大鼠GLUT3基因启动子区荧光素酶报告基因载体的构建与鉴定

目的:克隆大鼠葡萄糖转运体3(glucose transporter 3,GLUT3)基因启动子区,并构建其萤火虫荧光素酶报告基因载体。方法:在对大鼠GLUT3基因5′侧翼区进行详尽生物信息学特征分析后,设计相应引物,用PCR的方法从大鼠基因组中扩增出GLUT3基因5′侧翼区-1037～155bp段长为1 292bp的启动子区(以翻译起始点ATG为+1),再用定向克隆的方法将这一启动子区片段定向重组入专门用于启动子活性研究的萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-basic)中,构建出包含大鼠GLUT3基因启动子区的萤火虫荧光素酶报告基因载体(pGL3-GLUT3),电泳与测序鉴定,最后再将pGL 3-GLUT3与内参pRL-TK用脂质体转染的方法瞬时共转染PC12和原代培养的神经元中,通过双荧光素酶报告基因检测系统鉴定pGL 3-GLUT3的启动子活性,并用独立样本t检验方法进行统计分析。对照组共转染pGL3-basic与内参pRL-TK。结果:构建出荧光素酶报告基因载体pGL3-GLUT3。与转染空质粒pGL3-basic组相比,原代神经细胞中转染pGL3-GLUT3组荧光素酶活性升高(5.182 9±0.264 8 vs 2.893 1±0.775 4,P=0.008),在PC12细胞中转染pGL3-GLUT3组荧光素酶活性也升高(2.797 7±0.512 0 vs 1.179 8±0.312 5,P=0.010)。结论:成功克隆GLUT3基因启动子区,并构建出包含GLUT3基因启动子片段的荧光素酶报告基因载体,并且在PC12和原代培养的神经元中pGL 3-GLUT3可以表现出启动子活性。这为后续大鼠GLUT3基因转录调控研究提供研究素材。

美洲棉铃虫CYP321 A1基因启动子区萤火虫荧光素酶报告基因载体的构建及活性测定

【目的】构建美洲棉铃虫细胞色素P450基因CYP321 A1启动子区萤火虫荧光素酶报告基因载体,为探索CYP321 A1基因的转录调控机制奠定基础。【方法】设计合成PCR引物,从美洲棉铃虫基因组DNA中扩增并克隆CYP321 A1基因的启动子区;将克隆的启动子片段插入载体pGL3-basic构建萤火虫荧光素酶报告基因载体p(-1 470/+64);用p(-1 470/+64)转染美洲棉铃虫脂肪体细胞系BCIRL-HzFB33,并用双荧光素酶报告基因检测系统分析该启动子活性。【结果】p(-1 470/+64)经双酶切、PCR鉴定及DNA测序分析鉴定准确无误;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,证实所构建的重组载体p(-1 470/+64)可以反映CYP321 A1启动子活性;黄酮、花椒毒素处理极显著地增强了重组载体p(-1 470/+64)的荧光活性。【结论】成功构建了美洲棉铃虫细胞色素P450基因CYP321 A1启动子区萤火虫荧光素酶报告基因载体,CYP321A1启动子活性可以被植物次生物质黄酮、花椒毒素高度诱导。

人eNOS启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体构建与表达

目的研究血管内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)启动子的功能和eNOS基因表达的调控机制 ,利用红色荧光蛋白构建在哺乳动物细胞中表达的人eNOS启动子全长及其不同区段DNA序列驱动的红色荧光蛋白报告基因载体 ,并对它们在哺乳动物细胞的表达规律作了观察。方法从人脐静脉内皮细胞基因组DNA中克隆eNOS启动子全长( -1～ -1600bp)基因序列(GenBandTM,AccessionNumbe:AF387340)将其构建到红色荧光蛋白载体pDsRed1 -1上 ,经PCR、酶切和DNA测序鉴定正确后命名为pDse_NOSRed。然后以重组pDseNOSRed载体为模板 ,通过DNA序列删除法将eNOS启动子的不同区段DNA序列亚克隆至红色荧光蛋白载体pDsRed1 -1上。这些区段分别是F1033 ,主要删除AP1( -1524～ -1530)、SRE1( -1379～ -1385)和AP2( -1155～ -1163)元件 ;F494 ,主要删除SSRE( -994～ -1000)、AP1( -656～ -662)和RCE( -857～ -863,-812～ -817 ,-711～ -716)元件 ;F166 ,主要删除CACCC( -366～ -370)和GATA( -226～ -231)元件 ,并保留SP1( -95～ -104)元件。所用上游引物分别为5' -gaagatctatctgatgctgcctgtcaccttgaccctgag-3',5'-ccagatctccgtttctttcttaaact_3'、5'_cgagatctgaggtgaaggagagaac_3'和5'_caagatctgtggagctgaggcttt_3',均含有Bg1Ⅱ酶切位点(黑体和下线所?

