厦门霉素生物合成基因簇在白色链霉菌及吸水链霉菌FR-008中的异源表达

将携带有厦门霉素生物合成的整合质粒p LMO09404,通过供体菌大肠杆菌ET12567(p UZ8002)与受体菌白色链霉菌及吸水链霉菌FR-008进行接合转移,将得到的接合转移菌株经PCR验证后进行发酵,发酵液经HPLC和质谱检测.结果显示,厦门链霉菌来源厦门霉素基因簇可以在白色链霉菌及吸水链霉菌FR-008中异源表达.

吸水链霉菌谷氨酰胺转氨酶突变体的构建和酶学性质表征

根据茂源链霉菌谷氨酰胺转氨酶点突变的结果,用重叠延伸PCR法构建了3个吸水链霉菌谷氨酰胺转氨酶突变体Tyr81ValGly82Asn、Tyr133Phe、Tyr360Ala,在巴斯德毕赤酵母GS115中表达并对其酶学特性进行了表征。结果表明,野生型和3个突变体的最适温度为40℃,最适pH 7;除了甘油外,其他有机试剂都降低了TGase的酶活力;与野生型相比,突变体Tyr81ValGly82Asn、Tyr133Phe和Tyr360Ala的比活力分别提高了9%、85%和30%;3个突变体与野生型相比,K_(m)、K_(cat)和K_(cat)/K_(m)值有所升高,表明突变可能降低了TGase与底物的亲和力,却加速了其催化效率。上述结果为通过点突变提高吸水链霉菌谷氨酰胺转氨酶酶活力提供了试验依据和途径。

吸水链霉菌井冈变种JG5008转化系统的初建

吸水链霉菌井冈变种JG5 0 0 8的最佳转化条件是 :JG5 0 0 8在添加MgCl2 (cf=0 .0 0 5mol/L)和甘氨酸 (ρf=0 .5g/L)的含 10 %蔗糖的YEME培养基中接种浓度n≈ 10 8mL-1的JG5 0 0 8孢子悬液 ,37℃摇床培养 12h ,收获菌丝体 .在 32℃、溶菌酶浓度 ρ =2mg/mL的条件下溶菌 1h后制备原生质体 ,用T缓冲液在R2 YE培养基上进行转化 .本文初步建立了JG5 0 0 8的质粒载体系统 ,包括不同来源的pIJ70 2、pIJ92 2、pCZA16 8、pHZ132等质粒载体 .感染实验证实 ,JG5 0 0 8对外源DNA具有较强的限制性 .图 1表 5参

响应面优化法提高吸水链霉菌株5-4拮抗香蕉枯萎病菌活性

为提高吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus菌株5-4的抑菌活性,以拮抗香蕉枯萎病菌(Foc TR4)的抑菌率为响应值,采用响应面三步法对菌株5-4的发酵条件进行优化,并测定观察其对Foc TR4病菌分生孢子萌发和菌丝生长的影响。结果表明,发酵条件优化后,吸水链霉菌株5-4的最优发酵培养条件为可溶性淀粉21.51 g/L,NaCl 4.73 g/L,接种量3.22%。该条件下菌株5-4发酵提取物500μg/mL处理对Foc TR4病菌的抑菌率大幅提高,抑菌率达到88.36%,比优化前的抑菌率54.96%提高60.77%;校正孢子萌发抑制率达到100%,比优化前的63.62%提高57.18%,且提取物处理的Foc TR4病菌的菌丝出现明显分叉、增生、肿大等现象。

响应面法优化吸水链霉菌产雷帕霉素发酵培养基

目的优化吸水链霉菌产雷帕霉素发酵培养基,提高雷帕霉素产量。方法利用Plackett-Burman试验设计筛选出培养基中影响雷帕霉素发酵产量的显著因素,爬坡试验确定主要因素的最适范围,响应面法确定各显著因素的最优水平。结果获得最优发酵培养基配方为:葡萄糖37.60 g/L、甘露醇30 g/L、黄豆粉28.37 g/L、硫酸铵1.25 g/L、磷酸氢二钾5 g/L、磷酸二氢钾5 g/L、L-赖氨酸1.5 g/L、复合氨基酸1.83 g/L。结论在最优发酵培养基培养下,雷帕霉素发酵水平由初始182.23 mg/L提高到279.56 mg/L,提高了53.41%。

