T细胞活力响应性启动子(TARP)萤光素酶报告系统在CAR⁃T细胞功能鉴定中的应用

目的将T细胞活力响应性启动子(TARP)纳米萤光素酶报告基因系统导入含有嵌合抗原受体(CAR)编码基因的慢病毒质粒中,为CAR⁃T细胞活化水平及功能鉴定提供一种便捷的、定量分析的方案。方法采用全基因合成及分子克隆技术构建重组质粒。慢病毒包装并感染人原代T淋巴细胞,流式细胞术检测慢病毒感染T细胞的阳性率。通过萤光素酶报告基因系统、Western blot法、流式细胞术、小动物活体成像技术鉴定CAR⁃T细胞的功能。结果酶切鉴定和质粒测序结果表明重组质粒的顺利构建,流式细胞术结果显示CAR⁃T细胞的正常制备,萤光素酶活力检测结果表明本系统能够动态响应CAR⁃T细胞的激活,体外功能实验证实本系统能够反映CAR⁃T细胞的耗竭状态,小动物活体成像结果体现了本系统在小鼠体内的示踪功能。结论TARP纳米萤光素酶报告基因系统为评估CAR⁃T细胞活化水平,耗竭状态以及体内示踪等方面提供了更加便捷、灵敏、定量分析的技术手段。

Development of a Transient Assay for Investigating the Activation of Pea Hsp70 Gene Promoter by Potyviral Cistrons

建立了一个瞬时表达系统以研究豌豆种传花叶病毒 (PSbMV ,一种马铃薯Y类病毒 )不同基因对豌豆(PisumsativumL .)Hsp70基因启动子激活能力的差异。构建了豌豆Hsp70基因启动子指导下的GUS基因的表达载体 ,同时还制备了 35S启动子指导下的PSbMVP1和P3基因的表达载体。以表达载体DNA包被的金粉做子弹 ,利用基因枪对豌豆离体叶片进行共轰击实验 ,结果表明 ,PSbMVP1和P3基因在激活豌豆Hsp70基因启动子的能力上存在明显差异。

国产水痘减毒活疫苗株即刻早期基因ORF62的特征

目的：通过比较国产水痘减毒活疫苗株（ vOka ）与其父系株（ pOka ）即刻早期基因（ IE） ORF62启动子区序列及其启动活力、编码区序列及其反式激活力差别，探讨vOka株ORF62突变在其减毒机制中的可能作用。方法分别构建pOka株、长春百克生物科技股份公司vOka-BK株、上海生物制品研究所vOka-SH株和葛兰素史克公司vOka-GSK株（对照） ORF62启动子-报告子质粒和ORF62编码区表达质粒，通过测序分析ORF62启动子区和编码区序列差异，再应用基因转染瞬时表达技术分析3株vOka与pOka株ORF62启动子活力及ORF62编码IE62对即刻早期基因ORF4、早期基因ORF28和晚期基因ORF67启动子的反式激活力差异。结果与pOka株比较，3株vOka 一致存在ORF62启动子区110050位点T缺失突变，该突变未导致启动子区的转录因子结合基序改变，但3株vOka ORF62启动子的启动活力显著低于pOka株；3株vOka ORF62编码区存在一致的碱基置换突变并分别产生SmaⅠ、NaeⅠ和BssHⅡ新酶切位点；除vOka-SH株IE62在CV-1细胞中对ORF4启动子的反式激活力显著低于pOka株外，3株vOka IE62在CV-1和MeWo细胞中对ORF4、ORF28、ORF67启动子的反式激活力均显著高于pOka株。结论3株vOka ORF62启动子区110050位点T缺失突变可能是启动子活力降低和IE62反式激活力改变的原因之一，vOka与pOka株ORF62启动子活力和IE62反式激活力差异与转染细胞类型关系不大。