PAI-1启动子序列与荧光素酶报告基因扩增及载体连接问题分析

目的探讨纤溶酶原激活物抑制剂-1(Plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)启动子荧光素酶表达质粒构建中扩增、转化、酶切及连接的问题。方法利用PCR技术扩增1100 bp长度PAI-1启动子片段,与PUC-19T载体连接,将PUC19T-PAI-1 1100质粒,及荧光素酶报告基因pGL3-Basic质粒转染大肠肝菌(DH5a)后扩增,提取并纯化;以BglⅡ,MluⅠ酶切,电泳并回收PAI-1 1100片段和pGL3-Basic酶切大片段,将PAI-1 1100片段插入荧光素酶报告基因pGL3-Basic中,构建含PAI-1 1100片段荧光素酶质粒。结果扩增PAI-11100 bp片段成功,目的片段与载体PUC19T,pGL3-Basic载体连接条件较苛刻,需要增加连接时间及效率的摸索。结论控制扩增时DNA浓度,胶回收,感受态质量,LB平板质量,内切酶,连接时间及质量比等问题都可增加连接成功概率。

牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因载体构建与活性检测

【目的】构建牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并检测其在C2C12细胞系中的表达活性。【方法】从牛外周血中提取基因组DNA,通过PCR方法从牛基因组DNA中克隆获得牛ATP5B基因的5′端转录调控区的1 898bp目的片段,通过设计引物逐段缺失后获得7个亚克隆,将其纯化后经SmaⅠ和KpnⅠ双酶切与pGL3-Basic载体连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,得到牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,经脂质体基因转染法转染C2C12细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶活性;运用在线软件Gen-omatix和TFSEARCH对ATP5B启动子区序列进行分析。【结果】成功克隆获得7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pATP5B-992、pATP5B-678、pATP5B-462和pATP5B-145;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,可知构建的重组质粒均有启动子活性,且重组质粒pATP5B-678和pATP5B-462与空载体pGL3-Basic的荧光素酶活性差异极显著。软件分析结果显示,ATP5B基因启动子区域-763^-85bp存在多个重要转录调控元件。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且证实-763^-230bp为牛ATP5B基因的核心启动子区域。

C3启动子克隆及荧光素酶报告基因载体构建

为克隆C_3基因启动子序列,构建C_3基因启动子荧光素酶报告基因载体,运用PCR的方法从血液中提取到的基因组DNA中获得目的基因,双酶切后连接到荧光素酶报告基因载体上,构建C_3基因启动子报告基因载体.构建的pGL3-Basic-C_3-promotor重组质粒和内参质粒SV40瞬时转染Hela细胞,检测荧光素酶活性.结果表明,PCR扩增出C_3基因启动子片段;双酶切及测序鉴定重组体构建正确;转染Hela细胞后经双荧光素酶报告基因检测确定重组体有启动子活性.成功构建了C_3启动子报告基因载体,在细胞系中进行初步活性分析得知所克隆的C_3基因调控序列包含启动子活性区域.

人DRD1基因启动子区克隆和双荧光素酶报告基因系统的构建

背景:多巴胺受体启动子区多态性位点的改变会影响受体的表达量,进而影响多巴胺能神经递质的作用,导致相关疾病的发生。目的:通过克隆人DRD1基因的启动子区,构建含有该基因启动子序列的双荧光素酶报告基因载体并检测其活性,为研究DRD1基因的转录调控提供基础工具。方法:以人静脉血基因组DNA为模板,通过PCR扩增DRD1基因启动子序列并克隆至pG M-T载体,测序验证无误后酶切连接至萤火虫荧光素酶报告基因质粒pG L3-Basic,构建含有DRD1基因启动子的荧光素酶报告基因载体,采用阳离子脂质体法与内对照质粒pG L3-TK共转染HEK293细胞同时以不含启动子的pG L3-Basic载体与内对照质粒pG L3-TK共转染作为阴性对照组,化学发光仪检测相对荧光强度。结果与结论:(1)通过酶切和测序验证重组荧光素酶报告基因载体的DRD1基因启动子区序列正确;(2)与阴性对照组相比,该重组载体转染HEK293细胞后具有转录活性;(3)成功构建了含有DRD1基因启动子区的荧光素酶报告基因载体,为研究该基因的转录调控提供了基础工具。

