酶联免疫法测定水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ的残留

运用酶联免疫法对水产品中呋喃唑酮代谢物残留测定的方法进行研究。结果表明，稀释倍数对回收率影响显著，而乙酸乙酯提取次数、光照条件和放置时间对测定结果无显著影响。向样品中分别添加0．60、2．00、6．00μg·kg^-1 3个浓度水平的呋喃唑酮代谢物时，平均回收率分别为99．2％、96．0％和100．0％；批内变异系数为1．76％～12．57％，批间变异系数为5．43％～8．58％，最低检测限为0．3μg·k^-1。该方法灵敏度高，重复性较好，适用于水产品中呋喃唑酮代谢物残留的筛选。

酶联技术在水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ的检测中的应用

用酶联免疫检验技术(ELISA)检测呋喃唑酮(Furazolidone)代谢物AOZ。AOZ经过16h的衍生后和酶联结合物对微孔中的抗体进行竞争反应,利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的基本原理,在酶标仪上450nm处测定吸光强度,进行定性定量分析。

草鱼肌肉中呋喃唑酮代谢物AOZ检测能力验证样品的制备研究

为解决现行水产品药物残留检测能力验证样品制备方式单一,现用能力验证样品实际检测分析难度与真实样品之间存在差距的现实问题,实验采用药浴给药的方式,研究了水温、药浴时间等因素对草鱼肌肉中AOZ残留浓度的影响。结果显示:在水温25℃、鱼体规格900~1 100 g、药浴10 h的条件下,草鱼肌肉中AOZ含量变化相对平稳,确立的药浴初始浓度x(μg/L)与草鱼肌肉中残留的AOZ浓度y(μg/kg)之间简单关式为y=0.22x。在此条件下制备了AOZ残留浓度为10.0μg/kg的能力验证样品,采用液相色谱-串联质谱法对样品的均匀性和稳定性进行了评价。样品检测结果均匀性和稳定性良好,符合能力验证样品的要求。

水产品中呋喃唑酮代谢物快速检测准确率影响因素分析

呋喃唑酮对人体有致癌、致畸副作用,农业部公告第250号《食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单》中规定硝基呋喃类药物及其代谢物为禁用药物,在动物性食品中不得检出.呋喃唑酮属于硝基呋喃类广谱抗生素,曾被应用于水产养殖业.

酶联免疫(ELISA)法测定水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ的残留

采用MaxsignalTM AOZ快速检测试剂盒检测水产品中呋喃唑酮代谢物。通过对精密度、回收率和检测限等项目的测定,验证了方法的可行性。呋喃唑酮代谢物标准液在0.05ng/mL^4.5ng/mL范围内具有良好的线性,微孔板孔间变异系数为3.2%~7.7%。样品批内变异系数为5.2%~8.4%,批间变异系数为6.3%~8.9%,平均回收率为94.5%~98.4%。试剂盒的理论检测下限为0.05μg/Kg。该方法灵敏度高,重复性好,适用于水产品中呋喃唑酮代谢物残留的检测。

禽蛋中呋喃唑酮代谢物(AOZ)残留量的酶联免疫检测

采用酶联免疫方法对禽蛋中呋喃唑酮代谢物(AOZ)残留量进行检测,随机抽取20个禽蛋样品进行处理,样品经2-硝基苯甲醛衍生化并用乙酸乙酯提取AOZ。通过样品中残留的AOZ和酶标板上预包被的抗原竞争抗体,加入酶标二抗后与底物显色,测得禽蛋中AOZ的残留量。检测结果为18个阴性样,2个阳性样,经液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)比对试验,样品阴、阳性判断结果一致,且与阳性样测定结果相符。综上,酶联免疫法能够实现禽蛋中AOZ残留量的准确检测。

