达水平分别高于shNC组和NC组(P<0.05)。结论miR-489-3p靶向PRDM5基因阻断Wnt/β-catenin信号通路,从而抑制人AML细胞系U937迁移侵袭。

NOD样受体家族含CARD结构域5在胃癌中的相互作用蛋白及其对胃癌的诊断价值

目的 探究NOD样受体家族含CARD结构域5(NLRC5)在胃癌中的相互作用蛋白,并明确其对胃癌的诊断价值。方法 采用癌症基因组图谱(TCGA)数据库探究NLRC5在胃癌组织和癌旁组织中的差异,结合STRING网站分析NLRC5的相互作用蛋白,通过基因表达综合(GEO)数据库验证TCGA数据库筛选出来的蛋白对胃癌的诊断价值。引用临床模型,验证筛选出来的蛋白在胃癌组织和癌旁组织中的表达情况,确定各蛋白间的相关性,通过受试者工作特征(ROC)曲线明确其对胃癌的诊断价值。结果 TCGA结果显示,胃癌组织中NLRC5表达水平明显高于癌旁组织(P﹤0.01)。蛋白-蛋白相互作用发现,核因子κB激酶复合物抑制剂组分(CHUK)、核因子κB激酶亚单位β的抑制剂(IKBKB)、三重基序蛋白25(TRIM25)与NLRC5均呈正相关。经过GEO数据库验证得到TRIM25、CHUK、IKBKB与NLRC5可以构建联合模型诊断胃癌。临床模型中NLRC5在胃癌组织中高表达,且与TRIM25、IKBKB、CHUK表达水平均呈正相关(P﹤0.01)。NLRC5联合TRIM25、IKBKB、CHUK对胃癌有较高的诊断价值。结论 TRIM25、IKBKB、CHUK参与NLRC5在胃癌发展中的相关调控机制,在胃癌诊断中具有较高的效能。

含锌指和BTB结构域7B(ZBTB7B/ThPOK)及其相关因子在T细胞分化及功能中的作用

含锌指和BTB结构域7B(ZBTB7B/ThPOK)是CD4谱系分化中的关键转录因子,并抑制CD8谱系生成。ThPOK蛋白表达促进CD4谱系分化,维持CD4谱系稳定性,并抑制CD8谱系分化。首先在胸腺内,ThPOK基因表达受T细胞受体(TCR)信号、基因增强子、基因沉默子等调节,且ThPOK表达受GATA结合蛋白3(GATA3)、Runt相关转录因子3(Runx3)、白血病/淋巴瘤相关因子(LRF)、胸腺细胞选择相关性高迁移率族盒基因(TOX)、Myc关联的锌指蛋白相关因子(MAZR)、E1A结合蛋白p300(P300)等转录因子影响,进而影响CD4、CD8谱系分化。而在外周T细胞中,ThPOK影响CD_4^+T细胞亚群、CD_8^+T细胞分化及功能。在此基础上,正逐步展开针对外周疾病中ThPOK作用的研究。

PRDM家族蛋白结构与功能研究进展

PRDM家族蛋白是具有一个PR结构域和数量不等锌指结构(除了PRDM11),广泛存在于灵长类、啮齿动物、鸟类和两栖动物中能够调控表观遗传的蛋白。部分PRDM蛋白家族成员的PR结构域具有组蛋白赖氨酸转移酶活性(HMT),影响表观遗传,PRDM蛋白锌指结构具有DNA、RNA、蛋白识别结合能力;另一部分PRDM家族成员虽然具有PR结构域,但不具有HMT活性,在癌症发生、原始生殖细胞特化、神经系统发育、造血、血管发展、胚胎发育中发挥重要作用。PRDM家族蛋白通过甲基转移或募集染色体结构重塑复合物,调控基因表达和修改染色体结构,在细胞特化和疾病调控中起到重要作用。论文综述了PRDM家族蛋白结构与功能最新研究进展。