人MTERF3基因启动子的克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

人MTERF3基因编码线粒体基因转录和能量代谢的负调控因子。采用PCR技术对人MTERF3基因5'侧翼上游1251 bp启动子序列进行扩增,并将其克隆至荧光素酶表达载体p GL6-TA,构建人MTERF3基因启动子荧光素酶报告基因质粒。经酶切、测序鉴定后,将其用脂质体转染体外培养的HEK293细胞株,利用双荧光素酶测定系统检测其表达活性。研究结果表明,克隆获得的1251 bp DNA序列与Gen Bank报道的一致,且插入方向正确。含人MTERF3基因启动子的报告基因荧光素酶的表达活性显著提高(P<0.05),约为对照组(空载体p GL6-TA)的9.8倍。本研究通过对人MTERF3基因启动子的克隆及其荧光素酶表达载体构建与表达活性的测定,为进一步阐明人MTERF3基因表达的调控机制奠定实验基础。

2个水稻PLT基因启动子的克隆及其表达分析

为研究水稻中PLT基因的表达及功能,利用同源序列分析,在水稻基因数据库中检索到2个与拟南芥PLT基因高度同源的基因序列,命名为OsPLT7和OsPLT11。根据进一步预测的PLT启动子序列设计引物,以水稻品种中花11的基因组DNA为模板,用PCR方法扩增得到PLT7、PLT11的启动子片段,克隆至含有报告基因的表达载体上并转化水稻。通过GUS染色观察T1代转基因阳性植株,发现OsPLT7和OsPLT11在水稻根部干细胞小生境和中柱部位表达,表达模式类似于其同源基因在拟南芥中的表达谱。

乳酸菌启动子探针载体的构建及其功能验证

以β-葡萄糖醛酸酶基因gusA作为报告基因,在乳酸菌表达载体pMG36e基础上,利用平滑化技术删除表达载体自带启动子P32,构建了乳酸菌启动子探针载体pMGPP。将已知的嗜酸乳杆菌S-layer蛋白基因启动子slpA插入到pMGPP无启动子的gusA基因上游验证其功能,GUS染色结果表明:pMGPP在大肠杆菌KW1和植物乳杆菌WQ0815中皆具有启动子探针载体的功能。因此,具有自主知识产权的启动子探针载体pMGPP的构建不仅为筛选乳酸菌启动子提供了有效的工具,同时为高效乳酸菌表达载体的构建奠定基础。

幽门螺杆菌CagA蛋白与CTB融合基因的克隆及其植物表达载体的构建

目的 构建能在水稻胚乳中特异表达的幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白(CagA)和霍乱毒素B亚单位(CTB)的植物表达载体.方法 采用高保真PCR技术分别从质粒pGEM CTB和幽门螺杆菌基因组DNA中扩增出CTB和cagA基因,然后用PCR方法直接融合CTB基因和cagA基因.又用PCR法改造了水稻Wx启动子,在其3′端融合加入Ω序列和Kozak序列.通过一系列亚克隆最终将两个融合基因和NOS终止子插入根癌农杆菌双元载体pCAMBI A1300的表达框架内.结果 PCR验证和测序分析证明,CTB和cagA融合基因以正确的方向插入到载体pCAMBI A1300中,并位于水稻Wx启动子后.结论 成功构建CTB和cagA融合基因的植物表达载体,为幽门螺杆菌口服疫苗的研究奠定基础.

以Insig-2基因启动子为靶点的药物筛选模型的建立

目的通过双荧光素酶报告基因检测系统建立以胰岛素诱导基因2(insulin-induced gene 2,Insig-2)启动子为靶点的药物筛选模型。方法将人Insig-2基因启动子序列克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,构建重组质粒pGL3-Insig-2并与内参质粒pRL-TK瞬时共转染工具细胞,通过检测荧光素酶报告基因表达水平的变化反映Insig-2基因启动子启动转录的活性,并对共转染质粒比例、工具细胞选择等条件进行探索和优化,相关药物处理进行验证。结果成功构建了重组质粒pGL3-Insig-2;确认pGL3-Insig-2:pRL-TK共转染比例为4∶1,确定3T3-L1细胞为工具细胞;1,25-(OH)2D3、小檗碱和姜黄素均能明显增强Insig-2基因启动子活性。结论成功建立了以Insig-2基因启动子为靶点的药物筛选模型,为筛选新型调脂药奠定基础。