吸水链霉菌应城变种种内融合子FR－008产生的新抗生素灭蚊幼的研究

本文报道吸水链霉菌应城变种种内融合子ＦＲ－００８产生的新抗生素（简称ＦＲ－００８抗生素）对３种蚊虫幼虫的灭蚊活性以及蚊龄、温度、紫外线对ＦＲ－００８抗生素灭蚊活性的影响。实验证明：ＦＲ－００８抗生素对３种蚊虫幼虫均有较强的致死作用。对３龄致倦库蚊、白纹伊蚊和中华按蚊幼虫的２４ｈＬＤ＿（５０）分别为１．３３０９μｇ／ｍｌ、２．０１１３μｇ／ｍｌ和２．８３１７μｇ／ｍｌ。不同虫龄对ＦＲ－００８抗生素的敏感性不同，１龄至２龄幼虫比４龄初幼虫敏感。ＦＲ－００８抗生素，在１９℃～３１℃之间，随温度升高灭蚊效果更好。紫外线照射可显著降低ＦＲ－００８抗生素的灭蚊活性。

质粒在大肠杆菌和吸水链霉菌井冈5008之间的属间接合转移

利用一个链霉菌──大肠杆菌双功能柯斯载体pHZ132建立了吸水链霉菌井冈变种5008（以下简称井冈5008）的属间接合转移系统．将携带pHZ132的大肠杆菌细胞LE392和携带RP4衍生质粒pRK2073的大肠杆菌细胞ED8768与萌发后的井冈5008孢子混合起来进行三亲本杂交，在接合性质粒RP4转移功能的诱导下，pHZ132即可从大肠杆菌细胞LE392转移到井冈5008孢子中去．所用培养基是利用2CM：LA=4：1（体积比）的混合培养基，井冈5008最佳孢子萌发时间为3.5～4小时．

氨基酸添加对吸水链霉菌5008发酵过程中有效霉素A合成的影响

氨基糖苷类抗生素的生物合成与氨基酸代谢密切相关,通过在吸水链霉菌5008发酵过程中分别添加9种不同种类氨基酸,研究了氨基酸对有效霉素A生物合成的影响。结果表明,在这9种氨基酸中,有7种氨基酸对有效霉素A产量有提升作用。其中异亮氨酸对产量提升幅度最大,与对照组相比,可以将产量提高约49%(16.76 g/L);同时发现甲硫氨酸对有效霉素A产量有着明显的抑制作用,与对照相比,将产量降低约25%(8.47 g/L);随后对添加氨基酸发酵过程中蛋白积累量,糖利用量以及有效霉素A前体合成相关碳代谢途径的酶活力情况进行检测,结果显示氨基酸能够影响碳代谢途径上关键酶的活性,导致碳代谢流向改变,从而促进有效霉素A前体的积累与有效霉素A的生物合成。

阿扎霉素B产生菌吸水链霉菌NND-52的诱变筛选

用紫外线 ,紫外线加氯化锂 (Li Cl)、吖啶橙 3种诱变方式对阿扎霉素 (Azalomycin) B产生菌 Strepto-myces hygroscopicus NND- 52菌株进行诱变处理 ,确定了它们的最佳诱变剂量 ,获得了数株 Azalomycin B产量较出发菌株提高 3倍以上的高产菌株 ,编号 Al3的菌株摇瓶产量达 110 0 mg/ L,且传代稳定。经过对 3种诱变方式的比校 ,发现后两种诱变方式对产量的提高更为有效。

吸水链霉菌NND-52菌株胞内抗生素M1分离、纯化及结构确定

吸水链霉菌 NND- 5 2菌丝体 ,经溶媒浸提 ,粗结晶 ,梯度洗脱的硅胶柱层析分离 ,纯化 ,得到主要组分 M1,通过对其基本理化性质分析和 UV、IR、1 H- NMR、1 3C- NMR、DEPT等波谱分析 ,确定其结构与阿扎霉素 B相同 。

