绵羊脂肪组织AGPAT2基因启动子区DNA甲基化及其表达研究

为研究绵羊脂肪沉积过程与AGPAT2基因启动子区DNA甲基化水平及其表达的相关性,本研究以尾型不同的湖羊与广灵大尾羊的尾部脂肪组织为实验材料,通过生物信息学软件和亚硫酸氢盐测序(Bisulfite Genomic Sequencing PCR,BSP)分析AGPAT2启动子区序列的CpG岛和甲基化水平;以qPCR技术检测绵羊尾部脂肪组织中AGPAT2基因的表达水平。结果表明,AGPAT2启动子区存在CpG岛;在尾部脂肪组织中,湖羊与广灵大尾羊的AGPAT2基因启动子区的目的片段甲基化率分别为90.5%和76.2%;湖羊AGPAT2基因启动子区中的目的序列发生甲基化位点高于广灵大尾羊;广灵大尾羊AGPAT2mRNA的相对表达量在绵羊尾部脂肪组织中极显著高于湖羊;对AGPAT2启动子区的甲基化水平与其表达水平进行Pearson相关系数分析可知,二者呈中度负相关(r=-0.364,P=0.478)。综上所述,本研究揭示AGPAT2基因在转录水平的表达受启动子区甲基化的负调控,从而推测AGPAT2基因的DNA甲基化水平与绵羊的脂肪沉积过程具有一定的相关性。

贵州白山羊MyoG基因启动子区序列克隆及生物信息学分析

【目的】本研究旨在解析肌细胞生成素(MyoG)基因启动子区序列的结构特性及其转录调控机制。【方法】以贵州白山羊血液基因组DNA为模板,设计2对引物,采用PCR扩增、Sanger测序技术获得MyoG基因启动子区序列,通过DNAStar和Mega 5.0软件分别进行不同物种MyoG基因启动子区序列相似性比对及系统进化树构建,利用生物信息学软件预测分析该序列核心启动子区、转录因子结合位点、顺式作用元件、CpG岛等结构特征。【结果】贵州白山羊MyoG基因启动子区序列长2334 bp,包括2092 bp的5′-侧翼序列和242 bp的外显子1,GC含量略低于AT含量。通过不同物种比对分析,贵州白山羊MyoG基因启动子区序列与绵羊、牛、猪、人、小鼠和鸡同源序列相似性分别为98.34%、96.15%、77.76%、74.15%、57.63%和43.04%。系统进化树结果表明,贵州白山羊与绵羊和牛的亲缘关系较近,与鸡的亲缘关系最远。生物信息学结构预测发现,贵州白山羊MyoG基因转录起始位点位于翻译起始密码子ATG上游50 bp,5′-侧翼区存在1个潜在的启动子区域和1个CpG岛,含有1个TATA-box(TTTAAATG)、1个GC-box(CCGCCC)、2个CAAT-box(CCAAT)、17个E-box(CANNTG)和1个富含A/T碱基的元件结构(TATATTTAT)。AliBaba 2.1、PROMO、Patch 1.0、JASPAR 2022和AnimalTFDB 3.0在线软件综合预测发现,贵州白山羊MyoG基因启动子区存在Sp1、NF-1、MEF2、MyoD、USF、GATA-1、GATA-3、SRF、C/EBP和c-Myb等多种转录因子潜在结合位点。【结论】本研究成功克隆获得贵州白山羊MyoG基因启动子区序列,为深入解析该基因调控山羊肌肉发育的分子机制提供理论依据。

