含RGD肽基因导入系统介导TGF-β1基因转染对兔骨髓基质干细胞增殖和体外诱导成骨的影响

目的探讨一种新型靶向性非病毒载体—含RGD肽K16GRGDSPC(记作K16-RGD)介导外源基因转染骨髓基质干细胞(BMSCs)的可行性,观察转化生长因子β1(TGF-β1)基因转染对BMSCs的增殖和体外诱导成骨的影响。方法固相合成法合成K16-RGD,以其为载体将转化生长因子β1质粒pcDNA3-TGF-β1导入兔BMSCs,以导入空载体pcDNA3作为对照,G418筛选得到阳性细胞集落(分别命名为BMSCs-TGF-β1和BMSCs-pcDNA3),逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TGF-β1基因的表达;采用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法(MTT)和流式细胞仪(FCM)检测细胞体外增殖活性,并进行成骨诱导扩增,检测转基因细胞经成骨诱导后碱性磷酸酶(ALP)活性、骨钙蛋白(OCN)含量、核心结合因子a1(Cbfa1)的表达、矿化(钙结节形成)情况。以经诱导的BMSCs-pcDNA3和未转染BMSCs作为对照。结果RT-PCR显示转基因细胞能高表达TGF-β1,BMSCs-TGF-β1的体外增殖活性明显高于对照组(P<0.01);BMSCs-TGF-β1经成骨诱导后表达的成骨特征性表型(ALP、OCN、Cbfa1的表达和矿化)与对照组有显著的差异(P<0.01)。结论含RGD肽K16-RGD可以作为一种较理想的新型基因转移载体介导外源基因转染BMSCs;TGF-β1可以作为骨组织工程种子细胞BMSCs向成骨细胞定向分化的理想调控因子之一。

含RGD肽基因导入系统介导TGFβ_1基因转染骨髓基质干细胞的瞬时表达与稳定表达

目的评价含RGD肽基因导入系统K16GRGDSPC(简记作K16-RGD)作为新型基因转染载体的可行性,并探讨转化生长因子β1(TGFβ1)基因转染骨髓基质干细胞(BMSCs)的表达能力。方法固相合成法合成K16-RGD。以6μgK16-RGD:2μgpcDNA3-TGFβ1(pTGFβ1)比例转染第三代兔BMSCs,转染72h后通过免疫组织化学染色和图像分析检测TGFβ1的瞬时表达水平;G418筛选2周形成阳性克隆,扩大培养后同法检测TGF-β1的稳定表达水平。通过酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒检测TGF-β1的表达分析转染的量效关系和时效关系。结果瞬时转染组免疫组化部分细胞呈强阳性,稳定转染组几乎全部细胞呈强阳性并且持续表达4周以上。图像分析显示瞬时转染组和稳定转染组TGF-β1的表达均比对照组显著增强(P<0·01),且稳定表达组明显高于瞬时表达组(P<0·05)。ELISA法检测量效关系显示,转染体系中K16-RGD(μg)∶pTGFβ1(μg)为3∶1时TGFβ1有最高的表达效率;时效关系显示,稳定转染组TGFβ1的表达比瞬时表达组高(P<0·05)。结论含RGD肽基因导入系统K16-RGD作为基因转染载体是可行的,TGFβ1基因转染BMSCs可有效表达TGFβ1,为下一步利用K16-RGD作为载体构建载TGFβ1基因骨基质材料进行骨缺损修复研究奠定了基础。

含RGD肽基因导入系统介导绿色荧光蛋白基因转染骨髓基质干细胞的瞬时表达检测

目的评价以整合素为靶向的新型非病毒载体系统——含RGD肽基因导入系统K16GRGDSPC(记作K16R-GD)作为基因转染载体的可行性。方法固相合成法合成K16R-GD,以其为载体与不同比例的增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)混合转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),72h后用荧光显微镜观察转染效率及瞬时表达情况。结果转染效率与K16R-GD和质粒的比例有关,转染体系中K16R-GD(μg):pEGFP(μg)为3:1时EG FP有最高的表达效率。结论含RGD肽K16R-GD能有效介导外源基因在BM-SCs内的转染和表达,为下一步利用K16R-GD作为载体构建载基因仿生基质材料进行骨缺损修复研究奠定了基础。

含RGD多肽的构象研究

血小板活化时，表面ＧＰⅡｂ／Ⅲａ受体变构，与纤维蛋白结合形成血栓．纤维蛋白识别ＧＰⅡｂ／Ⅲａ受体时，ＲＧＤ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）是关键序列．含ＲＧＤ多肽可以竞争ＧＰⅡｂ／Ⅲａ受体，进而阻断血栓形成进程．作者注意到，含ＲＧＤ多肽的抗血栓活性与构象关系密切．采用Ｂｉｏｓｙｍ公司设计的Ｄｉｓｃｏｖｅｒ程序，计算了ＲＧＤＳ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ），ＲＧＤＶ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｖａｌ）和ＲＧＤＦ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ）在真空下、在水中和在正辛醇中的右手螺旋、左手螺旋及β伸展构象。