miR-592靶向调控PRDM5影响肾细胞癌侵袭转移及自噬的机制研究

目的探究miR-592靶向调控PR结构域锌指蛋白5(PR domain zinc finger protein 5,PRDM5)影响肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)侵袭转移及自噬的机制。方法RT-qPCR、蛋白质印迹检测RCC组织和细胞中miR-592、PRDM5 mRNA和蛋白水平。A498、786-O细胞分为anti-miR-NC组、anti-miR-592组、anti-miR-592+si-NC组、anti-miR-592+si-PRDM5组。RNA免疫共沉淀(RIP)检测miR-592和PRDM5的结合;CCK-8、Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力;透射电镜观察自噬小体形成;蛋白质印迹检测细胞PRDM5、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、Beclin1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ/Ⅰ水平。建立移植瘤裸鼠模型,分析敲低miR-592表达对移植瘤生长的影响。结果RCC组织和细胞中PRDM5 mRNA和蛋白水平降低,miR-592水平增加(P<0.05)。敲低miR-592表达后,细胞A_(450 nm)、迁移和侵袭细胞数、MMP-2、MMP-9水平降低,自噬小体数量、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ水平增加(P<0.05)。敲低PRDM5表达能部分逆转敲低miR-592对细胞增殖、侵袭及自噬的影响(P<0.05)。敲低miR-592表达能够抑制裸鼠移植瘤生长(P<0.05)。结论miR-592通过靶向抑制PRDM5表达,促进RCC细胞增殖、侵袭转移能力,并抑制自噬能力。

5-aza-2dC对乳腺癌细胞增殖及PRDM2和PRDM5甲基化的影响

目的探讨5-氮-2'脱氧胞苷(5-aza-2dC)对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响和对PR区锌指蛋白2(PRDM2)、锌指蛋白5(PRDM5)甲基化及表达水平的影响。方法培养人乳腺癌MDA-MB-231细胞,分别采用0(对照组)、1、2.5、5、10μmol/L 5-aza-2dC作用1、2、3、4、5 d后,采用MTT法检测细胞生长情况,MSP检测PRDM2和PRDM5甲基化水平,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western-blot检测PRDM2和PRDM5 mRNA和蛋白表达水平。结果 5-aza-2dC作用后,MDA-MB-231细胞增殖能力显著低于对照组(P <0.05),且随着5-aza-2dC浓度增加,抑制作用逐渐增强,作用5 d时,抑制作用最强;5-aza-2dC作用5 d后,与对照组比较,5-aza-2dC处理组细胞PRDM2和PRDM5甲基化水平均显著降低,mRNA和蛋白相对表达水平均显著增高,呈一定浓度依赖性。结论 5-aza-2dC可浓度依赖地抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的能力,降低细胞中PRDM2和PRDM5甲基化水平,促进PRDM2和PRDM5表达。

子宫内膜癌患者NLRC5与自噬蛋白表达的相关性及其临床意义

目的 分析子宫内膜癌患者NLR家族含CARD结构域5(NLRC5)表达与自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达的相关性,并探讨NLRC5、Beclin1、LC3与子宫内膜癌预后的相关性。方法 采集2020年1月-2022年1月安徽医科大学第二附属医院90例子宫内膜癌患者癌组织作为子宫内膜癌组,另取90例正常子宫内膜作为子宫内膜组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定两组NLRC5、Beclin1、LC3 mRNA的表达。子宫内膜癌组患者术后接受12个月的随访,按照实体瘤疗效标准分为预后良好组(72例)与预后不良组(18例);比较两组NLRC5、Beclin1、LC3 mRNA的表达,采用多因素一般Logistic回归模型分析影响子宫内膜癌预后的因素,绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析NLRC5、Beclin1、LC3对子宫内膜癌患者患者预后的预测价值。结果 子宫内膜癌组与正常子宫内膜组NLRC5、Beclin1和LC3 mRNA相对表达量的比较,差异均有统计学意义(P <0.05);子宫内膜癌组NLRC5 mRNA相对表达量较正常子宫内膜组低,Beclin1和LC3 mRNA相对表达量较正常子宫内膜组高。NLRC5与Beclin1(r=-0.565,P <0.05)、LC3(r=-0.421,P <0.05)呈负相关;Beclin1与LC3呈正相关(r=0.462,P <0.05)。预后良好、预后不良组的年龄、体质量指数、脉管浸润、肿瘤直径比较,差异均无统计学意义(P>0.05);预后不良组FIGO分期、宫体肌层深肌层占比、淋巴结转移、Beclin1、LC3 mRNA相对表达量高于预后良好组,NLRC5 mRNA相对表达量低于预后良好组(P <0.05);FIGO分期Ⅱ、Ⅲ期[OR=3.760(95%CI:1.260,11.223)]、宫体肌层深肌层[OR=26.800(95%CI:7.043,101.984)]、有淋巴结转移[OR=11.324(95%CI:3.286,39.019)]及Beclin1 [OR=68.163(95%CI:2.537,1831.270)]、LC3高表达[OR=26.468(95%CI:1.444,485.127)]均是子宫内膜癌预后的危险因素(P <0.05);NLRC5高表达达[OR=0.001(95%CI:0.000,0.079)]为保护因素(P <0.05);ROC曲线分析结果显示,NLRC5敏感性为82.8%(95%CI:0.784,0.923)、特异性为73.9%(95%CI:0.670,0.938);Beclin1敏感性为56.8%(95%CI:0.638,0.853)、特异性为77.8%(95%CI:0.644,0.877);LC3敏感性为57.3(95%CI:0.680,0.815)、特异性为72.2%(95%CI:0.693,0.824);联合敏感性为94.4%(95%CI:0.824,0.971)、特异性为62.5%(95%CI:0.593,0.778)。结论 子宫内膜癌患者NLRC5呈低水平表达,NLRC5与自噬相关蛋白Beclin1、LC3呈负相关,3者联合检测可提高子宫内膜癌患者的预后预测价值。