妊娠期高血压疾病孕妇血清miR-21、miR-122及其启动子区甲基化水平变化

目的探讨妊娠期高血压疾病(HDP)孕妇血清miR-21、miR-122及其启动子区甲基化水平变化及其临床意义。方法选择HDP孕妇142例(观察组),其中妊娠期高血压80例、子痫前期62例,同期选择正常妊娠孕妇50例作为对照组。采集所有研究对象空腹外周静脉血,离心留取血清,分别采用RT-qPCR法和甲基化特异性聚合酶链反应法检测血清miR-21、miR-122及其启动子区甲基化,分析HDP孕妇血清miR-21、miR-122及其启动子区甲基化水平与临床特征的关系。结果观察组血清miR-21、miR-122水平均显著高于对照组(P均<0.05);子痫前期孕妇血清miR-21、miR-122水平均显著高于妊娠期高血压孕妇(P均<0.05)。观察组miR-21、miR-122启动子区甲基化阳性率均显著低于对照组(P均<0.05);子痫前期孕妇血清miR-21、miR-122启动子区甲基化阳性率均显著低于妊娠期高血压孕妇(P均<0.05)。HDP孕妇血清miR-21、miR-122及启动子区甲基化阳性率均与收缩压、舒张压、24 h尿蛋白量有关(P均<0.05),而与年龄、孕周、孕前BMI无关(P均>0.05)。结论HDP孕妇血清miR-21、miR-122水平显著升高,其启动子区甲基化阳性率显著降低;血清miR-21、miR-122及其启动子区甲基化水平与HDP的发生、发展有关。

鸡内皮素3(EDN3)基因启动子区序列生物信息学分析

为解析鸡内皮素3(EDN3)基因启动子区序列的结构特征及其转录调控机制,本研究基于NCBI数据库中鸡EDN3基因5′侧翼区与外显子1共计2052 bp核苷酸序列,利用不同在线软件对其核心启动子区域、顺式作用元件、转录因子结合位点及CpG岛等结构进行生物信息学预测分析,并通过DNASTAR Lasergene 17.3和MEGA 5.0软件进行不同物种EDN3基因启动子区序列相似性比对及系统进化树构建。结果表明:鸡EDN3基因起始密码子上游592~2000 bp为可能的候选核心启动子区;5′侧翼区633 bp和1547 bp存在2个潜在的转录起始位点T和A;该基因启动子区存在2个CAAT-box、3个GC-box、6个TATA-box、9个E-box和3个CpG岛结构域。综合多种在线软件预测,鸡EDN3基因启动子区存在Sp1、C/EBPα和NF-1等转录因子结合位点。鸡EDN3基因启动子区序列与环颈雉、鹌鹑、岩雷鸟、棕硬尾鸭、凤头潜鸭、山羊、绵羊、牛、猪和人的相似性为38.8%~90.3%;系统进化树表明,鸡与鹌鹑亲缘关系最近,与猪亲缘关系最远。研究结果为进一步探明鸡色素沉积关联EDN3基因的转录调控机制提供了理论依据。

MGMT基因启动子区甲基化测序分析与前列腺癌研究

目的研究前列腺癌组织中MGMT基因启动子区CpG甲基化表型情况,分析其与前列腺癌之间的关系,探讨前列腺癌早期筛选和诊断的方法。方法应用亚硫酸盐修饰后测序法检测30例前列腺癌组织及20例前列腺增生组织中MGMT基因启动子区CpG甲基化表型情况。结果基因测序结果显示MGMT基因在前列腺癌及前列腺增生组织中CpG位点甲基化率分别为22.9%、10.6%,两者甲基化率比较,P<0.05。结论前列腺癌组织中MGMT基因启动子区甲基化程度显著增高,应用BSP检测相关基因甲基化状态,有可能成为筛选和诊断前列腺癌的重要方法;MGMT基因启动子区甲基化率在不同前列腺癌的危险因素分期中差异无统计学意义。

HLA-DRB基因启动子区多态性与肺结核合并2型糖尿病的相关性

目的研究HLADRB基因启动子区序列与肺结核合并2型糖尿病的相关性。方法用PCRSSP法进行HLADRB基因分型,启动子区扩增产物直接测序。结果病例组DRB109等位基因的频率显著高于对照组(P<0.05)。病例组中DRB基因启动子区-65位碱基T和-8位AG杂合子的频率明显增加(P<0.05)。病例组中DRB109阳性标本-65位碱基T的频率明显增加,G明显减少(P<0.01);+39位碱基C明显增加,T明显减少(P<0.01)。结论DRB109等位基因及HLADRB启动子区多态性与肺结核合并2型糖尿病密切相关。