呋喃唑酮代谢物人工抗原的制备与鉴定

制备了呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-噁唑烷酮(AOZ)的人工抗原,再采用重氮法将AOZ衍生物2-NP-AOZ与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备免疫原2-NP-AOZ-BSA和包被原2-NP-AOZ-OVA,通过SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS分析其偶联效果。以2-NP-AOZ-BSA皮下注射免疫SPF级BALB/c小鼠,分别于3次免疫和5次免疫后制备血清,以间接ELISA检测血清中2-NP-AOZ抗体效价,间接竞争ELISA检测血清敏感性,鉴定其免疫原性。发现2-NP-AOZ分别与BSA和OVA偶联成功,获得免疫原2-NP-AOZ-BSA和包被原2-NP-AOZ-OVA;MALDI-TOF-MS分析测得偶联率分别为7.1∶1、3.8∶1;BCA试剂盒检测2-NP-AOZ-BSA、2-NP-AOZ-OVA的浓度分别为4.9、5.2 mg/mL。间接ELISA检测3次免疫后小鼠血清抗体效价均达1∶16000及以上,5次免疫后血清抗体效价均达1∶32000及以上;半数抑制浓度(IC_(50))为34.43 ng/mL,人工抗原2-NP-AOZ-BSA免疫原性优良。本研究成功合成了AOZ完全抗原,为AOZ单克隆抗体制备及快速检测方法的建立奠定了基础。

呋喃唑酮代谢物荧光纳米颗粒免疫层析法的建立

研究将荧光纳米颗粒与呋喃唑酮代谢物单克隆抗体共价耦联在一起,以竞争法作为反应模式来制备呋喃唑酮代谢物免疫层析试纸条。所制备的免疫层析试纸条仅与呋喃唑酮代谢物AOZ有交叉反应,而与非目标检测物之间无交叉反应,其灵敏性达1.0ng/mL,可满足相关检测标准要求。并且通过肉眼观察检测线和质控线之间的亮度,还可对AOZ进行半定量检测。该试纸条可用于食品中呋喃唑酮代谢物的检测。

呋喃唑酮代谢物在杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)体内的残留消除规律

近几年中国农业部监督抽查的结果显示，硝基呋喃类残留仍是养殖水产品中检出率较高的隐患之一。由于缺乏硝基呋喃在养殖动物体内蓄积和残留消除规律等基础数据，不能明确药物残留的具体来源和时间，使管理者在决策中缺乏依据，难以明确监管和执法的重点。在模拟自然养殖条件下，研究了呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮（AOZ）在杂交鳢（斑鳢Channa maculata♀×乌鳢Channaargus♂）体内的残留及消除规律。在35±2．5℃水温条件下，对杂交鳢苗种按2％体重的量投喂含3％0呋喃唑酮的药饵，每天投喂3次，连续投喂5d。从投喂开始于0．5、1、2、4、8、12、24、48、96、192、288、384、480、720、960、1200、1440、1920、2400、2880、3600h取样，采用液质联用（HPLC-MS）方法测定肌肉中AOZ的含量。结果表明，从给药开始0．5-24h，肌肉中AOZ含量从800．18±8．45μg/kg逐渐升高至5686．65±11．16IXg／kg；在48～96h，肌肉中的AOZ残留量变化不大，维持在5420．65±10．81至5390．08±7．24μg/kg之间；停止给药后2880h（120d）低于检测限0．5μg/kg。结果表明，由于呋喃唑酮在杂交鳢体内的代谢时间较长，建议政府及相关部门加大对该种禁用药物的监督抽查力度。

呋喃唑酮代谢物人工抗原的合成及抗体的制备

为改进和完善免疫检测呋喃唑酮代谢物方法,制备了抗呋喃唑酮代谢物(AOZ)特异性抗体。采用对醛基苯甲酸对AOZ进行衍生化得到CPAOZ,还原CPAOZ结构中的C=N双键得到半抗原,半抗原用N-羟基琥珀酰亚胺活化酯法与BSA偶联制备免疫原,免疫新西兰大白兔制得特异性抗体,采用间接(竞争)ELISA法评价抗血清效价及特异性。结果显示,试验获得了较高效价(1∶1280000)的抗AOZ血清,AOZ半抑制浓度为5.9 ng/mL;抗血清与结构类似物呋喃它酮代谢物的交叉反应率仅为0.76%,与呋喃妥因代谢物和呋喃西林代谢物无交叉反应;利用该抗体建立的间接竞争ELISA检测法,AOZ在1～27 ng/mL与抑制率呈线性关系。结果表明,该特抗体虽然灵敏度较低,却对AOZ而非AOZ衍生物有特异性,可为畜产品中AOZ残留检测提供新的思路和方法。

