基于定向进化技术提高呕吐毒素解毒酶DepA的催化活性

[目的]呕吐毒素(deoxynivalenol,DON)C3位羟基的异构化是生物脱毒的关键部位,其中DepA作为DON生物转化中第一步关键限速酶,存在催化活性低的问题,限制了其在食品及饲料加工领域中的应用。本文旨在通过定向进化技术对DepA进行分子改造,以期获得催化活性显著提高的突变酶,提高其工业化应用的潜力。[方法]通过易错PCR和DNA shuffling相结合的方法,构建突变文库,经高通量筛选后,对催化活性明显提高的突变体进行酶学性质表征。同时,采用分子动力学模拟和三维结构模拟分析,探究突变酶催化活性提高的分子机制。[结果]成功筛选到突变酶S2、S10和S12,与野生型相比,其比活力分别提高207%、293%和258%。动力学参数结果显示,突变酶S2、S10和S12的K m值分别为56.89、27.00和40.65μmol·L^(-1),是野生型的91.7%、43.5%和65.5%;k_(cat)/K_(m)值分别为327.30、576.67和380.07 L·mmol^(-1)·s^(-1),是野生型的1.25、2.20和1.45倍,相比野生型,突变酶亲和力和催化效率均显著提高。此外,分子动力学模拟和三维结构模拟分析结果表明,柔性增加、底物DON的进攻距离缩短、氢键增加、疏水性增加和远端效应是导致其催化活性提高的主要原因。[结论]本研究通过易错PCR和DNA shuffling相结合的定向进化策略有效提高了呕吐毒素解毒酶DepA的催化活性,为其工业化应用提供试验依据。