含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2变构抑制剂缓解放射性肺炎的作用效应与机制研究

目的探索含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase 2,SHP2)变构抑制剂对放射性肺炎的缓解作用及其可能的机制。方法以50 Gy的剂量进行双肺辐照建立辐射诱导放射性肺炎小鼠模型,分别提取SHP2变构位点抑制剂SHP099辐照组(辐照并予以SHP099灌胃)、辐照组(辐照未灌胃)、SHP099未辐照组(未辐照并予以SHP099灌胃)和对照组(未辐照且未灌胃)小鼠的肺组织制作HE切片。通过实时荧光定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测4组小鼠肺组织内炎性反应因子诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的mRNA水平。RT-qPCR检测小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7和骨髓原代巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMDM)中iNOS、TNF-α和IL-6的表达情况。收集BMDM培养上清采用酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测TNF-α和IL-6的分泌情况。通过流式细胞术分析辐照后不同培养时间后RAW264.7和BMDM细胞产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平。采用RT-qPCR检测10 Gy辐照后24 h RAW264.7细胞还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶(NADPH oxidase,NOX)各亚基和同系物表达水平变化。采用蛋白质印迹法检测RAW264.7细胞中NOX4表达水平。结果通过SHP099灌胃辐射小鼠模型发现,SHP099预处理的辐照小鼠肺部损伤减弱,肺组织内炎性反应因子iNOS、TNF-α和IL-6的mRNA表达均下调(均P<0.05)。10 mmol/L SHP099预处理24 h后,RAW264.7和BMDM细胞因10 Gy辐照引起的上升的炎性反应因子iNOS、TNF-α和IL-6 mRNA表达均下降(均P<0.05)。收集BMDM细胞的培养上清显示,SHP099预处理也可减少辐照后TNF-α和IL-6蛋白的分泌(均P<0.05)。SHP099预处理也可降低10 Gy辐照后30 min引起的RAW264.7和BMDM细胞升高的ROS水平(均P<0.05)。采用RT-qPCR检测RAW264.7细胞10 Gy辐照后24 h NOX各个亚基和同系物的表达变化情况显示,p22^(phox)、p40^(phox)、Rac1、NOX2、NOX3、NOX4和NOX5表达均上调(均P<0.05),其中NOX4上调最多;而SHP099预处理可减少辐照后RAW264.7细胞的NOX4蛋白表达(P<0.01)。结论SHP2变构抑制剂可以缓解辐照诱导的小鼠肺部炎性反应。SHP2变构抑制剂可能是通过抑制巨噬细胞中NOX4的表达降低ROS产生,从而减少炎性反应因子分泌。

含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶1在肝脏疾病中的研究现状

蛋白酪氨酸磷酸化修饰广泛存在于真核细胞内,作为一种基础调节机制参与调节细胞的增殖、凋亡、分化、迁移等多个生命过程。蛋白酪氨酸磷酸化改变可影响肝脏炎症、肝纤维化、肝癌等多种肝脏疾病。含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP-1)属于非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶,是维持体内蛋白酪氨酸磷酸化水平的关键因子。近年来SHP-1在肝脏疾病中的研究取得了重大进展,本文主要就SHP-1在肝脏疾病中的研究现状作一综述。

含SH2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2表达变化对肝纤维化大鼠肝组织中细胞外信号调节激酶1/2活性的影响