山羊MyoG基因启动子区序列分析与结构预测

为探明山羊MyoG基因的启动子序列与结构及转录调控机制,本研究设计了1对引物,采用PCR扩增、测序以及序列比对分析,从波尔山羊基因组中扩增出一段长度为969bp的山羊MyoG基因的5′侧翼序列,其GC含量为50.6%。经过生物信息学分析,确定了其转录起始位点及活性区域;发现在转录起始位点上游-24bp处存在1个TATA-box,另外还发现了1个GC-box、2个CAAT-box、2个E-box和1个富含A-T碱基的模体结构;该序列还包含HSF、ADR1和cap等转录因子结合位点。通过比对分析,所得山羊MyoG基因5′侧翼序列与牛、马鹿、人、小鼠和鸡同源序列的相似性在37.22%～96.85%之间,说明不同物种间该序列具有一定的保守性。本研究为进一步探讨山羊MyoG基因的表达和调控机制奠定了理论基础。

我国西藏小反刍兽疫病毒China／Tib／Gej／07-30核衣壳蛋白基因和基因组启动子区的分子特征分析

首次对我国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的核衣壳蛋白(N)基因和基因组启动子(GP)区进行序列测定和分子生物学特征分析。首先应用逆转录聚合酶链式反应从发病山羊病料中扩增出小反刍兽疫病毒N基因片段,用cDNA3′末端快速扩增方法获得基因组启动子区片段,对聚合酶链式反应产物进行直接测序,然后对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析,绘制系统发生树。我国西藏小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的N基因由1689个核苷酸组成,编码525个氨基酸,与India/Jhansi/03等6个已知N基因全序列的PPRV毒株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为91.7～97.6和94.9～98.5。小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30N蛋白与磷蛋白作用的结构序列之一为495LFRLQAM501保守序列,N蛋白281-289位氨基酸含有一个T细胞表位,为281YPALGLHEF289保守序列。小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30的GP区由107个核苷酸组成,与Tur-key2000等5株其他PPRV毒株同源性为91.8～98.2。N基因核苷酸序列和相应的氨基酸序列系统进化分析表明小反刍兽疫病毒China/Tib/Gej/07-30与亚洲国家分离株关系最近。

骨髓增生异常综合征患者血浆DNA中FHIT基因启动子区甲基化状态及地西他滨的去甲基化作用

本研究旨在检测骨髓增生异常综合征(MDS)患者血浆DNA中FHIT基因启动子区域甲基化状况及地西他滨对其甲基化的影响。采用甲基化特异性聚合酶链反应法检测1例初治的MDS患者、3例MDS转化而来的AML患者在地西他滨序贯半量CAG方案化疗前后血浆DNA中FHIT基因启动子区域CPG岛甲基化情况,并分析其临床疗效。结果表明,3例患者治疗前有FHIT基因甲基化。治疗1个疗程后其中2例患者FHIT基因甲基化得到逆转,4例患者中有2例获得临床缓解,2例无效。结论:MDS的发生可能与FHIT基因甲基化相关,地西他滨对MDS患者血浆DNA中FHIT基因高甲基化具有明显的去甲基化作用。血浆DNA的FHIT基因甲基化检测可能成为MDS辅助诊断和预后判断的分子标记。

奶牛乳铁蛋白基因启动子区PCR-RFLP分析与乳房炎的相关性

采用CMT方法检测奶牛的乳房炎发病情况.筛选 90头分别设为对照组(健康奶牛)、隐性乳房炎组 (试验组Ⅰ )和临床乳房炎组(试验组Ⅱ),每组 30头.检测每头奶牛的NAGase活性,并用限制性片段长度多态性 (RFLP)分析技术,检测乳铁蛋白(Lf)基因启动子区域的RFLP多态性.结果表明:不同组别的奶牛之间NAGase活性差异显著 (P<0. 01),且Lf基因启动子区域存在RFLP多态性,说明该多态性与乳房炎存在一定关系,可能是奶牛乳房炎的一个分子标记.