敲除组蛋白甲基转移酶PR结构域锌指蛋白9抑制牙周膜干细胞成骨向分化

目的研究组蛋白甲基转移酶PR结构域锌指蛋白9(PR domain zinc finger protein 9,PRDM9)对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cell,PDLSC)成骨向分化的影响.方法将与PRDM9序列互补的短发夹RNA亚克隆到含有绿荧光蛋白的慢病毒载体中,利用重组慢病毒敲除PDLSC中的PRDM9基因,形成敲除组(简称PRDMsh组),转染空载体sh RNA作为对照组;应用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)检测PRDM9基因的敲除效率;通过碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性测定、茜素红染色和钙离子定量分析检测敲除组PRDM9sh与对照组细胞成骨能力的差异;通过实时定量RT-PCR及蛋白免疫印迹实验检测敲除组PRDM9sh和对照组成骨分化指标骨钙蛋白在mRNA水平及蛋白水平的表达差异;通过裸鼠皮下移植物HE染色比较敲除组PRDM9sh及对照组体内成骨能力,计算新成骨组织面积百分比并进行统计学分析.结果实时定量RT-PCR结果显示,敲除组PRDM9sh中PRDM9基因的相对表达量(0.460±0.017)显著低于对照组(1.000±0.107)(P<0.05);成骨诱导5d后,敲除组PRDM9sh的ALP活性(0.762±0.063)显著低于对照组(1.225±0.058)(P<0.01);成骨诱导2、3周后,茜素红染色结果显示,与对照组相比敲除组PRDM9sh染色明显变浅;成骨诱导2、3周后,敲除组PRDM9sh钙离子含量[分别为(0.071±0.004)、(0.075±0.001)]较对照组[分别为(0.282±0.006)、(0.485±0.004)]显著降低(P<0.01);RT-PCR结果显示成骨2周时,敲除组PRDM9sh骨钙蛋白mRNA水平的相对表达量(1.059±0.148)显著低于对照组(2.542±0.190)(P<0.01);蛋白质印迹法结果显示成骨诱导1、2周时,敲除组PRDM9sh骨钙蛋白的蛋白水平表达明显弱于对照组;裸鼠皮下移植物HE染色及计算新成骨组织面积百分比结果显示敲除组PRDM9sh新成骨组织面积百分比[(3.8±2.41)%]较对照组[(24.54±7.06)%]显著降低(P<0.05).结论敲除PRDM9基因可以抑制牙周膜干细胞的体内外成骨分化功能.

5-苯基-1,3,4-噻二唑衍生物的合成及含SH2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP1)抑制活性研究

作为细胞信号转导通路的关键节点分子,含SH2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP1)是潜在的抗肿瘤靶点.已知的SHP1抑制剂屈指可数.设计并合成了11个5-苯基-1,3,4-噻二唑衍生物.活性测试结果表明,部分衍生物对SHP1显示了一定强度的抑制活性.其中,化合物5b[IC50=(1.33±0.16)μmol/L]对SHP1显示了中等强度的抑制活性,对PTP1B和TCPTP不显示抑制活性,对SHP2显示了2倍的选择性,为发现新型SHP1抑制剂提供了新的骨架类型.