呋喃唑酮代谢物直接竞争化学发光检测方法的建立

目的:建立呋喃唑酮代谢物(AOZ)直接竞争化学发光检测方法,用于新疆水产品呋喃唑酮残留检测。方法:采用碳二亚胺法将AOZ与对醛基苯甲酸反应生成物CPAOZ与HRP偶联成酶标物CPAOZ-HRP,加之CPAOZ单克隆抗体,建立AOZ直接竞争化学发光检测方法(CLIA);运用高效液相色谱法(HPLC)和AOZ-CLIA检测新疆罗非鱼样品中AOZ的残留情况。结果:以1∶6000CPZOA单克隆抗体稀释度为最佳包被浓度,1∶64000CPAOZ-HRP稀释浓度为最佳检测浓度,建立AOZ-CLIA方法,其标准曲线呈线性,线性范围0.0527~8.5ng/mL,IC50为0.235ng/mL;该方法能特异性检测AOZ,与其他药物无交叉反应;样品最低检出限为0.0509μg/kg,样品添加回收率为87.2%~95.0%;新疆罗非鱼AOZ-CLIA检测结果与HPLC结果完全一致,均未检测出超标样本。结论:建立的AOZ-CLIA检测方法能满足新疆水产品呋喃唑酮残留检测。

水解衍生-酶联免疫分析在动物肌肉中呋喃唑酮代谢物残留量检测中的应用

目的:优化并评估了水解衍生-酶联免疫方法在测定动物肌肉中抗生素呋喃唑酮代谢后结合残留物中的应用。方法:样品中的呋喃唑酮代谢物3-氨基-唑烷酮(3-amino-2-oxazolidone,AOZ)的蛋白结合残留物经酸水解释放 AOZ,经2-硝基苯甲醛(2-nitrobenzaldehyde,NBA)衍生生成3{[(2-nitrophenyl)methylene]-amino}-2-oxazolidinone(NPAOZ)后,调 pH 至7.2-7.4,经乙酸乙酯萃取后,10min/4000r·min^(-1)离心取上层氮气流于30℃吹干并用缓冲液溶解,正己烷脱脂后取下层水相进行 NPAOZ 的竞争性酶联免疫吸附分析(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。结果:方法定量检测限为200ng·kg^(-1),样本加标水平为1.0μg·kg^(-1)时,回收率在85%以上。实际样本对照实验显示 AOZ 质量浓度>1.0μg·kg^(-1)时,方法与 LC-MS-MS 结果的相对误差<25%。结论:此方法可实现动物肌肉中呋喃唑酮代谢物残留量的高通量筛选。

高效液相色谱-串联质谱法检测鸡蛋中呋喃唑酮代谢物的残留

鸡蛋经盐酸水解,将蛋白中结合的呋喃唑酮代谢物(AOZ)释放出来,经2-硝基苯甲醛37℃衍生过夜,调节pH值约为7.0,用乙酸乙酯萃取,有机相浓缩,用流动相溶解后过0.2μm滤膜过滤后于液质联用仪上进行测定。采用电喷雾,选用反应监测模式检测,外标法定量。AOZ标准工作液在0.05～5.00μg/L范围内线性良好,其线性方程为Y=37978.5+1490123.9X,线性关系r=0.9998。AOZ在0.5、1.0、2.0、4.0μg/kg的回收率基本都在60%以上,对于经过水解提取衍生过程,回收率良好,批内RSD(相对标准差)均小于16%,精密度良好;批间RSD均小于12%,再现性良好,最低检测限为0.05μg/L。

胶体金免疫层析法快速测定动物源食品中的呋喃唑酮代谢物残留

本研究从优化呋喃唑酮代谢物免疫抗原、包被抗原的结构及优化偶联技术角度出发，提高呋喃唑酮抗体的特异性、亲和力，并通过优化样品前处理步骤，最终得到呋喃唑酮代谢物胶体金免疫层析试纸条的检测低限为1．0μg／kg，特异性好，稳定性高。