乙型肝炎病毒前-C区1896和基本C区启动子区1762、1764双突变及YMDD变异对拉米呋啶治疗的影响

目的 :研究乙型肝炎病毒前 - C区 G1896 A突变和基本 C区启动子区 A176 2 T、 G176 4 A双突变对拉米呋啶治疗的影响。方法 :采用直接测序法对服药前、中、后的血清标本的逆转录多聚酶区及前 - C、基本 C区启动子区进行检测。结果 :1前 - C区 G1896 A和基本 C区启动子区 A176 2 T、G176 4 A双突变在出现治疗中病毒学反弹与未出现治疗中病毒学反弹患者间及发生血清学转移与未发生血清学转换患者间差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ;2 G1896 A突变在发生 YMDD变异和未发生 YMDD变异的患者间差异有显著性 (P<0 .0 5 ) ,发生 YMDD变异的患者很少伴有 G1896 A突变率低 (9% ) ;3出现治疗中病毒学反弹的患者 YMDD变异增加 ,与未出现治疗中病毒学反弹的患者比较差异有显著性 (P<0 .0 5 )。结论 :前 - C区 G1896 A和基本 C区启动子区 A176 2 T、 G176 4 A双突变对拉米呋啶治疗后出现的治疗中病毒学反弹和血清学转换没有影响 ;在 G1896 A突变株 YMDD变异减少 ;YMDD变异株的出现对治疗后出现的治疗中病毒学反弹有影响 ;YMDD变异可能是加剧肝细胞损伤引起治疗中病毒学反弹的因素之一。

急性白血病死亡相关蛋白激酶基因表达及启动子区甲基化状态研究

本研究通过对急性白血病病人及体外肿瘤细胞株的DNA甲基化及基因表达的实验,探讨死亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase,DAPK)基因在急性白血病中的表达情况及其启动子区域甲基化的状态,并分析两者之间的相关程度。应用RT-PCR检测DAPK基因在白血病细胞及正常骨髓细胞中的表达;用巢式甲基化特异性PCR(n-MSP)法检测急性白血病患者及细胞株DAPK基因启动子甲基化状况;从第二轮巢式MSP扩增出的随机产物中挑选2个随机引物,交予专业机构克隆后进行序列分析。结果表明:DAPK基因在10例正常对照者骨髓标本中均有表达,DAPK mRNA在急性白血病病人骨髓标本中表达平均值为0.61±0.40,低于正常对照者,差异有显著性(P<0.05),其中52.94%(9/17例)的急性淋巴细胞白血病病人骨髓标本DAPK mRNA表达降低或缺失,急性髓系白血病病人数据为41.18%(42/102);细胞株U-937显示基因表达正常,HL-60表达缺失;102例急性髓系白血病病人骨髓标本中33例存在DAPK启动子区甲基化,甲基化率为32.4%(33/102);17例急性淋巴细胞白血病病人骨髓标本中8例存在DAPK启动子区甲基化,甲基化率为47%(8/17);7例正常人骨髓标本DAPK启动子区均为非甲基化;细胞株U-937 DAPK启动子区非甲基化,HL-60 DAPK启动子区甲基化。ALL组与AML组患者骨髓细胞DAPK mRNA表达与其启动子甲基化均呈显著负相关(ALL组r=-0.855,P<0.05;AML组r=-0.343,P<0.05),提示两者有密切的关联。结论:急性白血病患者中DAPK基因启动区甲基化与其mRNA的异常表达或失表达有关。

小型猪生长激素基因启动子区SNPs分析

利用PCR-SSCP方法检测4种小型猪(五指山猪、巴马猪、香猪和藏猪)和2种中大型猪(达兰猪和长白猪)生长激素(GH)基因的单核苷酸多态性。发现小型猪中有3处碱基突变发生在5′-调控区,对基因型和等位基因频率进行分析,4种小型猪生长激素5′-侧翼区基因位点中,等位基因A和D为优势等位基因,与达兰猪和长白猪中的分布差异显著(P<0.05)。以上结果表明猪品种间的体型差异可能与GH基因5′-调控区的基因突变和前导肽中的氨基酸变异有关。