目的:探讨含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)表达变化对肝纤维化大鼠肝组织中细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)活性的影响。方法:健康雄性SD大鼠160只被随机分为五组(对照组、模型组、Ad-GFP组、Ad-SHP2组及Ad-shRNA/SHP组),每组32只。除对照组(腹腔注射0.9%氯化钠溶液)外,其余四组构建四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化模型,并将表达绿色荧光蛋白(GFP)的空病毒Ad-GFP、表达野生型SHP2及GFP的腺病毒Ad-SHP2、表达GFP及靶向SHP2的短发夹RNA(shRNA)的腺病毒Ad-shRNA/SHP自大鼠尾静脉分别注射入Ad-GFP组、Ad-SHP2组及Ad-shRNA/SHP2组大鼠,各组分别于造模第2、4、6、8周选取8只大鼠留取肝组织标本。采用HE染色观察大鼠肝组织病理学变化;采用Masson三色染色检测大鼠肝组织胶原沉积;采用实时荧光定量PCR检测大鼠肝组织SHP2、ERK1 mRNA表达;采用免疫组织化学染色检测SHP2蛋白表达;采用Western blot检测ERK1和p-ERK1蛋白表达。结果:大鼠肝纤维化模型成功构建,在各造模时间点,与模型组及Ad-GFP组大鼠肝组织胶原沉积比较,Ad-SHP2组均加重,而Ad-shRNA/SHP2组均减轻。导入野生型SHP2基因后大鼠肝组织的SHP2 mRNA及蛋白表达明显升高(均P<0.05),而导入靶向SHP2的shRNA后大鼠肝组织的SHP2 mRNA及蛋白表达明显降低(均P<0.05)。在各造模时间点(第2、4、6、8周),模型组、Ad-GFP组、Ad-SHP2组及Ad-shRNA/SHP2组大鼠肝组织ERK1 mRNA及蛋白表达以及p-ERK1蛋白表达高于对照组(均P<0.05),但上述四组大鼠肝组织的ERK1 mRNA及蛋白表达差异无统计学意义(均P>0.05);而在各时间点与模型组及Ad-GFP组大鼠肝组织p-ERK1蛋白表达比较,Ad-SHP2组升高(均P<0.05),Ad-shRNA/SHP2组降低(均P<0.05),模型组与Ad-GFP组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:大鼠纤维化肝组织中SHP2过表达可通过促进ERK1/2磷酸化增强ERK1/2活性,而SHP2低表达则可通过抑制ERK1/2磷酸化降低ERK1/2活性。

鱼腥蓝细菌PCC 7120中两个磷酸酶N端结构域活性分析

为了研究鱼腥蓝细菌(Anabaena sp.)PCC 7120中两个PP2C类蛋白磷酸酶PrpJ1和PrpJ2的磷酸酶活性,将编码两个蛋白N端至跨膜区的基因片段重组到质粒中,转化大肠杆菌进行原核表达,获得了可溶性的PrpJ1up和PrpJ2up蛋白。并且以pNPP为底物测定了所得蛋白的磷酸酶活性,双倒数作图法结果显示PrpJ1up蛋白的Km为0.30 mmol/L,Vmax为7.10 nmol/min;PrpJ2up蛋白的Km为0.24 mmol/L,Vmax为0.43 nmol/min。

含jumonji结构域的蛋白2B和缺氧诱导因子1α在儿童非霍奇金淋巴瘤组织中的表达及意义

目的探讨含jumonji结构域的蛋白2B(jumonji domain-containing protein 2B,JMJD2B)和缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-lα)在儿童非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma,NHL)组织中的表达和意义。方法应用免疫组化检测46例NHL儿童(观察组)和24例反应性增生儿童(对照组)淋巴结组织标本中JMJD2B和HIF-1α的表达,分析JMJD2B和HIF-1α与NHL患儿临床病理特征和预后的关系,以及在NHL组织中JMJD2B和HIF-1α表达的相关性。结果观察组JMJD2B(87%vs 21%)和HIF-1α(83%vs 42%)表达阳性率均高于对照组(P<0.05)。JMJD2B和HIF-1α表达与NHL患儿血清乳酸脱氢酶水平和国际预后指数危险度相关(P<0.05)。JMJD2B与HIF-1α在NHL患儿组织中的表达呈正相关(rs=0.333,P=0.024)。结论JMJD2B和HIF-1α在儿童NHL组织中表达增高,二者在儿童NHL发生发展过程中可能起协同作用;JMJD2B可作为儿童NHL辅助诊断、评估病情、指导治疗、评估预后的新指标.

依托咪酯通过下调含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2表达抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖并诱导其凋亡的实验研究

