牛肉中呋喃妥因代谢物(AOZ)液相色谱/串联质谱法测定不确定度评定报告

根据RB/T 214中4.5.15测量不确定度的要求,检验检测机构应根据需要建立和保持应用评定测量不确定度的程序。检验检测机构应建立相应数学模型,给出相应检验检测能力的评定测量不确定度案例,检验检测机构可在检验检测出现临界值、内部质量控制或客户有要求时,报告测量不确定度。面对新的要求,实验室应该对检测结果做出不确定度评定,我实验室今年在CMA计量认证中成功扩项了《GB/T 21311-2007动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱/串联质谱法》,依此方法建立了一个以呋喃妥因代谢物(AOZ)为例的不确定度典型案例,希望以此开辟先河,完善实验室建设,为其他单位实验室相关检测的开展与实施提供参考。

ELISA方法检测呋喃妥因代谢物1-氨基乙内酰脲

建立了一种检测呋喃妥因代谢物1-氨基乙内酰脲(1-aminohydantoin,AHD)的酶联免疫方法,并对其进行了优化;得到IC50为3.6ng/mL,检测限为0.085ng/mL。此外,检测了与其他类似物的交叉反应率,显示了很好的特异性;并且通过对猪肉样品添加回收率的测定,证明了该方法的准确性。

酶联技术在水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ的检测中的应用

用酶联免疫检验技术(ELISA)检测呋喃唑酮(Furazolidone)代谢物AOZ。AOZ经过16h的衍生后和酶联结合物对微孔中的抗体进行竞争反应,利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的基本原理,在酶标仪上450nm处测定吸光强度,进行定性定量分析。

呋喃妥因残留代谢物人工抗原的合成与鉴定

利用对醛基苯甲酸对呋喃妥因代谢物1-氨基乙内酰脲(1-Aminohydantoin hydrochloride,AHD)进行衍生化,衍生物1-氨基乙内酰脲-4-羧苯基肟(CPAHD)通过混合酸酐法与牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)偶联,用紫外扫描(UV)和变性凝胶电泳(SDS-PAGE)对偶联物进行验证。将偶联成功的人工全抗原(CPAHD-BSA)免疫BALB/c小鼠,通过间接酶联免疫吸附法(ELISA)测定小鼠血清抗体效价为1:32 000。用间接竞争ELISA鉴定抗体特性,结果显示:抗体对AHD与对硝基苯甲醛的衍生物(NPAHD)的灵敏度高,IC50为30.63μg/L,特异性好,与CPAHD有部分交叉反应外,与其他3类硝基呋喃类药物及代谢产物无交叉反应(交叉反应率<0.01%)。结果表明,用CPAHD-BSA作免疫原免疫小鼠可诱导产生针对AHD衍生物(NPAHD)的特异性抗体,为进一步制备AHD单克隆抗体和研制快速筛选检测试剂盒奠定了基础。

直接竞争酶联免疫法测定呋喃妥因代谢物

目的建立动物组织中呋喃妥因代谢物1-氨基乙内酰脲的直接竞争酶联免疫(ELISA)检测法,为检测食品中呋喃妥因代谢物残留提供快速检测的方法。方法采用活化酯法制备辣根过氧化物酶标记抗原,并用棋盘法确定酶标抗原和抗体的稀释度,优化反应条件,建立检测呋喃妥因代谢物的直接竞争酶联免疫法,并对其进行方法学评价。结果该方法的线性方程为Y=-34.723X+158.01(r2=0.9922),线性检测范围为0.177~11.508ng/m L,IC50为1.291 ng/m L;猪肉、鸡肉、鱼肉的最低检测限分别为0.115、0.113、0.109μg/kg,加标回收率在82.6%~104.7%之间,批内变异系数在3.6%~9.3%之间,批间变异系数在4.3%~12.4%之间。结论本方法快速准确,适用于动物组织中呋喃妥因代谢物的检测。