两株能利用甲烷的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的分离和鉴定

分别从杭州华家池黄松田稻田土和浙江金华老黄筋泥稻田土中分离得到能利用甲烷的Z5 6 菌株和J2 6 菌株,通过形态特征、生理生化实验鉴定,初步认为 2菌株属于链霉菌属(Streptomyces)吸水类群(Hygroscopicus)的能氧化甲烷的菌株,暂命名为吸水链霉菌甲烷氧化菌株S.hygroscopicusstrainmethane oxidizingZ5 6 和S.hygroscopicusstrainmethane oxidizingJ2 6 。

多烯大环内酯类抗生素——链霉菌FR-008代谢产物的研究

链霉菌ＦＲ－００８ 是一株抗生素产生菌。发酵液经萃取、大孔树脂吸附、分配层析等方法处理，从中获得了一种七烯大环内酯类抗生素，即抗生素ＦＲ－００８。ＨＰＬＣ分析研究表明，它与灰色链霉菌ＩＭＲＵ ３５７０产生的杀假丝菌素是同一种物质，均含有４个保留时间完全相同的主要组分。其中抗生素ＦＲ－００８ｂ 经核磁共振（ＮＭＲ）研究被证实为杀假丝菌素Ｄ；ＦＲ－００８ａ也经１Ｈ－ＮＭＲ的比较分析提出了它的可能结构。

紫黑吸水链霉菌Streptomyces violaceoniger-hygroscopicus发酵代谢产物对几种常见果蔬病原菌的拮抗活性

从南昌地区不同土质中采得约300份土样,用平板分离法筛选得到8株放线菌,经分类鉴定,其形态,培养特性,生理生化特性与紫黑吸水链霉菌形似,命名为紫黑吸水链霉菌Streptomycesviolaceoniger-hygroscopicus。用其发酵液对果蔬病原真菌—青椒疫霉病菌Phytophthoracapsici,番茄灰病菌Botrytiscinerea,黄瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum,黄瓜灰霉病菌BotrytiscinereaPers,苹果黑星病菌Venturiainaeualis,白菜黑斑病菌Alternariabrassicae等进行拮抗实验研究,结果表明有2株菌株的发酵液对青椒疫霉病菌有明显的抑制作用,1株对黄瓜枯萎病菌有较好的抑制作用,1株对番茄灰霉病菌有一定的抑制效果。

透明颤菌血红蛋白基因在吸水链霉菌NND-52-C中的克隆与表达

将透明颤菌血红蛋白基因 (vgb基因 )克隆至链霉菌的质粒载体pIJ70 2中 ,构建成表达载体pLY70 2 ,并将pLY70 2质粒转化阿扎霉素B的高产菌株———吸水链霉菌NND 5 2 C的原生质体 ,获得转化子H。经发酵实验表明 ,在限氧的条件下 ,可以使NND 5 2 C菌株的生物量提高 14 4 % ,阿扎霉素B的产量提高 30 8%。

反相高效液相谱型分析检测吸水链霉菌17997变株发酵新产物

以吸水链霉菌17997为出发菌株,分别阻断格尔德霉素(geldanamycin,GA)生物合成酶基因簇中的I型聚酮合酶(type I polyketide synthase,pks)基因的第6模块,单加氧酶(monooxygenase,gdmM)基因和氨甲酰基转移酶(carbamoyltransferase,ct)基因得到3种变株(pks-)、(gdmM-)和(ct-)。比较变株与原株发酵产物的H PLC谱型,结合紫外吸收图谱分析。检测结果表明各变株的GA生物合成均被阻断,并产生3个不同于原始菌株的新物质。这证明基因操作所涉及的pks,gdm M和ct基因是GA生物合成的必需基因;这些基因的阻断可产生不同于原株的新物质。HPLC谱型比较可以在多样化代谢产物的产生菌中快速、准确地发现基因工程变株发酵产物的变化,指导新化合物的分离鉴定,样品用量甚微,是化学早期鉴别的有力工具。

