Bacillus tropicus来源β-D-呋喃果糖苷酶基因的克隆与表达及其酶学特性研究

为获得新β-D-呋喃果糖苷酶资源并探究其酶学性质及在转化糖中的应用潜力,挖掘出Bacillus tropicus来源的β-D-呋喃果糖苷酶基因BtFFase8,成功合成后表达在大肠杆菌宿主中。通过数据库筛选β-D-呋喃果糖苷酶的基因序列,将基因克隆至载体pET-28a(+)中。将获得的重组质粒转化至大肠杆菌BL21,构建重组菌株大肠杆菌BL21/pET28a-BtFFase8。采用亲和层析纯化克隆酶,用SDS-PAGE法分析蛋白分子量,通过葡萄糖试剂盒检测酶水解产物的能力得到酶活力,用福林酚试剂法测定蛋白质含量。克隆酶BtFFase8的分子质量为57.0 kDa,对蔗糖底物的比酶活力为13.4 U/mg;BtFFase8的最适pH和最适温度分别为pH 6.5和45℃,且在pH 5.0~8.0和40℃及以下温度保持酶活力稳定,残余酶活力大于80%;BtFFase8能耐受碱性蛋白酶、酸性蛋白酶和胰蛋白酶的水解,残余酶活力大于70%。BtFFase8的发现及克隆酶优良的酶学功能为其未来应用于食品加工,特别是在转化糖的生产中奠定了良好的理论基础。

示差折光-液相色谱法测定蜂蜜中β-呋喃果糖苷酶残留量

基于β-呋喃果糖苷酶与棉子糖在柠檬酸-氢氧化钠缓冲介质(pH 4.50)中50℃下反应16 h后的酶解产物蜜二糖含量的变化,建立了高效液相色谱示差折光检测(HPLC-RID)技术测定蜂蜜中β-呋喃果糖苷酶残留量的新方法。以Agilent Carbohydrate柱为分离柱,乙腈-水(78∶22,V/V)为流动相,流速为1.4 mL/min,检测器为示差折光检测器,柱温和检测器温度均为35℃。结果表明,蜂蜜样品经过聚丙烯酰胺凝胶柱分离后,样品峰形得到简化,灵敏度提高了1.3倍;方法的线性范围为10～200 U/kg;测出限为10 U/kg;回收率为81.3%～112.4%;相对标准偏差为3.7%～9.7%(n=6)。当蜂蜜样品中β-呋喃果糖苷酶含量>20 U/kg时,判定为阳性样品,即掺假蜂蜜。

β-果糖基转移酶和β-呋喃果糖苷酶的分离纯化

用球磨机 Dyno- Mill破碎低聚果糖产生菌黑曲霉 (Aspergillus niger) SIPI- 6 0 2的菌丝体 ,其离心上清液经硫酸铵分级沉淀、Octyl- Sepharose CL - 4 B疏水层析、Q- Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、Sephacryl S- 30 0凝胶过滤等步骤得到了在 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上均呈单带的两种酶 :β-果糖基转移酶与β-呋喃果糖苷酶。前者可将蔗糖转化成低聚果糖 ,而后者则催化蔗糖和低聚果糖的水解反应。用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得两者的分子量分别为 98.86 k D和 84 .92 k D。

均匀设计优化节杆菌产β-呋喃果糖苷酶发酵培养基

采用均匀设计法,优化节杆菌发酵产β-呋喃果糖苷酶培养基。采用6因素10水平混合均匀设计表,综合考察蔗糖、牛肉膏、酵母膏、(NH4)2HPO4、KH2PO4、MgSO4.7H2O6种培养基成分对节杆菌发酵产β-呋喃果糖苷酶转移糖基酶活力的影响。通过二次多项式逐步回归得出最终培养基组成为:蔗糖5g/L、牛肉膏30g/L、酵母膏2g/L、(NH4)2HPO410g/L、KH2PO40.5g/L、MgSO4.7H2O0.2g/L,在此条件下回归方程的酶活力理论值为382.93U/ml,验证实验中酶活力为365.85U/ml,验证值与预测值之间吻合较好。

β-呋喃果糖苷酶法合成低聚乳果糖工艺优化

目的:确定β-呋喃果糖苷酶合成低聚乳果糖的最佳工艺条件。方法:以蔗糖和乳糖为底物,利用β-呋喃果糖苷酶粗酶液合成低聚乳果糖,通过单因素和Box-Behnken试验,对酶法合成工艺进行响应面分析,得到酶法合成低聚乳果糖的最佳工艺参数。结果:最佳工艺条件为反应时间22.77h、pH7.0、反应温度35.0℃、底物质量浓度20.0g/100mL、底物与酶的体积比1:1,低聚乳果糖含量为22.70%。结论:Box-Behnken结合响应面优化果糖苷酶法合成低聚乳果糖工艺,模型可靠,方法可行。