植物同源结构域锌指蛋白5A在肝细胞癌中的表达及其临床意义

目的基于生物信息学方法分析植物同源结构域锌指蛋白5A(PHF5A)在肝细胞癌(肝癌)中的表达及临床意义。方法肿瘤免疫估计资源(TIMER)、UALCAN及临床蛋白质组学肿瘤分析联盟(CPTAC)数据库分析PHF5A在肝癌中的表达。UALCAN数据库分析PHF5A表达与肝癌临床病理学特征的相关性,并利用癌症基因组图谱(TCGA)肝癌数据进行二元Logistics回归验证。基因表达谱交互分析(GEPIA)、Kaplan-Meier Plotter数据库分析PHF5A表达与肝癌患者预后的相关性,通过Cox回归模型评估PHF5A的预后价值并构建列线图预测患者的预后。LinkedOmics数据库分析肝癌中PHF5A的共表达基因,并进行基因本体(GO)及京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析,预测其生物学功能。基因集富集分析(GSEA)探讨PHF5A在肝癌中作用的机制。通过STRING数据库进一步构建PHF5A的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络。单样本基因集富集分析(ssGSEA)研究PHF5A表达与肿瘤免疫浸润的关系,TIMER数据库分析PHF5A与免疫检查点基因的相关性。两组PHF5A表达比较采用t检验或秩和检验,生存分析采用Kaplan-Meier法及Log-rank检验,采用Cox比例风险回归模型确定PHF5A对预后的价值。结果UALCAN数据库显示肝癌组织中PHF5A mRNA表达水平升高[癌比癌旁为23.761(18.367,30.691)比12.462(10.650,14.983),P<0.001]。CPTAC数据库进一步验证,肝癌中PHF5A蛋白表达量亦显著高于癌旁[0.006(-0.680,0.577)比-1.990(-2.582,-1.477),P<0.001]。PHF5A与肝癌患者临床分期(Ⅰ期比Ⅲ期)、组织学分级(G1比G3,G1比G4,G2比G3)显著正相关(P<0.05);Logistics回归分析显示,PHF5A与临床分期、组织学分级、T分期以及甲胎蛋白(AFP)水平显著相关[比值比(OR)=1.426、2.279、1.409、2.335,P<0.05]。GEPIA数据库显示PHF5A高表达组总生存期(OS)及无病生存期(DFS)更短[风险比(HR)=1.700,1.400,P<0.05];Kaplan-Meier Plotter数据库显示PHF5A高表达组OS、无进展生存期(PFS)、无复发生存期(RFS)、疾病特异性生存期(DSS)更短(HR=1.720、1.480、1.460、2.280,P<0.05)。多因素Cox分析结果显示,PHF5A是肝癌患者OS及PFS较短的独立危险因素(HR=1.928、2.272,P<0.01)。GO、KEGG富集分析结果显示PHF5A与RNA的剪接及加工、细胞周期、细胞分裂、正调控转录等显著相关(P<0.05)。GSEA富集分析结果显示PHF5A基因显著富集于剪接体、RNA降解、G2M检查点、细胞周期等信号通路(P<0.001)。ssGSEA分析表明PHF5A表达与肝癌组织中包括辅助型T细胞2、浆细胞样树突状细胞、细胞毒性细胞在内的多种免疫细胞浸润相关[相关系数(cor)=0.367,-0.278,-0.289,P<0.001]。PHF5A表达与常见的免疫检查点分子标志物PD1、PDL1、CTLA4、LAG3显著正相关(cor=0.246、0.267、0.273、0.168,P<0.01)。结论PHF5A在肝癌中高表达并提示预后不良,可能与异常的选择性剪接及抑制性免疫微环境相关。