呋喃妥因代谢物化学发光酶联免疫检测方法的研究

对呋喃妥因代谢物1－氨基乙内酰脲（ AHD）进行半抗原改造，采用活化酯法将半抗原与卵清蛋白（ OVA）偶联为包被原，与标准品竞争AHD单克隆抗体的抗原结合位点，加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗，建立了AHD间接竞争化学发光酶联免疫（ CLEIA）检测法，并对化学发光液、包被原与抗体最优稀释度、包被条件、封闭液和竞争时间五项参数进行优化。结果表明：该方法具有良好的特异性， IC50为0．753 ng／mL，在鸡肉组织中的检测限为0．028μg／kg，添加回收率在80．54％～102．64％之间，变异系数均小于10％。与国标中液相色谱－串联质谱法（ LC－MS／MS）和我国出入境行业标准中酶联免疫检测法（ ELISA）相比，不仅降低了检测限，而且操作简便，为动物源性食品中呋喃妥因代谢物的残留提供了准确、便捷的分析检测手段。

胶体金免疫层析法快速检测水产品中呋喃妥因代谢物残留

采用胶体金免疫层析技术(GICA)测定水产品中的呋喃妥因代谢物残留,并用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对实验结果进行确证。结果显示,胶体金免疫层析法的检测限为1.0μg/kg,假阳性率不大于5%,假阴性率为0;对实际样本的检测结果与LC-MS/MS法一致。研究表明,胶体金试纸条法操作简便、快速,成本低,为水产品中呋喃妥因代谢物的残留检测提供了快速筛选方法,而LC-MS/MS法灵敏度高,结果准确,适用于阳性样本的确证和精确定量。

胶体金免疫层析法快速检测食品中呋喃妥因及其代谢物残留

本文采用胶体金免疫层析技术测定测定食品中的呋喃妥因及其代谢物残留,结果显示胶体金免疫层析法的检测限为0. 5μg/kg,假阳率不大于5%,假阴率为0,研究表明胶体金试纸条法操作简便、快速、成本低,是食品中呋喃妥因代谢物的残留检测提供了快速筛选方法。

动物组织中呋喃妥因代谢物残留酶联免疫试剂盒的研制

通过对呋喃妥因代谢物分子结构进行改造,制备了半抗原及人工抗原,免疫动物,制备特异性强的单克隆抗体。在筛选呋喃妥因代谢物单克隆抗体的基础上,建立酶联免疫检测方法,并研制出检测动物组织中呋喃妥因代谢物残留的试剂盒。该试剂盒的IC50值为0.094μg/L,最低检测限为0.1μg/kg,样本添加回收率为78.2%～102.7%,变异系数为5.1%～11.4%;与呋喃妥因的交叉反应率为13%,与其他药物的交叉反应率均小于1%;对实际样本的检测结果与液相色谱-串联质谱法基本一致。该方法快速、灵敏、可靠,为动物组织中呋喃妥因代谢物的残留检测提供了便捷、准确的分析检测手段。

呋喃妥因代谢物CLIA试剂盒对畜禽及水产品的验证研究

目的验证呋喃妥因代谢物CLIA检测试剂盒的检测效果。方法用化学发光微粒子免疫法和高效液相色谱-串联质谱法分别对市售猪肉、鸡肉、鱼肉、虾肉4种样品中呋喃妥因代谢物残留量进行检测,比对两种方法试验结果间的差异。结果该试剂盒对4种样品的最低检测限分别为69.37、67.86、67.52、69.09 ng/kg,试剂盒板内板间变异系数均小于10%;对4种样品做加标回收试验,其回收率均在90%~105%之间,变异系数均小于10%;该方法与高效液相色谱法检测实际样品的阴、阳性判断结果一致。结论该方法稳定、可靠,可满足食品中呋喃妥因代谢物残留快速检测的需要。

酶联免疫(ELISA)法测定水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ的残留

采用MaxsignalTM AOZ快速检测试剂盒检测水产品中呋喃唑酮代谢物。通过对精密度、回收率和检测限等项目的测定,验证了方法的可行性。呋喃唑酮代谢物标准液在0.05ng/mL^4.5ng/mL范围内具有良好的线性,微孔板孔间变异系数为3.2%~7.7%。样品批内变异系数为5.2%~8.4%,批间变异系数为6.3%~8.9%,平均回收率为94.5%~98.4%。试剂盒的理论检测下限为0.05μg/Kg。该方法灵敏度高,重复性好,适用于水产品中呋喃唑酮代谢物残留的检测。