5龄家蚕中肠β-呋喃果糖苷酶基因转录表达分析

【目的】探明5龄家蚕中肠β-呋喃果糖苷酶基因表达及其酶活性变化规律,为解析家蚕回避桑叶1-脱氧野尻霉素(DNJ)毒害作用的适应机制提供参考依据。【方法】通过实时荧光定量PCR对5龄家蚕中肠β-呋喃果糖苷酶基因Bm Suc1和Bm Suc2的表达进行定量检测和分析,同时测定β-呋喃果糖苷酶活性。【结果】Bm Suc1基因在5龄家蚕中肠的不同发育阶段均有表达,其中在5龄起蚕和盛食期的相对表达量较高;而Bm Suc2基因在整个5龄期的相对表达量均非常低。从5龄起蚕到熟蚕,β-呋喃果糖苷酶活性呈先升高后降低的变化趋势,以第5 d(盛食期)的酶活性最高,达158.82U/mg。【结论】Bm Suc1基因表达水平及β-呋喃果糖苷酶活性变化规律与5龄家蚕吸收利用桑叶蔗糖营养的生理进程基本一致,提示Bm Suc1基因作为一种蔗糖水解酶基因在家蚕中肠组织消化吸收桑叶蔗糖营养物质的过程中发挥主导作用。

响应面法优化离子交换法固定化β-D-呋喃果糖苷酶

以大孔阴离子树脂D311为载体,对日本曲霉来源的β-D-呋喃果糖苷酶进行离子交换法固定化。研究温度、pH值、时间、游离酶液酶活力对固定化效果的影响,并在此基础上运用响应面法对固定化条件进行优化。结果表明,最佳固定化条件为:室温、pH6.6、固定化时间4h、游离酶液酶活力为900U/mL,在此条件下,固定化β-D-呋喃果糖苷酶生产的低聚果糖产量可达58.16%。

β-呋喃果糖苷酶催化甜菊糖的改性研究

本文用β-呋喃果糖苷酶催化甜菊糖的分子改性,采用蔗糖和甜菊糖的混合反应体系,优化的催化反应条件为:pH6.5,反应温度40℃,甜菊苷和甜菊双糖A苷与蔗糖的摩尔比为0.007和0.003,加酶量15U/mL,反应时间15h。在优化的反应条件下,甜菊苷和甜菊双糖A苷的转化率分别为63.6%和63%。

黑曲霉产β-呋喃果糖苷酶酶学性质研究

对来源于黑曲霉的β-D-呋喃果糖苷酶的酶学特性进行了研究。结果表明,β-D-呋喃果糖苷酶的最适pH值为5.0,最适温度为50℃。在40℃～60℃、pH值5.0～7.0其具有较好的稳定性。金属离子对β-呋喃果糖苷酶活性有影响。Mn2+和Ca2+能明显增强酶活,而Cu2+和Ag+能抑制酶活。

日本曲霉产β-呋喃果糖苷酶的性质研究

目的:试验确定日本曲霉产β—呋喃果糖苷酶的酶学性质。方法:将β-呋喃果糖苷酶在不同的温度、pH值、底物浓度、反应时间的条件下测定酶活。结果:确定了日本曲霉产β-呋喃果糖苷酶的性质。日本曲霉产β-呋喃果糖苷酶分子量约为89kDa,最适反应温度为50℃,最适pH值为5.5。温度在40℃-60℃,pH在5-7范围内酶比较稳定,最适底物浓度为50%,反应时间3h-4h。结论:确定了日本曲霉产β-呋喃果糖苷酶的性质,为制取高含量的低聚果糖提供条件。

产β-呋喃果糖苷酶菌株的筛选及发酵条件初探

以蔗糖为碳源,对几种日本曲霉、米曲霉、黑曲霉菌株产β-呋喃果糖苷酶能力进行比较研究,其中日本曲霉1产酶能力最强。研究了其β-呋喃果糖苷酶的产生条件:以蔗糖为碳源,酵母膏为氮源时,菌种产酶最高。该菌种产酶在温度30℃,转速200r/min,pH6.0,培养时间为96h时,β-呋喃果糖苷酶酶活达到最高值,Ut为3.10U/mL,Uh为0.86U/mL,Ut/Uh为3.60U/mL。

液-液双相体系中β-D-呋喃果糖苷酶催化转移反应的特性

筛选出一些有利于维持 β D 呋喃果糖苷酶稳定性的有机溶剂 ,并研究了其在水 有机溶剂双相体系中催化转移反应的基本特性。非水相体系组成、pH值、温度和反应时间对酶反应速率有显著的影响 ,在丁酸乙酯 缓冲液双相体系中 ,有利于该酶发生转移反应、合成低聚糖的反应条件为 :有机溶剂体积比 91 5 8% (蔗糖底物初始量为 4 7 5 2 g/L ,酶添加量 0 5U/mL) ,pH 6 0 ,保温温度 5 4℃ ,此时振荡反应 32min后低聚糖合成率可达 3 4 1%。聚羟乙基异丁烯酸固定化 β D 呋喃果糖苷酶在丁酸乙酯 水双相体系中具有良好的稳定性和机械强度 。