Circ_HECTD1调节miR-135a-5p/TP53INP1轴对OGD/R诱导的海马神经元损伤的影响

目的通过进行体外氧葡萄糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导海马神经元损伤,观察环状RNA含HECT结构域的E3泛素连接酶1(Circ_HECTD1)对HT22细胞增殖、凋亡的影响以及对微小RNA-135a-5p(miR-135a-5p)/肿瘤蛋白53诱导型核蛋白1(TP53INP1)轴的调控机制。方法常规培养HT22细胞,将细胞分为Con组、OGD/R组、si-NC组、si-Circ_HECTD1组、miR-NC组、miR-135a-5p组、si-Circ_HECTD1+anti-miR-NC组、si-Circ_HECTD1+anti-miR-135a-5p组。qRT-PCR法检测Circ_HECTD1、miR-135a-5p、TP53INP1 mRNA表达;MTT检测细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因实验验证Circ_HECTD1与miR-135a-5p、miR-135a-5p与TP53INP1的靶向关系;Western blot法检测Bax、Bcl-2、TP53INP1蛋白表达。结果OGD/R诱导后HT22细胞中Circ_HECTD1与TP53INP1表达上调,miR-135a-5p表达下调,细胞存活率和Bcl-2蛋白表达显著下降,凋亡率和Bax蛋白表达显著升高(均P<0.05)。沉默Circ_HECTD1表达能够显著上调OGD/R诱导的HT22细胞中miR-135a-5p表达,下调TP53INP1表达,提高细胞存活率和Bcl-2蛋白表达,降低细胞凋亡率和Bax蛋白表达(均P<0.05)。Circ_HECTD1与miR-135a-5p、miR-135a-5p与TP53INP1之间均存在靶向关系。过表达miR-135a-5p能够显著下调TP53INP1表达,提高细胞存活率、Bcl-2蛋白表达,降低细胞凋亡率、Bax蛋白表达(均P<0.05)。而抑制miR-135a-5p表达能够部分逆转沉默Circ_HECTD1对HT22细胞损伤的保护作用。结论沉默Circ_HECTD1可通过调节miR-135a-5p/TP53INP1轴,促进细胞存活,抑制细胞凋亡,保护OGD/R诱导的海马神经元损伤。

MiR-223-3p通过靶向SORBS1增加结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性

目的:5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的一线治疗药物,CRC细胞对5-FU的耐药是导致化学治疗(以下简称“化疗”)失败的主要原因,然而耐药机制仍不明确。本研究旨在探究参与CRC细胞对5-FU耐药的抑癌基因,并寻找对该基因存在调控作用的微RNA(microRNA,miRNA)。方法:在高通量基因表达(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库中下载CRC数据集GSE28702和GSE69657,分别分析2个数据集中对FOLFOX化疗方案应答组和无应答组患者的差异表达基因并确定目标基因;采用在线生物信息学数据库TargetScan、miRwalk和miRDB预测靶向目标基因含山梨醇和SH3结构域蛋白1(sorbin and SH3 domain containing 1,SORBS1)的miRNA。采用瞬时转染技术在CRC细胞系HCT116、SW620中分别转染siSORBS1、HA-SORBS1、miR-223-3p mimic、anti-miR-223-3p及其相应的阴性对照(siNC、HA、miR-NC、anti-miR-NC),在HCT116细胞中共转染miR-NC和HA、miR-223-3p mimic和HA、miR-223-3p mimic和HA-SORBS1、anti-miR-NC和siNC、anti-miR-223-3p和siNC、anti-miR-223-3p和siSORBS1。采用实时反转录PCR(real-time reverse transcription PCR,real-time RT-PCR)和/或蛋白质印迹法检测细胞中SORBS1和miR-223-3p的表达水平。转染后用不同浓度的5-FU处理细胞。采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞活力,双荧光素酶报告分析验证miR-223-3p与SORBS1的靶向关系。结果:GSE69657数据集和GSE28702数据集应答组分别有409和528个高表达基因,共有22个高表达交集基因。在22个高表达交集基因中,与CRC化疗敏感性有关的抑癌基因有3个,选择SORBS1作为目标基因进一步探索。3个在线生物信息学数据库预测的靶向SORBS1的miRNA为miR-223-3p。用5-FU(25μmol/L)处理HCT116、SW620细胞12~36 h后,2种细胞中miR-223-3p的表达水平均显著下调(均P<0.05)。转染siSORBS1或miR-223-3p mimic后,HCT116、SW620细胞中SORBS1表达水平均下调,细胞活力均增加(均P<0.05);转染HA-SORBS1或antimiR-223-3p后,HCT116、SW620细胞中SORBS1表达水平均上调,细胞活力均下降(均P<0.05)。双荧光素酶报告分析结果显示:共转染SORBS13'-非翻译区(untranslated region,UTR)野生型质粒和miR-223-3p mimic的细胞荧光素酶活性显著低于共转染SORBS13'-UTR野生型质粒和miR-NC的细胞(P<0.05)。与共转染miR-223-3p mimic和HA的细胞比较,共转染miR-223-3p mimic和HA-SORBS1的细胞活力明显降低(P<0.01);与共转染anti-miR-223-3p和siNC组比较,共转染anti-miR-223-3p和siSORBS1组细胞活力明显增加(P<0.05)。结论:MiR-223-3p通过靶向SORBS1基因增加CRC细胞对5-FU的耐药性,miR-223-3p有望成为临床治疗CRC的新靶点。