粘虫中肠胰蛋白酶基因启动子的克隆及其功能分析

【目的】通过克隆粘虫Mythimna separata(Walker)(Lepidoptera:Noctuidae)中肠胰蛋白酶基因5′端侧翼启动子序列,并分析启动子功能,为进一步探索昆虫胰蛋白酶活性调控机制奠定基础。【方法】利用Genome Walking方法克隆粘虫中肠胰蛋白酶基因5′端侧翼启动子序列,运用在线分析软件NNPP v.2.2和数据库JASPAR进行序列分析,构建由胰蛋白酶基因启动子驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体,通过转染草地贪夜蛾sf21细胞系,瞬时表达后用双荧光素酶报告基因检测系统分析该启动子活性。【结果】克隆得到粘虫中肠胰蛋白酶基因5′端侧翼启动子序列1 863bp,其中含TATA框、CAAT框等启动子核心序列及GATA、STAT、C/EBP等转录调控元件。双荧光素酶报告基因检测系统分析表明,相对于空载体pGL3-Basic,所构建的重组载体p(-1 673/+25)具有明显的启动子活性。【结论】克隆得到的启动子片段明显具有启动报告基因表达的能力,可用于在胰蛋白酶基因启动子水平和转录因子水平研究杠柳新苷活性化合物的激活机理。

水稻碳酸酐酶基因5’端启动子不同区域对基因表达调控的研究

根据水稻碳酸酐酶基因5'端序列,从4处不同位置设计上游引物,在碳酸酐酶基因ATG前0位点处设计下游引物。通过PCR扩增基因5'端1600bp、964bp、585bp、313bp片段,将以上目的片段克隆到以GUS为报告基因的植物表达载体pBI121上,通过农杆菌介导法转化烟草。转化植株GUS活性检测结果,发现-1600～0bp片段启动GUS在烟草的叶、茎中有GUS活性,而其余3段区域(-964～0bp,-585～0bp,-313～0bp)未检测出GUS活性,这些暗示了-1600～0bp启动子区域在控制基因表达时,具有在叶、茎中表达,在根中不表达的组织特异性。

HCV核心蛋白抑制SFRP1基因启动子活性

目的探讨HCV核心蛋白对Wnt信号通路抑制分子SFRP1启动子活性的影响。方法以人肝癌细胞系Huh7基因组为模板,扩增SFRP1启动子区不同片段(-407～-27bp,-837～-27 bp,-1 202～-27 bp,-1 619～-27 bp,-2 029～-27 bp),以pGL3-Basic为载体分别构建SFRP1启动子区截短报告质粒。将构建好的质粒与pRL-TK共转染HEK293细胞,确定启动子区活性最强区域;分别用编码HCV核心蛋白的腺病毒或GFP对照腺病毒感染已转染重组报告质粒的SK-Hep1细胞,观察AdCore对SFRP1启动子活性的调控作用。结果 SFRP1启动子区域-407～-27 bp片段活性最强;与pGL3-Basic对照组相比较,相对荧光素酶活性增加了37.31±4.45倍(P<0.01),pGL3-S2～S5的活性分别增加了28.74±2.47、13.56±2.52、12.97±0.87和8.29±0.09倍(P<0.01);HCV Core蛋白能够抑制SFRP1基因启动子区活性,其对pGL3-S1的抑制作用最强,与GFP对照组相比较,抑制率为63.8%±1.0%(P<0.01)。结论 HCV核心蛋白通过抑制SFRP1启动子区活性下调SFRP1基因的表达,可能参与Wnt/β-catenin信号通路的活化,并与原发性肝癌的发生密切相关。

hAPG12-EGFP融合基因真核表达载体的构建及其在酵母中的表达

目的本研究旨在构建大肠杆菌-酿酒酵母真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12,并将构建好的载体转化到酵母。方法从pEGFP-C2中扩增出增强绿色荧光蛋白EGFP基因,定向亚克隆到真核表达载体pESC-URA;hAPG12插入到EGFP基因氨基末端;构建的载体转化到酵母。结果EGFP和hAPG12基因正确亚克隆到pESC-URA中,EGFP-hAPG12融合蛋白在酵母中表达。结论构建了具有报告基因及hAPG12的重组真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12。

