一种基于lacZ基因和pUC复制子的原核启动子报告系统的构建及评价

为构建一种具有广泛适用性的原核启动子报告系统,以质粒pFLX107为骨架,通过多克隆位点替换和序列改造,构建出基于lacZ基因和pUC复制子的pFGH系列报告载体,然后以lacZ基因缺失株MC4100为宿主菌筛选背景活性最低的质粒作为最终的报告系统,并利用诱导型启动子araBAD和组成型启动子rpsM分别对其进行测试。结果显示,在所构建的pFGH系列质粒中,pFGH06的背景活性显著低于同系列其他质粒,在28℃培养条件下甚至显著低于低拷贝参考质粒pRCL的活性(P<0.01)。进一步的评估测试显示,质粒pFGH06可用于诱导型启动子或组成型启动子的克隆及活性测定,且在模拟应用于启动子筛选时,通过蓝白斑筛选即可实现对目标启动子的完全识别。与已报道的原核启动子报告系统相比,pFGH06具有体积小、克隆位点多、背景活性可调、对启动子筛选识别效率高等优点,具有广泛的应用前景。

p53对restin基因转录表达的调控作用

restin基因是Zhu等人从全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)诱导肿瘤细胞分化时克隆得到的一种黑色素瘤抗原相关基因．前期研究表明,该基因与细胞周期阻滞有关．由于p53在细胞增殖调控中占据重要地位,并且与维甲酸具有诱导关系,因此本研究试图揭示维甲酸诱导restin基因表达是否与p53有关．将p53转染真核细胞,研究restin与p53的表达关系．结果表明p53能诱导restin基因转录增加．进一步分析发现,restin基因5′端上游约2 kb基因组序列中存在p53蛋白结合位点．扩增该序列构建荧光报告系统,检测到该报告系统可以接受维甲酸的诱导调控．在此基础上,研究p53对缺失p53结合位点的截短体报告质粒和p53结合位点突变后的报告质粒的作用,结果显示p53调控restin基因的表达与该基因上游序列区中的p53结合位点无关,推测p53对restin基因的表达调控可能还存在其他分子的相互作用．