膀胱癌组织中上皮细胞钙依粘连蛋白基因启动子区CpG岛甲基化状态的分析

目的 探讨膀胱癌中肿瘤抑制基因上皮细胞钙依粘连蛋白(E cadherin)启动子区CpG岛的甲基化状 态及其与mRNA表达的关系。方法 收集30例新鲜的膀胱癌组织及其癌周正常组织;采用甲基化特异聚合酶 链反应(MSP)检测E cadherin基因启动子区CpG岛的甲基化状态;采用逆转录PCR检测E cadherin基因的mR NA表达。结果 E cadherin基因在膀胱癌组织中的甲基化阳性率(43.3%)显著高于在癌周正常组织中的甲基 化阳性率(6.7%,P<0.01);在复发性膀胱癌中的甲基化阳性率(64.7%)显著高于在原发性膀胱癌中的甲基化 阳性率(15.4%,P<0.05);在不同分级、分期膀胱癌中的差异无显著性。13例异常甲基化的膀胱癌组织中有10 例未检测到CDH1mRNA的表达,而13例未甲基化膀胱癌组织中有2例未检测到,二者差异有显著性(P< 0.01)。结论 E cadherin在膀胱癌组织中有一定程度的过甲基化,但与膀胱癌的临床分期和病理分级无显著相 关性,提示其可能参与了膀胱癌的发生;E cadherin基因CpG岛的过甲基化可能成为判断膀胱癌复发的指标之 一;E cadherin基因CpG岛的过甲基化可能是造成E cadherinmRNA不表达的原因之一。

中国汉族人群NOS3基因启动子区T-786C、A-922G与第7外显子G894T多态性等位基因及其组合分布

目的 研究中国汉族人群的内皮源性一氧化氮合酶基因启动子区 T 786C、A 92 2G与第 7外显子G894T 3个位点的单核苷酸多态性 (SNP)及其等位基因频率、单倍型组合分布特征。方法 利用嵌套式等位基因特异性引物PCR技术检测NOS3T 786C、NOS3G894TSNP以及单一等位基因特异性引物PCR技术检测NOS3A 92 2GSNP ,应用聚类分析其基因多态性特征。结果 获得 50 4例受试者的 3位点的 2 7种SNP基因型组合的自然分布特征。SNP基因型组合前 5种 :NOS3G894T +A 92 2A +T 786T 64例 (1 2 65 % ) ,NOS3G894G +A 92 2A +T 786T 54例(1 0 67% ) ,NOS3G894T +A 92 2G +T 786T 52例 (1 0 2 8% ) ,NOS3G894G +A 92 2G +T 786T 36例 (7 1 1 % ) ,NOS3G894T +A 92 2G +T 786C33例 (6 52 % )。男亚组的SNP的组合分布发生频度的前 3位的顺序与全样本是一致的。结论 本研究首次揭示了NOS3基因的 3位点的SNP基因型组合分布特征 ,为研究其与生理功能和疾病的关系的提供实验基础。

p27^(Kip1)基因启动子区的生物信息学分析

目的生物信息学的发展为通过在线软件预测基因启动子的相关信息提供了众多有重要价值的参考信息。文中利用生物信息学在线软件预测p27Kip1基因启动子功能。方法获取细胞周期调控因子人p27Kip1启动子全长序列,利用多种在线相关软件预测出甲基化部位和转录因子结合部位。结果该基因启动子序列全长为3568 bp,核苷酸数据库(Gen-Bank)登录号为E26053。p27Kip1启动子序列中CpG岛存在于2544~2845 bp、2876~3511 bp处,CpG岛的存在会抑制p27Kip1启动子的转录。p27Kip1启动子共有16个转录因子。结论基因启动子相关生物信息学的研究,提高了针对启动子的研究效率,并为预测基因启动子的功能研究提供了重要信息。