NF-κB抑制剂和IFN-γ对BAFF-R基因启动子活性的影响

目的:探讨IFN-γ和NF-κB抑制剂对人BAFF-R基因启动子活性的影响。方法:以人全血基因组DNA为模板,PCR方法扩增得到BAFF-R基因转录起始点上游5’端-1562^+261 bp的片段,与荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic连接构建8个序列缺失质粒。将重组质粒瞬时转染人多发性骨髓瘤细胞株KM3,通过检测荧光素酶的相对活性,确定启动子活性最强的区域;分别用NF-κB抑制剂(BAY11-7082)和IFN-γ对活性最强的启动子进行干预,测定并比较荧光素酶的相对活性;同时RT-PCR检测干预前后BAFF-R基因mRNA的表达水平。结果:IFN-γ对BAFF-R基因启动子活性有促进作用并且可以上调BAFF-R mRNA的表达,NF-κB抑制剂(BAY11-7082)对BAFF-R基因启动子活性有抑制作用并且可以下调BAFF-R mRNA的表达。结论:IFN-γ和NF-κB信号通路参与了BAFF-R基因的转录调控,为进一步研究BAFF-R的调节机制提供了基本的依据。

Klotho基因启动子区域定位及活性分析

目的构建含不同长度klotho基因启动子片段的报告基因载体,研究其在不同细胞系中的转录活性。方法以人全血基因组DNA为模板,克隆长短不同的klotho基因启动子片段,命名为klothoⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ;分别克隆入荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic构建真核表达载体;采用Lipofectamine 2000将重组质粒分别和pRL-TK共转染HEK293和HeLa细胞,分析不同长度的klotho基因启动子片段在细胞内的转录活性。结果双酶切和测序鉴定均显示表达载体构建成功;klotho基因的核心启动子区域位于-504～-6;双荧光素酶活性检测显示klothoⅢ在2种细胞中的转录活性明显高于klothoⅠ、Ⅱ(P<0.05),而klothoⅣ的转录活性在HEK293细胞中能维持高水平,在HeLa细胞中显著下降(P<0.01)。结论 klotho基因启动子在不同细胞中的转录活性不同,-973～-504区域可能是导致HeLa细胞中klothoⅣ转录活性下降的原因。

阴道毛滴虫LAG1基因启动子区克隆及分析

本研究旨在克隆并分析阴道毛滴虫LAG1基因启动子,为进一步研究在细胞衰老过程中LAG1基因的转录调控提供实验资料。预测启动子所在区域,用PCR技术扩增启动子区序列,并分别克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic及增强型绿色荧光蛋白报告基因载体pEGFP-1,用脂质体介导的方法瞬时转染EC109细胞,然后测定荧光素酶表达活性及观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果表明在构建的6种荧光素酶报告基因表达体系及2种增强型绿色荧光蛋白报告基因表达体系中,表达载体pGL3-455(-455^+55bp)、pGL3-417(-417^+55bp)、pGL3-280(-280^+55bp)、pGL3-202(-202^+55bp)、pGL3-81(-81^+55bp)的荧光素酶表达活性相近,均明显高于表达载体pGL3-47(-47^+55bp)荧光素酶表达活性,而pGL3-47表达载体荧光素酶表达活性极低,与阴性对照活性相近,提示-47^+55bp区无启动子活性。绿色荧光蛋白的表达情况也类似,pEGFP-81(-81^+55bp)有明显的绿色荧光蛋白表达,而pEGFP-47(-47^+55bp)和空载体pEGFP-1未见表达。因此-81^-47bp区域含有阴道毛滴虫LAG1基因转录所必需的基本启动子序列。

白血病细胞中不同启动子驱动外源基因表达能力差异分析

为了分析不同启动子在白血病细胞中驱动外源基因表达能力的差异,文章选择了4种含不同启动子EF1α、PGK、Ubiquitin和CMV驱动的GFP报告基因的慢病毒载体,用以感染4种不同的白血病细胞株——NB4、HL60、Kasumi和THP1,利用荧光显微镜、流式细胞仪和荧光定量PCR的方法检测其GFP表达效率,发现EF1α启动子驱动GFP表达的能力最强,CMV最弱,PGK和Ubiquitin则介于两者之间。该结果提示在白血病细胞中研究基因功能时,应根据不同的研究需求选择最为合适的启动子。