铼[^(188)Re]羰基化合物标记含RGD的环肽及其生物分布

以fac-[188Re(CO)3(H2O)3]+为前体标记了含RGD的环形多肽,并对其在普通小鼠和荷S180肉瘤小鼠体内的生物分布作了初步研究。铼[188Re]羰基化合物标记含RGD环肽标记方法简单易行,75℃反应30min,标记率在90%以上。不会引起红细胞的溶血和凝聚现象,普通小鼠和荷S180肉瘤小鼠的生物分布实验表明,标记肽主要通过泌尿系统和肝胆代谢两个途径清除,1、4、24和48h肿瘤/肌肉比分别为:(4.4075±0.1139)、(5.1510±0.5375)、(4.4727±0.4895)和(4.8788±3.16)。

新型靶向性非病毒载体K16GRGDSPC转染骨髓基质细胞的条件优化

目的 优化新型靶向性非病毒基因载体——含RGD肽K16GRGDSPC介导转化生长因子β1（TGF-β1）基因转染骨髓基质细胞的转染条件。方法 固相合成法合成K16GRGDSPC寡肽并用质谱仪和高压液相色谱仪进行检测。在保持其它因素一致的条件下，通过变化单一因子来筛选某个最佳参数。结果 合成肽与设计肽的分子量一致，纯度为94％～95％，满足实验要求。在寡肽载体介导转染的过程中，溶酶体抑制剂氯喹起着不可或缺的作用，而且在氯喹溶液中的暴露时间至少应维持在8h以上；在载体／DNA复合物中暴露时间过短（〈4h）或过长（〉24h）对转染都有不利影响；血清对载体／DNA复合物与细胞的结合有明显抑制作用；质粒含量在2～4μg时转染效果最佳；质粒／载体质量比为1：2～1：4时有较高的转染效率；加入转铁蛋白也能显著提高基因的转染和表达，且在25μg时转染效率达到最大。结论 通过优化转染条件可提高寡肽载体的转染效率，可为下一步进行骨基质材料表面基因修饰研究提供基础。

Antiplatelet Aggregation Effects of YIGSK and RGD Containing Peptides

Antiplatelet aggregation effects of YIGSK, RGDS, RGDV, RGDF, YIGSKRGDS, YIGSKRGDV and YIGSKRGDF were observed. By comparing their activities it was found that by coupling YIGSK and RGD containing peptides the antiplatelet aggregation effects of some of the compounds may be enhanced.

含RGD环六肽与整合素蛋白α_(Ⅱb)β_3的结合反应

ＲＧＤ序列普遍存在于细胞外基质蛋白中，并能为许多整合素蛋白所识别．利用 ＥＬＩＳＡ，ＳＰＲ等技术，对表面固定的人工合成生物素－含 ＲＧＤ环六肽［ｃｙｃｌｏ（－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－）］与人血小板整合素蛋白α_（Ⅱｂ）β_３的结合能力进行了检测结果表明，含ＲＧＤ环六肽与生物素基团之间的间臂长度在 １．４８～２．２ ｎｍ时， ＲＧＤ序列才能有效进入α_（Ⅱｂ）β_３以头部的反应中心并发生结合反应；反应的平衡解离常数为 １．１μｍｏｌ／Ｌ．为在固体表面研究整合素蛋白介导的细胞吸附过程提供了一个理想的模型系统．

兔骨髓基质干细胞的分离培养和鉴定及转化生长因子β1的基因瞬时转染研究

目的：通过研究兔骨髓基质干细胞（BMSC）的体外获取方法、生物学鉴定以及新型靶向性非病毒载体介导转化生长因子β1（TGF-β1）基因在BMSC中的瞬时转染和表达，为下一步的骨组织工程基因治疗研究奠定基础。方法：取4周龄新西兰大白兔骨髓，通过密度梯度离心法和全骨髓培养法获取BMSC，通过倒置相差显微镜、BrdU标记染色观察其形态学特征和生长状况，免疫组化观察其表面抗原表达情况。固相合成法合成含RGD肽K16GRGDSPC（K16-RGD）。以K16-RGD为载体介导TGF-β1基因转染兔BMSC，免疫组化检测其瞬时转染和表达·效率。结果：分离培养的细胞在第10-12代以前生长性状稳定，增殖能力强。免疫组化检测兔BMSC表达CD90、CD44，但不表达CD34、CD45、CD11b和层黏连蛋白Laminine。与全血培养法相比较，密度梯度离心法获取的BMSC纯度更高。K16-RGD介导TGF-β1基因瞬时转染效率可达（21．6±4．3）％。结论：分离培养的细胞成分较为单一，具有干细胞特性；TGF-β1基因能在BMSC中转染和表达，为下一步利用BMSC、K16．RGD和TGF-β1基因进行骨组织工程基因治疗研究奠定了基础。