EPO对高脂喂养小鼠棕色脂肪组织PRDM16、FGF21表达及STAT3磷酸化水平的影响

目的:探索促红细胞生成素(EPO)对高脂饲料(HFD)喂养小鼠血糖和血浆胰岛素水平、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、糖耐量,以及棕色脂肪组织中含PR结构域蛋白16(PRDM16)、信号转导与转录激活因子3(STAT3)磷酸化水平(p-STAT3/STAT3)、成纤维细胞生长因子21(FGF21) mRNA以及蛋白质表达的影响,为肥胖及其并发症的发生机制提供线索。方法:20只高脂饲料喂养的C57BL/6J雄性小鼠随机分为对照组(HFD-Con)和EPO组(HFD-EPO),两组分别腹腔注射生理盐水和EPO(200 IU/kg),每周3次,连续4周。4周后检测两组动物的体重、血糖与血浆胰岛素水平、HOMA-IR及糖耐量的变化;分别使用实时定量PCR法和Western blot法检测棕色脂肪组织中PRDM16、STAT3、FGF21 mRNA和蛋白质水平。结果:腹腔注射EPO 4周后,HFD-EPO组小鼠体重为(26.65±0.85) g,HFD-Con组体重为(31.50±1.60) g,P<0.01。HFD-Con组血糖为(91.06±9.86) mg/dl,HFD-EPO组为(62.79±8.09) mg/dl,P<0.01; HFD-EPO组小鼠血浆胰岛素水平为(10.56±1.06)μU/ml,HFD-Con组为(13.2±1.1)μU/ml,P<0.01。与HFD-Con组比较,HFD-EPO组的糖耐量水平显著改善,胰岛素抵抗指数下降; HFD-EPO组动物棕色脂肪组织中PRDM16、FGF21mRNA以及蛋白质表达,p-STAT/STAT3水平均显著增加,两组小鼠肝脏中FGF21 mRNA含量、血浆中FGF21含量无明显差异。结论:EPO可能通过增加棕色脂肪组织中PRDM16表达促进棕色脂肪组织的分化,降低高脂喂养小鼠的血糖水平、改善高脂喂养小鼠的糖代谢状态。

微小RNA-146a-5p对肝癌细胞侵袭迁移和ZBTB2表达的影响

目的探讨微小RNA-146a-5p(miR-146a-5p)对肝癌细胞侵袭、迁移和含锌指和BTB结构域2(ZBTB2)表达的影响。方法采用实时定量PCR(QPCR)检测人正常肝细胞LO2和肝癌细胞SMMC-7721的miR-146a-5p水平;体外常规培养SMMC-7721细胞进行转染,根据转染物不同分为增强转染组(转染miR-146a-5p mimics)、抑制转染组(转染miR-146a-5p inhibitor)和空白转染组(转染脂质体)。采用实时定量PCR(QPCR)、四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法、Transwell细胞迁移和侵袭实验以及Western blotting检测miR-146a-5p水平、增殖活力、穿膜细胞数和ZBTB2水平;将含ZBTB2基因3’端非翻译区(3’UTR)特定种子序列克隆至荧光素酶报告质粒psiCHECK-2并通过双荧光素酶报告基因系统验证miR-146a-5p与ZBTB2的靶向关系。结果 SMMC-7721细胞的miR-146a-5p水平为0.156±0.047,低于LO2细胞的1.157±0.413(P<0.05)。与空白转染组的1.241±0.375相比,增强转染组的miR-146a-5p水平升高至8.159±1.274,而抑制转染组则降低至0.219±0.036;与空白转染组相比,增强转染组转染48、72 h后的增殖活力降低,而抑制组则升高;细胞侵袭实验中,与空白转染组的(22.069±3.152)个相比,增强转染组的穿膜细胞数降低至(11.847±2.031)个,而抑制转染组则升高至(69.540±4.257)个;细胞迁移实验中,与空白转染组的(47.338±5.067)个相比,增强转染组的穿膜细胞数降低至(29.640±3.652)个,而抑制转染组则升高至(136.426±18.469)个;与对照组的0.564±0.089相比,增强转染组的ZBTB2水平降低至0.168±0.023,而抑制组则升高至0.826±0.157;以上组间差异均有统计学意义(P<0.05)。经miR-146a-5p mimics处理后,转染野生型ZBTB2 3’UTR质粒细胞的相对荧光强度低于转染突变型质粒(P<0.05)。结论 miR-146a-5p在肝癌细胞中低表达并发挥抑癌作用,该miRNA可能通过靶向ZBTB2来抑制迁移侵袭能力,在肝癌靶向治疗中有一定应用前景。