酶联免疫法测定生猪肉中呋喃妥因代谢物的残留量

用竞争酶联免疫(ELISA)法测定生猪肉中呋喃妥因代谢物(AHD:1-氨基-2-内酰脲)残留量,本文概述了酶联免疫法检测的基本原理、步骤,并在我所长期进行酶联免疫法检测的基础上,提出了几点关键性的注意事项,本法操作简单快捷、灵敏准确、方便实用,可作为生猪肉中呋喃妥因代谢物残留量检测的快速筛选方法。

高效液相色谱-串联质谱研究呋喃妥因代谢物在鲫鱼体内的残留消除规律

采用HPLC-MS/MS研究呋喃妥因代谢物1-氨基乙内酰脲(AHD)在鲫鱼体内的残留消除规律。在22±1℃的水温下,模拟自然养殖条件,用质量浓度为100 ng·mL^(-1)的呋喃妥因药浴鲫鱼12 h,停止药浴后,对鲫鱼体内残留的AHD进行测定,并对鲫鱼内脏样品的提取进行除脂优化。研究结果显示,内脏经正己烷除脂后,加标回收率明显升高,为89.5%~110.2%;AHD在鲫鱼体内的残留量随着消除时间的增加呈现降低的趋势,鱼体肌肉中平均消除速率0.012μg·kg^(-1)·h,内脏中的平均消除速率为1.47μg·kg^(-1)·h,内脏的消除速率明显高于肌肉;鲫鱼肌肉和内脏中AHD的残留量分别在144 h和220 h后低于检测限0.25μg·kg^(-1)。

猪肉中呋喃妥因代谢物残留液相色谱检测方法的建立

本研究对猪肉中呋喃妥因代谢物1-氨基-2-内酰脲(AHD)残留的液相色谱检测条件和样品前处理条件进行了优选,建立了猪肉中AHD残留的高效液相色谱检测方法。研究结果表明NPAHD残留液相色谱检测的最优色谱条件为柱温30℃,流速0.5mL/min,流动相pH为4.0的乙酸水和纯乙腈,最优样品前处理条件为乙酸乙酯提取前将衍生液pH调至7.0,样品酸解前不加入甲醇水处理。在上述最优色谱条件和前处理条件下对建立的高效液相色谱法进行方法学评价,得到的标准曲线的线性回归方程为y=35648x-442.84(R2=0.9985),精密度实验变异系数均小于6%,添加回收实验回收率范围为81%~95%,说明建立的高效液相色谱法可以用于猪肉中呋喃妥因代谢物(AHD)残留的检测。

呋喃唑酮代谢物人工抗原的制备与鉴定

制备了呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-噁唑烷酮(AOZ)的人工抗原,再采用重氮法将AOZ衍生物2-NP-AOZ与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备免疫原2-NP-AOZ-BSA和包被原2-NP-AOZ-OVA,通过SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS分析其偶联效果。以2-NP-AOZ-BSA皮下注射免疫SPF级BALB/c小鼠,分别于3次免疫和5次免疫后制备血清,以间接ELISA检测血清中2-NP-AOZ抗体效价,间接竞争ELISA检测血清敏感性,鉴定其免疫原性。发现2-NP-AOZ分别与BSA和OVA偶联成功,获得免疫原2-NP-AOZ-BSA和包被原2-NP-AOZ-OVA;MALDI-TOF-MS分析测得偶联率分别为7.1∶1、3.8∶1;BCA试剂盒检测2-NP-AOZ-BSA、2-NP-AOZ-OVA的浓度分别为4.9、5.2 mg/mL。间接ELISA检测3次免疫后小鼠血清抗体效价均达1∶16000及以上,5次免疫后血清抗体效价均达1∶32000及以上;半数抑制浓度(IC_(50))为34.43 ng/mL,人工抗原2-NP-AOZ-BSA免疫原性优良。本研究成功合成了AOZ完全抗原,为AOZ单克隆抗体制备及快速检测方法的建立奠定了基础。