目的探讨依托咪酯(ETO)对非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞增殖和凋亡的影响及含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2(WWP2)在其中发挥的作用机制。方法分别采用0、1、2和3 mg/L的ETO处理人正常肺上皮细胞系BESA-2B和人NSCLC细胞系A549,细胞计数试剂盒法检测细胞活力;将A549细胞随机分为对照组、ETO(3 mg/L)组、ETO+NC组和ETO+WWP2-OE组,后2组分别于ETO处理后转染空载体pcDNA3.1-NC或WWP2过表达载体pcDNA3.1-WWP2,集落形成试验检测细胞增殖能力;TUNEL染色检测细胞凋亡;实时荧光定量聚合酶链反应法检测各组细胞中WWP2的mRNA表达;STITCH数据库选择与ETO直接相互作用的蛋白质;蛋白质印迹法检测各组细胞中WWP2、增殖、凋亡和磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路相关蛋白表达。结果ETO以剂量依赖性方式显著降低A549细胞活力(F=147.923,P<0.001);而对正常肺上皮BESA-2B细胞活力无影响(F=1.427,P=0.126)。不同浓度(0、1、2、3 mg/L)ETO处理A549细胞后,集落形成数量逐渐减少[0、1、2、3 mg/L ETO组分别为(898±38)、(785±48)、(635±36)、(388±20)个],细胞凋亡率逐渐升高[0、1、2、3 mg/L ETO组分别为(2.23±0.65)%、(7.63±0.35)%、(13.24±0.47)%、(18.93±0.36)%],呈剂量依赖性(F=218.732、352.786,均P<0.001)。STITCH数据库预测ETO可通过上调WWP2蛋白表达和下调PTEN蛋白表达与WWP2和PTEN相互作用。与对照组相比,ETO组细胞中WWP2的mRNA和蛋白表达降低,集落形成数量减少,细胞凋亡率升高,增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞增殖抗原Ki67、B淋巴细胞瘤基因2(Bcl-2)和PTEN蛋白表达降低,Bcl-2相关X蛋白(Bax)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)蛋白表达升高,磷酸化PI3K(p-PI3K)/PI3K和磷酸化Akt(p-Akt)/Akt比值降低(均P<0.01);与ETO+NC组比较,ETO+WWP2-OE组细胞中WWP2的mRNA和蛋白表达升高,集落形成数量增多,细胞凋亡率降低,PCNA、Ki67、Bcl-2和PTEN蛋白表达增多,Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达减少,p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值升高(均P<0.01)。结论ETO可抑制A549细胞增殖并促进细胞凋亡,其作用机制可能与调控WWP2的下调和PTEN/PI3K/Akt通路的激活有关。

人源性基因PLC-γ1中SH2-SH2-SH3结构域的克隆、表达及纯化

利用RT-PCR技术将人源性PLC-γ1中的SH2-SH2-SH3结构域基因扩增并克隆到载体pGEX-2T中,经热激反应转化到大肠杆菌BL21菌株内,在低温(33℃)下、利用IPTG诱导表达构建的重组基因的高效表达体系,利用谷胱甘肽琼脂糖(sepharose)4B纯化得到高表达的重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot检测表明,PLC-γ1的SH2-SH2-SH3结构域重组基因可在低温(33℃)条件下在E.coliBL21细胞中稳定完整表达,但是在较高温度下(37℃)会产生SH2-SH2-SH3结构域不完全表达的现象。上述研究结果为人源性重组基因PLC-γ1中SH2-SH2-SH3结构域的深入研究和广泛应用奠定了基础。

蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1的中药抑制剂筛选

用含有蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1催化结构域(ΔSHP-1)的质粒转化大肠杆菌,得到ΔSHP-1的高效表达,经分离纯化后,以ΔSHP-1为靶标,通过体外酶反应动力学实验,对157种中药水提液的抑制效果进行研究,筛选出两种对ΔSHP-1具有显著抑制作用的中药:山茱萸和蒲公英,并对其IC50及抑制类型做了进一步研究.为建立蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂的筛选方法和中药在治疗免疫疾病和糖尿病上的开发和应用提供了理论依据.

徐家围子地区(K_1sh+K_1yc)—K_1d_2含气系统研究与评价

对徐家围子地区(K1sh+K1yc)-K1d2含气系统天然气成藏条件描述,指出源岩、盖层、不整合面和古隆起是控制该含气系统天然气成藏与分布的主控因素,天然气成藏的主要时期为泉头组沉积末期;天然气成藏具有沿不整合面短距离运移基岩风化壳成藏、沿裂缝运移源岩区内火山岩成藏和沿砂体侧向运移地层超覆成藏3种模式。(K1sh+K1yc)—K1d2含气系统在徐家围子地区可划分为4个含气子系统:升平—汪家屯、昌德—肇州西和双城—呼兰为好含气子系统,朝长—肇东为较好含气子系统。(K1sh+K1yc)—K1d2含气系统自登三段沉积末期形成后在泉头组沉积末期-青山口组沉积时期、嫩江组沉积末期、明水组沉积末期和早第三纪末期由于T5(T4)至T3或T2断层活动开启上扩范围扩大,使得天然气成藏的空间范围增大,造成“同源多层”的天然气分布现象,同时使天然气成藏模式发生变化。