miR-17-5p通过靶向SETD2调控骨髓增生异常综合征SKM-1细胞的增殖与凋亡

目的:探讨miR-17-5p和含SET结构域蛋白2(SETD2)对骨髓增生异常综合征(MDS)SKM-1细胞增殖与凋亡的影响及其作用机制。方法:收集2019年3月至2021年5月衡水市人民医院就诊的35例MDS患者的骨髓标本(MDS组)、35例健康体检者的骨髓标本(对照组),以及MDS细胞系SKM-1。用qPCR法检测MDS骨髓和SKM-1细胞中miR-17-5p、SETD2 mRNA的表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证miR-17-5p与SETD2的靶向关系。利用脂质体转染技术,分别将si-miR-NC、si-miR-17-5p、miR-NC、miR-17-5p mimic、pcDNA、pcDNA-SETD2、si-miR-17-5p+si-NC、si-miR-17-5p+si-SETD2等转染至SKM-1细胞,CCK-8法、流式细胞术检测细胞的增殖和凋亡水平,WB法检测细胞中SETD2、C-caspase-3、C-caspase-9的表达。结果:与对照组相比,MDS组骨髓中miR-17-5p表达水平显著升高、SETD2的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(均P<0.01)。与si-miR-NC组相比,si-miR-17-5p组SKM-1细胞增殖能力显著降低、凋亡率显著升高,细胞中C-caspase-3和C-caspase-9表达显著升高(均P<0.01)。miR-17-5p明显抑制野生型SETD2细胞的荧光素酶活性(P<0.01),并负向调控SETD2的表达。过表达SETD2可显著抑制SKM-1细胞的增殖并促进细胞凋亡,同时干扰SETD2表达则可部分逆转干扰miR-17-5p对SKM-1细胞的增殖抑制和凋亡促进作用。结论:MDS骨髓中miR-17-5p呈高表达,干扰miR-17-5p可抑制SKM-1细胞增殖并促进细胞凋亡,其机制与miR-17-5p靶向负调控SETD2的表达有关。

lncRNA TTN-AS1调控miR-134-5p/MBTD1信号轴促进骨肉瘤的生长和转移

目的探究长链非编码RNA(lncRNA)TTN-AS1对骨肉瘤生长和转移的影响及机制。方法采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测TTN-AS1在hFoB1.19、U2-OS、MG-63、SOSP-9607、SAOS2细胞中的表达水平,将其中TTN-AS1表达水平最高的SAOS2细胞分为Control组(未转染)、si-NC组[转染TTN-AS1小干扰RNA(siRNA)阴性对照]、si-TTN-AS1组(转染TTN-AS1 siRNA)、si-TTN-AS1+微小RNA(miR)-134-5p inhibitor组(共转染TTN-AS1 siRNA和miR-134-5p inhibitor)、si-TTN-AS1+含MBT结构域蛋白1(MBTD1)组(共转染TTN-AS1 siRNA和MBTD1质粒)。采用CCK8法检测细胞的增殖能力,Transwell小室法检测细胞的迁移和侵袭能力,双荧光素酶报告基因实验验证TTN-AS1与miR-134-5p的靶向关系以及miR-134-5p与MBTD1的靶向关系。结果TTN-AS1在U2-OS、MG-63、SOSP-9607、SAOS2细胞中的表达水平明显高于hFoB1.19细胞(P<0.05)。si-TTN-AS1组细胞增殖、迁移和侵袭能力均明显低于si-NC组(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验证实,miR-134-5p为TTN-AS1的靶基因,MBTD1为miR-134-5p的靶基因。si-TTN-AS1+miR-134-5p inhibitor组和si-TTN-AS1+MBTD1组细胞增殖、迁移和侵袭能力均明显强于si-TTN-AS1组(P<0.05)。结论抑制TTN-AS1的表达可抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,其机制为TTN-AS1调控miR-134-5p/MBTD1信号轴。