呋喃唑酮代谢物人工抗原的合成及半抗原偶联比的测定

[目的]合成呋喃唑酮代谢物人工抗原,并测定该半抗原偶联比。[方法]通过混合酸酐法将羧基化改造的小分子抗原AOZ与HSA偶联后,运用紫外光谱分析判断合成的结果,并计算小分子抗原与蛋白的偶联比率。[结果]该试验成功合成了呋喃唑酮代谢物AOZ,对其进行羧基化改造后与载体蛋白HSA成功偶联,偶联比经测定为4∶1。[结论]利用紫外光谱分析测定小分子抗原偶联比率的方法简便,可靠性强。

酶联免疫法与LC-MS/MS法测定水产品中呋喃唑酮代谢物

运用酶联免疫法和LC-MS/MS法对水产品中呋喃唑酮代谢物残留进行测定。样品经2-硝基苯甲醛衍生化并用乙酸乙酯提取。向样品中分别添加0.60、2.00、6.00μg/kg三个浓度水平的呋喃唑酮代谢物时,酶联免疫法平均回收率分别为99.2%、96.0%和100.0%,变异系数(RSD)为1.8%～12.6%,最低检测限为0.3μg/kg。LC-MS/MS法平均回收率分别为90.8%、94.3%和86.3%,RSD为6.2%～14.3%,最低检测限为0.1μg/kg。用酶联免疫法对150个样品进行检测,筛选出3个阳性样品,经LC-MS/MS确证为阳性,未发现假阳性样品,且测定结果基本一致。研究表明酶联免疫法重复性较好、准确度较高,是一种水产品中呋喃唑酮代谢物残留的快速筛选方法;液-质/质联用法灵敏度高,适用于阳性样品的确证和精确定量。

呋喃唑酮代谢物抗体的制备与筛查

利用呋喃唑酮的4种代谢物合成免疫原以及包被原,用4种免疫原各免疫两只新西兰大白兔,得到8份抗血清,再纯化抗血清。采用间接ELISA方法,筛选出OD值明显高于阴性样本的血清用于以后的实验,同时对抗体的效价进行测定。实验检测结果表明,当用包被原A和包被原B包被酶标板时,7号和8号抗血清对该包被抗原有很好的亲和性,呋喃唑酮代谢物衍生物对抗体有很好的抑制。通过效价检测,7号和8号抗血清均具有高效价、高特异性的特点,其中8号抗血清的效价更高,亲和力更强。再通过进一步对两种包被原和两份抗血清进行筛查,选择B包被原和8号兔子的抗体清用于ELISA法的建立。

液相色谱-串联质谱法快速检测刺参中硝基呋喃类代谢物方法

硝基呋喃类药物是一种人工合成的具有5-硝基呋喃基本结构的广谱抗生素,常见有呋喃唑酮(FZD)、呋喃西林(NFZ)、呋喃妥因(NFT)和呋喃它酮(FTD)。经研究发现,该类药物在动物体内快速分解产生的代谢物可与动物体内蛋白质结合而长时间稳定存在,对人体产生“三致”潜在危害(肖曼等,2020)。随着刺参大规模人工养殖的发展,粗放的养殖管理以及高密度养殖等原因导致病害等问题接踵而至。

抗呋喃唑酮代谢物单克隆抗体的制备

硝基呋喃类药物具有广谱抗菌作用,广泛应用于家禽细菌性传染病的防治,但其在动物体内残留的代谢产物,对人体具有致癌、致突变的特性。研究将硝基呋喃类药物呋喃唑酮上的硝基还原为氨基,再将还原产物与载体蛋白用重氮化法进行偶联,从而获得呋喃唑酮代谢物(AOZ)的免疫抗原和检测抗原。用免疫抗原免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合、克隆筛选、扩大培养、动物体内诱生腹水等过程,获得了抗AOZ的单克隆抗体,并通过建立间接ELISA方法对获得的单克隆抗体进行鉴定。研究结果为开发AOZ的ELISA检测试剂盒奠定了基础。