胃癌肿瘤相关巨噬细胞内SHP2通过抑制STAT3-TGFβ通路进而减轻PD-L1表达

目的:探究肿瘤相关巨噬细胞内含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP2)对胃癌内细胞程序性死亡-配体1(PD-L1)表达的影响及其机制。方法:将人单核/巨噬细胞THP-1细胞、人胃癌细胞系SGC-7901细胞培养后,THP-1细胞诱导分化为巨噬细胞,采用慢病毒感染的方法构建稳定敲低和过表达SHP2基因的THP-1细胞,与SGC-7901细胞非接触式共培养,将其分为对照(NC)组和SHP2-shRNA组、NC组和SHP2-mimic组、Stattic(STAT3抑制剂)+NC组和Stattic+SHP2-shRNA组。利用超速离心法提取THP-1细胞上清液外泌体,免疫印迹检测THP-1细胞中STAT3-TGFβ通路相关蛋白及外泌体CD9和TGFβ蛋白表达情况,免疫印迹检测SGC-7901细胞STAT3-TGFβ通路相关蛋白及PD-L1、p-STAT3、IL-10、PTEN和p-PI3K蛋白表达情况,CCK-8检测SGC-7901细胞增殖活性,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。结果:THP-1细胞中,SHP2-shRNA组SHP2蛋白表达水平显著低于NC组,p-STAT3、IL-10和TGFβ及外泌体中CD9和TGFβ蛋白表达水平显著高于NC组;SHP2-mimic组SHP2蛋白表达水平显著高于NC组,p-STAT3、IL-10和TGFβ及外泌体中CD9和TGFβ蛋白表达水平显著低于NC组。共培养的SGC-7901细胞中,SHP2-shRNA组SHP2和PTEN蛋白表达水平显著低于NC组,p-STAT3、TGFβ、PD-L1和p-PI3K蛋白表达水平及细胞增殖活性、迁移和侵袭能力显著高于NC组;Stattic干预后,SHP2蛋白表达水平未被影响,PTEN蛋白表达水平增加,p-STAT3、TGFβ、PD-L1和p-PI3K蛋白表达水平及细胞增殖活性、迁移和侵袭能力降低,Stattic+NC组和Stattic+SHP2-shRNA组之间差异无统计学意义。结论:肿瘤相关巨噬细胞SHP2通过抑制胃癌细胞内STAT3-TGFβ通路活性抑制PD-L1和p-PI3K表达,进而抑制胃癌细胞增殖活性及迁移和侵袭能力,从而延缓胃癌进展。

dBET1降解溴结构域蛋白4抑制α突触核蛋白寡聚体的神经毒性作用研究

目的探究用dBET1降解溴结构域蛋白4(BRD4)能否抑制α突触核蛋白(α-syn)寡聚体导致的神经炎症及氧化应激。方法dBET1与α-syn寡聚体共同处理BV2细胞或SH-SY5Y细胞,分为对照组、α-syn组、α-syn+500 nmol/L dBET1组,α-syn+1000nmol/L dBET1组,1000nmol/L dBET1组。定量聚合酶链反应检测炎性因子及抗炎因子,蛋白质免疫印迹检测BRD4、核因子E2相关因子2(Nrf2)、磷酸化核转录因子κB(p-NF-κB)及磷酸化α-syn(p-α-synuclein)等。结果α-syn+1000nmol/L dBET1组炎性因子mRNA、BRD4、p-NF-κB、p-α-synuclein表达低于α-syn组,而抗炎因子mRNA、细胞核Nrf2表达显著高于α-syn组[(2.02±0.14)vs(0.96±0.24),P<0.05]。结论dBET1通过p-NF-κB及Nrf2在一定程度上能抑制α-syn导致的神经炎症及氧化应激等,为进一步运用于治疗帕金森病等疾病提供理论基础。