FNDC5基因过表达或沉默对动脉粥样硬化斑块形成中焦亡相关因子的影响及机制研究

目的:探索含Ⅲ型纤连蛋白结构域蛋白5(FNDC5)基因过表达或沉默对高脂饮食喂养的载脂蛋白E基因敲除(ApoE^(-/-))小鼠动脉粥样硬化斑块形成中焦亡相关因子的影响及其机制。方法:建立ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化模型;构建FNDC5基因过表达或沉默载体并转染动物模型,分组干预;采用酶法检测血清脂质含量;主动脉行油红O染色、HE染色和Masson染色检测斑块面积;采用免疫组化检测主动脉壁FNDC5、磷酸化核因子κB(pNF-κB)p65、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、caspase-1和消皮素D N端片段(GSDMD-N)的定位表达;采用TUNEL+caspase-1荧光双染检测主动脉壁细胞焦亡及其特征;采用ELISA法检测主动脉组织乳酸脱氢酶(LDH)活性;采用RT-qPCR和Western blot分别检测主动脉组织FNDC5、NLRP3、NF-κB p65、cleaved caspase-1、含caspase募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、GSDMD-N、白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18的mRNA及蛋白表达水平。结果:成功构建FNDC5腺病毒过表达和沉默载体。过表达FNDC5降低高脂饮食喂养的ApoE^(-/-)小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)水平,减少主动脉斑块面积,降低内膜/中膜比值,降低主动脉LDH活性,降低主动脉NF-κB p65、NLRP3、cleaved caspase-1、ASC、GSDMD-N、IL-1β和IL-18的mRNA及蛋白表达水平,减少细胞焦亡(P<0.05);而沉默FNDC5基因使高脂饮食喂养的ApoE^(-/-)小鼠呈现相反的结果(P<0.05)。结论:FNDC5可调控动脉粥样硬化进程中的细胞焦亡,其机制可能是:通过降低NF-κB活性和表达,抑制NLRP3激活及降低其下游焦亡信号通路相关因子caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18表达,抑制细胞焦亡,从而延缓动脉粥样硬化斑块形成。

敲低RBX1通过下调PHF5A抑制胰腺癌细胞增殖,迁移和侵袭并促进凋亡

目的:研究环盒蛋白1(ring-finger protein 1,RBX1)对胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma,PAAD)细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的作用及其潜在的作用机制。方法:利用基因表达谱交互式分析网站(gene expression profile interactive analysis web⁃site,GEPIA),实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)、Western blot检测RBX1在PAAD组织、细胞中的表达和预后价值。使用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)、细胞克隆形成能力实验、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL)、细胞划痕实验、Transwell实验检测RBX1敲低对胰腺癌-1(pancreatic carcinoma-1,PANC-1)细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。通过LinkedOmics网站研究PAAD中RBX1和PHD锌指结构域蛋白5A(plant homodomain finger-like domaincontaining protein 5A,PHF5A)的相关性。qRT-PCR和Western blot检测RBX1敲低后PHF5A的表达,进行功能拯救实验。结果:RBX1在PAAD组织和细胞系中高表达,与不良预后相关(P<0.05)。RBX1敲低抑制PANC-1细胞增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡(P<0.05)。RBX1和PHF5A在PAAD中具有相关性(r=0.692),且RBX1正向调控PHF5A表达(P<0.05)。功能拯救实验表明PHF5A过表达部分逆转了RBX1敲低对PANC-1细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用(P<0.05)。结论:RBX1敲低通过下调PHF5A表达抑制PANC-1细胞增殖、迁移和侵袭,促进凋亡。