不吸水链霉菌基因文库的构建及初步筛选

采用碱裂解法从不吸水链霉菌提取染色体DNA,用Sau3AI对染色体DNA进行部分水解,利用透析袋法回收3.5～9kb之间的DNA片段。以pUC18为载体,用BamHI对其进行酶切,再用热敏磷酸酶去磷酸化,酶切产物与外源DNA按一定比例混合后,加入T4DNA连接酶进行连接。连接产物用受体菌E.coliDH5α进行转化,根据α-互补性质产生的颜色反应,挑选白色菌落,构建了相应的不吸水链霉菌基因文库。分别利用特异性探针2-1-1及1-2-1对不吸水链霉菌基因文库进行筛选,利用DIG-Ⅱ-dUTP对特异性探针进行标记,与基因文库中的阳性转化子进行Southern杂交,通过显色反应对杂交结果进行检测,由于时间关系,暂未筛选出阳性克隆,但这些工作对以后的相关实验研究具有很好的借鉴作用。

探讨不同剂量嗜热吸水链霉菌抗原诱导大棚肺动物模型

目的探讨不同剂量嗜热吸水链霉菌抗原是否能引起豚鼠大棚肺,及制作大棚肺动物模型的方法及最适宜的嗜热吸水链霉菌抗原剂量。方法 40只成年豚鼠随机分为A、B、C、D组,每组10只。B、C、D组为模型组,分别予嗜热吸水链霉菌抗原制剂1.0 mg(0.2 ml)1、.5 mg(0.3 ml)2、.0 mg(0.4 ml)3种剂量鼻内滴注;A组为对照组,予0.9%无菌生理盐水0.3 ml鼻内滴注。每周连续滴注3 d,连续滴注12周。结果 B组于第2周末,C、D组均于第1周末出现明显肺泡炎改变;B组于第4周末、C组于第3周末、D组于第2周末可见肉芽肿形成;C组在12周末可观察到肺成纤维细胞数目增多,B组无明显纤维化改变,D组豚鼠多在第3周因肺部感染死亡。模型组CT影像上均可见弥漫性磨玻璃影,后可见双肺多发性、边缘模糊的斑片状及微小结节状影,多呈小叶中心型。模型组肺组织均可见嗜热吸水链球菌生长。结论嗜热吸水链霉菌抗原可以在豚鼠引起典型大棚肺病变。1.5 mg(0.3ml)可作为构建嗜热吸水链霉菌抗原诱导的大棚肺动物模型的标准剂量。

吸水链霉菌应城变种的四个内源质粒及其逐个消除的研究

在改良质粒DNA提取方法的基础上,从三种农用抗生素的同一产生菌——吸水链霉菌应城变种中同时发现四个内源质粒,用双向电泳技术确定了它们均为CCC构型,根据分子量从大到小的顺序将它们分别命名为pHZ1、pHZ2、pHZ3和pHZ4,与已知分子量的CCC质粒分子同步电泳估计它们的分子量依次分别为61kb、4.7kb、4.1kb和3.3kb,基于这四个内源质粒中至少部分个体可能为接合性质粒,可在没有某个质粒的衍生菌株的菌坪上形成“麻点”的假设,我们分离和鉴定了三个质粒逐个消除的10-22衍生菌株,并在光学显微镜下确证了二种类型的麻点。

吸水链霉菌M-22产生的除草剂的研究

利用竞争性抑制谷氨酰胺生物合成的方法，从福州郊区土壤中分离到除草活性物质产生菌Ｍ－２２，其特征与除草剂双丙磷（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）产生菌吸水链霉菌ＳＦ－１２９３相近，Ｍ－２２代谢产物ＦＭ－２２经光谱分析证明与双丙磷同质。

吸水链霉菌17997产生的4,5-双氢格尔德霉素的鉴别与检测

本文对从吸水链霉菌17997发酵提取获得的格尔德霉素精制品进行了LC-MS-MS分析,发现其中含有4,5-双氢格尔德霉素组分。对吸水链霉菌17997摇瓶发酵产物的硅胶板薄层层析分析表明,4,5-双氢格尔德霉素组分在发酵中期有积累。已知4,5-双氢格尔德霉素的抗肿瘤活性比格尔德霉素差,因而需要限制其在格尔德霉素制品中的含量。本文研究结果对以吸水链霉菌17997等为产生菌研究格尔德霉素发酵,促进4,5-双氢格尔德霉素转化为格尔德霉素以提高发酵液的品质,以及检测格尔德霉素制品中的4,5-双氢格尔德霉素组分具有实际意义。