小鼠下丘脑SH2B1,SOCS3,PTP1B及NPY表达的变化及其与肥胖的关系

目的:研究肥胖小鼠及正常小鼠不同周龄下丘脑组织SH2B1(adapter protein with a Src-homology 2 domain),细胞因子信号转导抑制蛋白3(the suppressor of cytokine signaling-3,SOCS3),蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(proteintyrosine phosphatase 1B,PTP1B)和神经肽Y(neturopetide Y,NPY)表达的变化规律及其与血清瘦素及胰岛素水平的关系。方法:选用健康C57BL/6乳鼠制作肥胖动物模型,计算Lee’s指数及稳态模型胰岛素抵抗指数。荧光定量RT-PCR法检测下丘脑SH2B1,SOCS3及PTP1B mRNA表达量,Western印迹检测下丘脑SH2B1和NPY蛋白表达量。结果:与同周龄对照组小鼠相比,肥胖组小鼠下丘脑组织SH2B1 mRNA表达减少,SOCS3及PTP1B mRNA表达增加;Western印迹结果显示:肥胖组小鼠SH2B1蛋白表达水平较对照组下降,NPY表达升高。直线相关分析显示:血清瘦素和血清空腹胰岛素水平与SH2B1 mRNA表达呈负相关,与SOCS3及PTP1B mRNA表达正相关。结论:SH2B1,SOCS3,PTP1B及NPY是肥胖发生、发展过程中的关键因子。

柴胡疏肝汤对癫痫大鼠海马组织中Bcl-2、NLRP1、Caspase-3、Caspase-1表达的影响

目的探讨柴胡疏肝汤对癫痫大鼠海马组织中B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、含NLR家族pyrin结构域1因子(NLRP1)、Caspase-3、Caspase-1表达的影响。方法基于生物信息学分析筛选柴胡疏肝汤治疗癫痫的核心活性成分及核心靶点。将100只SD大鼠随机分为癫痫组(n=80)与空白组(n=20)。对空白组大鼠不作任何处理,对癫痫组大鼠建立癫痫模型,成功建模后将其随机分为模型组、柴胡疏肝汤低剂量组、柴胡疏肝汤中剂量组、柴胡疏肝汤高剂量组,每组20只。给予柴胡疏肝汤低、中、高剂量组大鼠柴胡疏肝汤(2.5 mg/100 g、5 mg/100 g、10 mg/100 g)灌胃,给予模型组及空白组大鼠生理盐水灌胃。给药4周后,比较模型组与柴胡疏肝汤低、中、高剂量组的大鼠癫痫发作等级,然后处死5组大鼠并获取其海马组织,分别采用实时荧光定量PCR和Western blot检测Bcl-2、NLRP1、Caspase-3、Caspase-1的mRNA及蛋白表达水平。结果(1)柴胡疏肝汤治疗癫痫的核心活性成分包括槲皮素、山柰酚、柚皮素、β-谷甾醇、川陈皮素、异鼠李素、木犀草素、豆甾醇、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、罗通定,核心靶点包括Bcl-2、NLRP1、Caspase-3、Caspase-1。槲皮素、山柰酚、柚皮素、β-谷甾醇、川陈皮素和木犀草素与核心靶点表现出较好的结合活性。(2)干预后,与模型组相比,柴胡疏肝汤中、高剂量组的癫痫发作等级降低(P<0.05);与柴胡疏肝汤低剂量组相比,柴胡疏肝汤中、高剂量组的癫痫发作等级降低(P<0.05)。与空白组比较,模型组Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平降低,NLRP1、Caspase-3、Caspase-1的mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05);与模型组比较,柴胡疏肝汤各剂量组Bcl-2的m RNA和蛋白表达水平升高,NLRP1、Caspase-3、Caspase-1的mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05);柴胡疏肝汤低剂量组、柴胡疏肝汤高剂量组、柴胡疏肝汤中剂量组Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平依次升高,柴胡疏肝汤中剂量组、柴胡疏肝汤低剂量组、柴胡疏肝汤高剂量组NLRP1的m RNA和蛋白表达水平依次升高,柴胡疏肝汤高剂量组、柴胡疏肝汤低剂量组、柴胡疏肝汤中剂量组Caspase-3、Caspase-1的mRNA和蛋白表达水平依次升高(P<0.05)。结论柴胡疏肝汤可能通过上调大鼠海马组织中Bcl-2的表达,抑制NLRP1、Caspase-3、Caspase-1的表达,发挥抗癫痫作用。