呋喃唑酮代谢物人工抗原的合成及半抗原偶联比的测定

[目的]合成呋喃唑酮代谢物人工抗原,并测定该半抗原偶联比。[方法]通过混合酸酐法将羧基化改造的小分子抗原AOZ与HSA偶联后,运用紫外光谱分析判断合成的结果,并计算小分子抗原与蛋白的偶联比率。[结果]该试验成功合成了呋喃唑酮代谢物AOZ,对其进行羧基化改造后与载体蛋白HSA成功偶联,偶联比经测定为4∶1。[结论]利用紫外光谱分析测定小分子抗原偶联比率的方法简便,可靠性强。

抗呋喃唑酮代谢物单克隆抗体的制备

硝基呋喃类药物具有广谱抗菌作用,广泛应用于家禽细菌性传染病的防治,但其在动物体内残留的代谢产物,对人体具有致癌、致突变的特性。研究将硝基呋喃类药物呋喃唑酮上的硝基还原为氨基,再将还原产物与载体蛋白用重氮化法进行偶联,从而获得呋喃唑酮代谢物(AOZ)的免疫抗原和检测抗原。用免疫抗原免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合、克隆筛选、扩大培养、动物体内诱生腹水等过程,获得了抗AOZ的单克隆抗体,并通过建立间接ELISA方法对获得的单克隆抗体进行鉴定。研究结果为开发AOZ的ELISA检测试剂盒奠定了基础。

SERS结合PCA-LDA分析鉴别鸡肉中硝基呋喃类代谢物的混合残留

以纳米Au溶胶和NaCl溶液为活性增强基底,对鸡肉中残留的两种呋喃它酮代谢物(AMOZ)和呋喃妥因代谢物(AHD)进行表面增强拉曼光谱(SERS)快速检测技术研究。采用自适应迭代惩罚最小二乘法消除原始数据中的背景干扰,应用标准归一化进行光谱预处理,并结合主成分—线性判别方法(PCA-LDA)建立识别模型,得出模型校正集的判别正确率为90.48%,预测集的判别正确率为94.29%。研究表明,SERS技术与PCA-LDA相结合可以有效地鉴别出鸡肉样本中残留的AMOZ和AHD。

高效液相色谱-串联质谱法测定动物肌肉中硝基呋喃类抗生素代谢物

用高效液相色谱 -串联质谱 (LC -MS -MS)同时测定动物肌肉中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因的代谢物。盐酸水解组织中蛋白结合代谢物 ,同时加入 2 -硝基苯甲醛 (2 -NBA) ,37℃过夜衍生。上清液调pH值 7.0后 ,用OasisHLB固相萃取 (SPE)柱净化。采用电喷雾电离 (ESI) ,正离子 ,选择反应监测 (SRM)模式检测。三离子原则 ,外标法定量。定量限 (LOQ) 5 -甲基吗啉 - 3-氨基 - 2 -唑烷基酮(AMOZ)、3-氨基 - 2 -唑烷基酮 (AOZ)均为 0 .1ng/g,氨基脲(SEM)、1-氨基 -乙内酰脲 (AHD)均为 0 .5ng/g;检测限(LOD)AMOZ、AOZ均为 0 .0 5ng/g ,SEM、AHD均为 0 .1ng/g。在添加浓度 0 .5～ 10ng/g范围内 ,AMOZ回收率为 6 5 .4 %～91.3% ,SEM回收率为 6 2 .7%～ 94 .6 % ,AHD回收率为 6 3.9%～ 89.4 % ,AOZ回收率为 6 7.8%～ 90 .9%。相对标准偏差(RSD)均小于 4 .8%。

呋喃唑酮在动物体内的代谢及代谢物残留检测研究进展

1呋喃唑酮在动物体内的代谢呋喃唑酮进入体内后,代谢非常迅速。鲶鱼体内的半衰期仅0.27h。家兔灌服呋喃唑酮后15min即可在静脉血中测得药物原形,代谢物在服药后1h被检出。AOZ在动物体内消除缓慢。