4个猪种IGF-1基因核心启动子区的克隆及生物信息学分析

为了探索IGF-1基因的启动子结构特征对猪体长性状的影响,应用PCR方法从藏猪、巴马小型猪、野猪、军牧一号猪的基因组DNA中分别克隆测序了IGF-1基因启动子区序列,并结合生物信息学手段分析了不同品种猪之间启动子区转录因子结合位点数目和序列特征的差异,发现在IGF-1基因启动子区,巴马小型猪与藏猪、东北野猪、军牧一号猪相比,缺失CdxA、Nkx-2 2个转录因子结合位点,但比藏猪、东北野猪多了1个MZF1转录因子结合位点;藏猪、东北野猪与军牧一号猪相比,缺失1个MZF1转录因子结合位点,邻接法构建的分子进化树发现,藏猪与巴马小型猪亲缘关系最近,与东北野猪亲缘关系相对较近,但与军牧一号猪亲缘关系最远。结果表明:猪的IGF-1基因启动子结构在不同体长猪种上存在一定差异。

乙型肝炎病毒前C区1896、基本C区启动子区1762/1764变异对拉米夫定抗病毒疗效的影响及其临床意义

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)前C区G1896A变异和基本C区启动子(BCP)区A1762T/G1764A双变异对拉米夫定(LAM)抗病毒疗效的影响及其临床意义。方法收集上海及其周边地区34例慢性乙型肝炎患者,单用LAM或LAM+聚乙二醇干扰素α-2a进行抗病毒治疗共48周,应用Trugene HBV genotyping试剂盒测定分析治疗前(0周)、治疗过程中(24周)、治疗结束时(48周)及随访结束时(72周)RT区YMDD变异;采用HBV基因多态性检测芯片试剂盒测定前C区1896、BCP区1762/1764位点的变异情况。结果在治疗前有9例患者检测出前C区G1896A变异,均为HBVe抗原(HBeAg)阴性慢性乙型肝炎患者;9例前C区G1896A变异患者中7例治疗应答(77.8%,7/9),BCP区A1762T/G1764A变异在治疗应答者与无应答者中差异无统计学意义;3例患者分别在治疗24和48周时检测到YMDD变异,对治疗均无应答。结论慢性乙型肝炎患者治疗前血清HBV DNA变异状态可能影响LAM抗病毒治疗应答及YMDD耐药变异株的复制能力。

IL-6基因启动子区-634C/G多态性与糖尿病肾病的相关性

目的探讨白细胞介素6(IL-6)基因启动子区-634C/G多态性与糖尿病肾病(DN)的关系。方法在昆明地区汉族人中,应用PCR-RFLP方法和等位特异PCR(ASPCR)方法,对246例2型糖尿病(T2DM)患者(正常白蛋白尿组88例,微量白蛋白尿组93例,大量白蛋白尿组65例)和101例健康对照者(NC组)的IL-6基因启动子区-634C/G多态性进行检测。结果(1)微量白蛋白尿组、大量白蛋白尿组、微量、大量白蛋白尿组的G/G基因型频率均高于正常白蛋白尿组(P=0.001),大量白蛋白尿组亦高于微量白蛋白尿组(P=0.045)。(2)大量白蛋白尿组和大量、微量白蛋白尿组的G等位基因频率均高于正常白蛋白尿组(P=0.031),大量白蛋白尿组亦高于微量白蛋白尿组(P=0.005)。(3)T2DM组中,GG基因型组UAER明显高于CG、CC基因型组(P<0.01)。(4)Logistic回归分析表明:IL-6基因启动子区-634G/G基因型、病程是DN发生的危险因素。结论在昆明地区汉族人中,IL-6基因启动子区-634G/G基因型可能是DN发生的危险因素,此基因型携带者UAER明显增高;G等位基因可能是DN发展的危险因素之一。

猪SP-A基因启动子区的克隆与序列分析

为了探明猪SP-A基因的启动子及其转录调控机制,设计6条特异性引物,采用染色体步移、克隆测序以及序列比对分析,从大白猪基因组中扩增出一段长度为1 033 bp的猪SP-A基因的上游序列(DQ985806),其GC含量约为55%。经过生物信息学分析,确定了其转录起始位点及活性区域;发现在转录起始位点上游-33 bp处存在1个TATA-box,另外还发现了GC-box、CAAT-box、GT-box以及转录起始子;该序列还包含Sp1、TF和NF-κB等转录因子结合位点以及1个特殊重复序列5-′CATCACTGT-3′。上述试验结果表明,所克隆的1 033 bp的DNA序列是大白猪SP-A基因的启动子区序列。