胰岛素受体底物和酪氨酸磷酸酶在2型糖尿病大鼠肌肉组织中的蛋白表达及其意义

目的研究2型糖尿病对胰岛素产生抵抗的分子机制。方法用Western杂交检测2型糖尿病模型(OLETF大鼠)肌肉组织内IRS-1及SH-PTP2的蛋白表达水平,并以同种属的Wistar大鼠做比较。结果OLETF糖尿病大鼠的空腹和餐后血糖水平较对照组明显增高(P<0.05);Western杂交显示OLETF大鼠肌肉组织内IRS-1蛋白表达较对照组减少(P<0.05);而SH-PTP2的蛋白表达则较对照组增加(P<0.05)。结论IRS-1及SH-PTP2蛋白表达的异常改变,可能是引起2型糖尿病产生胰岛素抵抗的分子机制之一。

氧化应激诱导的SHP1/Src失衡对晚期胃食管结合部腺癌侵袭生长的影响

目的探讨氧化应激诱导的含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP1)/酪氨酸激酶(Src)失衡对晚期胃食管结合部腺癌(AEG)侵袭生长的影响。方法①选取宁夏回族自治区人民医院2020年1月—2023年4月手术治疗的100例AEG患者,根据肿瘤TNM分期分为早期AEG组和晚期AEG组,HE染色观察癌组织病理形态,免疫组化法观察癌组织中磷酸化Src(p-Src)蛋白阳性表达情况,Western blot法检测癌组织中p-Src、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(NOX2)蛋白表达情况。②通过体外培养人AEG肿瘤细胞,CCK-8法检测肿瘤细胞增殖能力,Transwell实验检测肿瘤细胞迁移能力,Western blot法检测细胞中p-SHP1、p-Src、磷酸化信号传导和转录激活因子3(p-STAT3)、磷酸化RUNX家族转录因子3(p-RUNX3)及RUNX3蛋白表达情况。结果与早期AEG组比较,晚期AEG组癌组织出现明显缺血缺氧坏死,癌组织中p-Src蛋白阳性表达率和p-Src、NOX2和NOX4蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05)。体外实验中,与对照组比较,NAC组培养72 h细胞光密度值明显降低(P均<0.05),细胞迁移数目明显减少(P<0.05),细胞中p-SHP1、RUNX3蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),细胞中p-Src、p-STAT3、p-RUNX3蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05);H_(2)O_(2)组培养72 h细胞光密度值明显升高(P<0.05),细胞迁移数目明显增加(P<0.05),细胞中p-SHP1、RUNX3蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),细胞中p-Src、p-STAT3、p-RUNX3蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05)。与H_(2)O_(2)组比较,H_(2)O_(2)+NAC组、H_(2)O_(2)+达沙替尼组、H_(2)O_(2)+达沙替尼+NAC组培养72 h细胞光密度值明显降低(P均<0.05),细胞迁移数目均明显减少(P均<0.05),细胞中RUNX3蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),细胞中p-SHP1、p-Src、p-STAT3、p-RUNX3蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)。H_(2)O_(2)+达沙替尼组、H_(2)O_(2)+达沙替尼+NAC组细胞光密度值、细胞迁移数目和细胞中p-Src、p-STAT3、p-RUNX3、RUNX3蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05),但H_(2)O_(2)+达沙替尼+NAC组p-SHP1蛋白相对表达量明显高于H_(2)O_(2)+达沙替尼组(P<0.05)。结论氧化应激诱导的SHP1/Src失衡促进晚期AEG侵袭生长。