β-呋喃果糖苷酶的性质研究

研究了低聚果糖产生菌黑曲霉 (Aspergillus niger) SIPI-60 2的β-呋喃果糖苷酶 (1)的性质。 1水解蔗糖的 Km和 Vm ax分别为 0 .0 2 5 mol/ L和 1.3 9mmol· L-1 · min-1 。果糖是 1的竞争性抑制剂 ,Ki=10 .0 5 mmol/ L。通过对菌丝体、β-果糖基转移酶 (2 )与 1的混合物及纯的 2转化蔗糖的反应进程的比较 ,考察了 1对 2反应进程的影响。结果表明 ,1对低聚果糖生成速率和最终产率均有影响。结果还提示在用菌丝体转化蔗糖过程中低聚果糖可能会诱导出更多的

β-呋喃果糖苷酶的抑制及其在低聚果糖生产中的应用

研究了复合抑制剂A、B对β-呋喃果糖苷酶(FFS)与β-果糖基转移酶(FTS)活性的影响。结果表明:复合抑制剂A在抑制β-呋喃果糖苷酶活力69.7%的同时,使β-果糖基转移酶活力提高到314.9%;复合抑制剂B则在使FFS活力降低51.5%的同时使FTS活力提高到386.9%。反应产物中有效成分低聚果糖(FOS)的含量从50%-55%提高到60%-63%,为改善低聚果糖产品质量、提高低聚果糖收率提供了可行途径。

日本曲霉产β-D-呋喃果糖苷酶的固定化

采用海藻酸钠包埋法、明胶-海藻酸钠复合包埋法和戊二醛-海藻酸钠共价交联法分别对日本曲霉来源的β-D-呋喃果糖苷酶进行固定化研究。实验结果发现:当海藻酸钠溶液浓度为3g/100mL,游离酶液酶活为800U/mL,CaCl2溶液浓度为1g/100mL,固定化时间为20min,制备的固定化酶酶活回收率为54.32%;添加浓度为3g/100mL明胶进行复合包埋后,其固定化酶酶活回收率达到69.23%;与0.3g/100mL戊二醛进行共价交联15min,制备的固定化酶酶活回收率为62.31%,反应10批相对酶活回收率仍在80%以上。从实际生产应用、固定化酶酶活、固定化酶的操作稳定性等方面综合比较,戊二醛-海藻酸钠交联法较佳。

产β-呋喃果糖苷酶节杆菌发酵条件的优化

通过单因素和响应面分析获得节杆菌产生β -呋喃果糖苷酶的最佳培养基配方为 :蔗糖 4 .4 5 % ,酵母膏 1.4 0 % ,蛋白胨 0 .93% ,(NH4 ) 2 HPO4 0 .4 % ,MgSO4 ·7H2 O 0 .13% ,低聚乳果糖产量可以达到 16 .38%。

培养基对节杆菌产β─呋喃果糖苷酶活力的影响

节杆菌（ＡＳ）能够产生一种β－呋喃果糖苷酶，该酶能以蔗糖和乳糖为底物，合成低聚乳果糖（ＬＳ）。这是一种功能性低聚糖，对人体健康有益，有很好的发展前景。实验研究了培养基组成对节杆菌产β－呋喃果糖苷酶活力的影响，确定最佳培养基的配方为蔗糖４％、酵母膏１．６０％、牛肉膏０．５０％、ＫＨ_２ＰＯ_４０．２０％、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４０．４０％。

β-呋喃果糖苷酶产生菌的筛选及产酶条件初探

β-呋喃果糖苷酶是一种具有转移活力的水解酶 ,该酶能以蔗糖和乳糖为底物 ,合成乳果糖。这是一种功能性低聚糖 ,对人体健康有益。实验研究了不同菌株产β-呋喃果糖苷酶活力的能力 ,确定节杆菌 A为最佳产酶菌株 ,对酶的生成具有诱导作用的碳源是蔗糖 ,培养时间为 4 0 h。

β-呋喃果糖苷酶合成低聚乳果糖的工艺研究

以蔗糖和乳糖为底物,利用节杆菌β-呋喃果糖苷酶合成低聚乳果糖,通过单因素和正交实验获得酶反应的最佳工艺条件为:酶反应体系的pH为6.5,反应温度37℃,酶用量1500U/g蔗糖,酶反应时间12h,反应体系的固形物含量为40%,蔗糖和乳糖的比例为1∶1,该条件下低聚乳果糖的最大转化率为160.83mg/mL。

节杆菌β-呋喃果糖苷酶的纯化及性质研究

采用硫酸铵盐析、透析脱盐、Sepharose6B凝胶色谱等分离纯化技术,从节杆菌培养液分离纯化了β-呋喃果糖苷酶,纯化倍数为18.29,回收率为44.81%,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后有一条明显的蛋白质谱带。相对分子量为55800左右,该酶的最适pH为6.5,最适温度为30℃,在pH6.0～8.0之间和45℃以下稳定,Ag+和Cu2+对该酶有较强烈的抑制作用,EDTA和镁离子对酶活的影响较小。