SHP2表达变化对四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠肝组织中Akt表达的影响

目的 探讨含SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)过表达及低表达对四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化大鼠肝组织中蛋白激酶B(Akt)的影响。方法选取160只健康雄性SD大鼠,随机分为对照组、模型组、AdGFP组、Ad-SHP2组和Ad-shRNA/SHP2组,每组32只。采用腹腔注射CCl4法构建大鼠肝纤维化模型,经大鼠尾静脉分别将表达绿色荧光蛋白(GFP)的空病毒Ad-GFP、表达野生型SHP2及GFP的腺病毒Ad-SHP2、表达GFP并携带靶向SHP2的短发夹RNA(shRNA)的腺病毒Ad-shRNA/SHP2注入大鼠体内。各组分别于造模第2、4、6、8周随机选取8只大鼠,留取肝组织标本。采用实时荧光定量PCR法检测各组大鼠肝组织中SHP2、Akt的mRNA表达水平,采用蛋白质印迹法检测各组大鼠肝组织中SHP2、Akt及磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白表达水平,采用H-E染色法观察各组大鼠肝组织的病理变化,采用Masson三色染色法观察各组大鼠肝组织的胶原沉积情况。结果 靶向SHP2的shRNA及外源性野生型SHP2基因成功导入肝纤维化大鼠体内,并使大鼠肝组织中SHP2呈低表达或过表达。与模型组及Ad-GFP组比较,Ad-SHP2组大鼠的肝纤维化程度加重,而Ad-shRNA/SHP2组大鼠的肝纤维化程度则减轻。在同一造模时间点(第2、4、6、8周)对各组大鼠肝组织中Akt的m RNA和蛋白表达水平,以及p-Akt蛋白表达水平进行比较,结果显示Ad-GFP组、Ad-SHP2组、Ad-shRNA/SHP2组及模型组均显著高于对照组(P均<0.05),而各时间点的Ad-GFP组、Ad-SHP2组、Ad-shRNA/SHP2组及模型组的Akt表达水平差异均无统计学意义(P均>0.05);与模型组及Ad-GFP组大鼠肝组织中p-Akt表达水平相比较,AdshRNA/SHP2组在各时间点均显著降低(P均<0.05),Ad-SHP2组在各时间点均显著升高(P均<0.05),模型组与Ad-GFP组的p-Akt表达水平差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论 在CCl4诱导的大鼠肝纤维化病程中,肝组织中SHP2过表达可通过促进Akt磷酸化增强Akt的活性,而肝组织中SHP2低表达则可通过抑制Akt磷酸化减弱Akt的活性。

SH2-ODC/AZ1腺病毒的构建及对BCR-ABL蛋白的降解效应

目的构建重组腺病毒Ad-SH2-ODC和Ad-AZ1,检测共表达SH2-ODC和AZ1蛋白对BCR-ABL癌蛋白的降解效应。方法PCR扩增src同源结构域2(src homology 2,SH2)、鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)及抗酶蛋白1(antizyme 1,AZ1)基因,构建携带SH2-ODC(SO)或AZ1基因的p Ad Track-CMV腺病毒穿梭质粒,经双酶切和测序鉴定后与腺病毒骨架质粒p Ad Easy-1同源重组,获得重组腺病毒质粒。后者经PacⅠ酶切鉴定后,在人胚肾细胞系AD293中包装、扩增,获得重组腺病毒;腺病毒Ad-SO和Ad-AZ1共感染人白血病细胞系K562,western blot检测目的蛋白的表达。结果双酶切和测序证实,腺病毒穿梭质粒构建正确;PacⅠ酶切结果显示,重组腺病毒质粒构建成功;western blot证实目的蛋白在K562细胞中表达正确,共表达SO和AZ1可以降低BCR-ABL蛋白水平。结论成功构建了Ad-SO和Ad-AZ1重组腺病毒,共表达SO和AZ1可以降解K562细胞中的BCR-ABL蛋白。

含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2抑制剂在肿瘤靶向和免疫治疗中的应用进展

由PTPN11基因编码的含Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase, SHP2)是细胞关键调节因子蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase, PTP)家族的一员,在多种恶性肿瘤中高表达。一方面,SHP2通过介导RAS-MAPK,PI3K-AKT和JAK-STAT等信号通路调节肿瘤细胞的生理功能。另一方面,在肿瘤微环境中,SHP2与免疫抑制受体[如程序性死亡受体1(programmed death-1,PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)等]结合,调节免疫细胞的功能,造成免疫微环境的抑制性。因此,SHP2在肿瘤中具有调节肿瘤细胞和免疫微环境的双重功能,提示其为极具价值的肿瘤治疗靶点。近年来,大量具有成药潜力的SHP2抑制剂进入临床试验,为肿瘤靶向治疗提供新的可能。目前SHP2抑制剂的研究已经取得一定成果,但仍存在较多耐药性、非特异性和毒性等问题。因此,需进一步研究SHP2抑制剂的成药性和靶向策略。本文对SHP2参与信号通路的调控机制和其在肿瘤和免疫微环境中的作用进行总结,并对SHP2抑制剂及其临床研究进展进行综述。

血脂变化对OLETF大鼠肝脏、脂肪组织胰岛素受体底物1和含2个SH结构的蛋白酪氨酸磷酸酶蛋白表达的影响

目的观察血脂变化对OLETF大鼠胰岛素受体底物-1(IRS-1)和含2个SH结构的蛋白酪氨酸磷酸酶(SH-PTP2)蛋白表达的影响。方法 14只OLETF大鼠被随机分为降脂治疗组和对照组。采用Western杂交技术检测OLETF大鼠肝脏、脂肪组织内IRS-1及SH-PTP2的蛋白表达水平。结果降脂治疗组血糖及血脂水平较对照组下降(P<0.05),肝脏、脂肪组织内IRS-1蛋白表达较对照组增加(t=14.61,15.76,P均<0.01),而SH-PTP2的蛋白表达较对照组减少(t=-3.07、-28.76,P均<0.01)。结论降脂治疗可增加OLETF大鼠肝脏、脂肪组织内IRS-1蛋白表达,减少其SH-PTP2蛋白表达,并可能因此影响其胰岛素信号传导,改善其靶组织对胰岛素的敏感性。

氧诱导视网膜病变模型小鼠视网膜组织中SHP2的表达及意义

目的探讨含Src同源-2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP2)及磷酸化SHP2(P-SHP2)在氧诱导视网膜病变(OIR)组织中的表达及意义。方法将20只清洁级C57BL/6J(B6)7日龄新生小鼠随机分为正常对照组和OIR组,每组10只。正常对照组小鼠与哺乳母鼠共同置于常氧、室温正常环境中饲养。OIR组小鼠与哺乳母鼠共同置于温度22~25℃、湿度(60±10)%、氧气体积分数稳定于(75±5)%的氧箱中,持续5 d后转移至常氧环境中。分别于12、14、17日龄时取正常对照组和OIR组小鼠各3只,采用Western blot法检测2组小鼠视网膜组织中SHP2、P-SHP2蛋白表达。随机取正常对照组和OIR组17日龄小鼠各2只,采用苏木精-伊红染色法观察小鼠视网膜组织病理学情况。结果正常对照组17日龄小鼠视网膜组织各层细胞结构排列整齐,内界膜与内皮细胞核均完整,形态正常。OIR组17日龄小鼠视网膜组织各层细胞间结构紊乱,可见血管内皮细胞核突破视网膜内界膜。不同日龄正常对照组小鼠视网膜组织中SHP2蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(F=2.052,P>0.05)。正常对照组小鼠14、17日龄时视网膜组织中P-SHP2蛋白相对表达量显著低于12日龄时(P<0.05),17日龄时视网膜组织中P-SHP2蛋白相对表达量显著低于14日龄时(P<0.05)。OIR组小鼠14日龄时视网膜组织中SHP2蛋白相对表达量显著高于12日龄和17日龄时(P<0.05);OIR组小鼠17日龄时视网膜组织中SHP2蛋白相对表达量与12日龄时比较差异无统计学意义(P>0.05)。OIR组小鼠14日龄时视网膜组织中P-SHP2蛋白相对表达量显著高于12日龄和17日龄时(P<0.05);OIR组小鼠17日龄时视网膜组织中P-SHP2蛋白相对表达量与12日龄时比较差异无统计学意义(P>0.05)。12、17日龄时,OIR组小鼠视网膜组织中SHP2蛋白相对表达量显著低于正常对照组(P<0.05);2组小鼠14日龄时视网膜组织中SHP2蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。OIR组小鼠12日龄时视网膜组织中P-SHP2蛋白相对表达量显著低于正常对照组(P<0.05),17日龄时视网膜组织中P-SHP2蛋白相对表达量显著高于对照组(P<0.05);14日龄时2组小鼠视网膜组织中P-SHP2蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论SHP2及P-SHP2在OIR中均呈时间波动性的表达,缺氧可能促进了OIR小鼠SHP2构象的改变,以磷酸化形式发挥活性,并参与和促进了OIR的发生发展。