位点特异DNA甲基化调控细胞周期素D1基因

DNA甲基化是基因表达调控的重要方式,一般被认为以CpG岛形式发挥作用;近年的研究表明,位点特异的DNA甲基化以元件(cis-regulatory element)的形式在生物微进化以及基因精细调控中发挥重要作用。我们的研究结果显示,曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)导致细胞周期蛋白D1基因表达下调,以及其核心启动子的+65到+77之间的两段串联CpG序列发生DNA甲基化。报告基因结果显示,由细胞周期素D1核心启动子片段驱动的报告基因活性在TSA处理后下降到原来0.12,而前段(A)突变与后段(B)突变时,报告基因活性分别下降到原来1/7.6与1/8.36,双突变则下降到原来1/7.51。对于CMV启动子嵌合15 bp片段驱动的报告基因活性,野生型、A、B与AB双突变型报告基因活性分别下降1/1.48、1/1.17、1/1.51以及1/1.21。体外甲基化研究结果显示,与对照组相比,M.SssⅠ处理组的启动子活性中,野生型活性下降到原来1/8800,A突变型活性下降到原来1/2700,B突变型活性下降到原来1/4156,双突变型活性下降到原来1/6222。应用M.HhaⅠ处理进一步区分甲基化位点,A和B突变型报告基因活性分别下降到原来1/1.11和1/1.40。有趣的是,比对发现劳亚兽总目的+66位点为T。由此,我们联合应用DNA定点突变与体外DNA甲基化模拟技术,研究了细胞周期蛋白D1基因位点DNA甲基化元件的作用。我们的研究表明,细胞周期蛋白D1基因核心启动子的+65位点的甲基化在转录调控过程中可能发挥关键作用,为位点特异甲基化在基因精细调控的机制研究提供实验数据。

周期基因1过表达可增强胶质瘤细胞放疗的敏感性

目的评价周期基因1（Per1）基因转染后过表达对胶质瘤细胞（C6）X射线放射敏感性的影响。方法采用脂质体介导方法将Per1基因转染至C6细胞，采用Westernblot检测Per1基因在c6细胞中的表达，并给予X射线单次照射后，检测细胞凋亡及细胞增殖。结果X射线照射后，与转染空载体质粒组（20．8％）及空白组（19．5％）比较，转染Per1基因c6细胞（41．3％）凋亡率增加（P〈0．01）；与转染空载体质粒组[（75．90±3．87）个]及空白组[（79．60±1．50）个]比较，其细胞克隆集落形成数明显减少[（51．20±6．08）个，P〈0．01]。结论节律基因Per1过表达使x射线照射的胶质瘤C6细胞凋亡增加，细胞增殖减弱，明显增强了放射对该细胞损伤的敏感性。

小麦光周期基因Ppd-D1的单核苷酸多态性

为了解小麦光周期基因Ppd-D1编码区单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP),采用琼脂糖凝胶电泳Ecotilling技术,对108份小麦品种中光周期基因Ppd-D1的核心编码区进行了SNP检测。结果表明,红芒麦、宁春27和红芒麦2具有相同的酶切带型,其目的序列与对照相比存在两处单碱基突变(C/T;G/A);坝农1号、定西35、QW6285等7份材料具有相同的酶切带型,其序列与对照相比含有一个5bp的缺失。初步分析表明,这三处SNP与小麦光周期敏感性没有直接的对应关系,但它们对小麦光周期敏感性产生了强度上的影响,加强了材料对光照长度的敏感性,一定程度上延迟了抽穗。本研究结果也说明琼脂糖凝胶电泳Ecotilling技术在小麦Ppd-D1基因SNP检测中具有良好的可行性。

细胞周期素D1 G870A基因多态性与头颈部肿瘤易感性的Meta分析

目的:探讨细胞周期素D1 G870A基因多态性与头颈部肿瘤易感性的关系。方法:通过计算机检索和手工检索,收集有关细胞周期素D1 G870A基因多态性与头颈部肿瘤易感性关系的文献,筛选出符合条件的文献,应用Meta分析软件对各项研究进行异质性检验,计算合并OR值及其95%可信区间,并行敏感性分析和发表偏倚的评估。结果:13篇文献纳入本研究,共计有2496例头颈部肿瘤患者和2463例对照人群。Meta分析合并结果显示与细胞周期素D1 G870A基因AA基因型比较,携带GG基因型和携带GG或GA基因型个体头颈部肿瘤发生风险的OR值分别为0.88和0.89(OR=0.88,95%CI:0.59-1.32;OR=0.89,95%CI:0.67-1.19)。通过种族的分层分析,没有发现细胞周期素D1 G870A基因多态性与头颈部肿瘤易感性在亚洲人群和欧洲人群中有差异。结论:细胞周期素D1 G870A基因多态性可能与头颈部肿瘤易感性间不存在明显相关性,但纳入研究的数量及每个研究的样本量均较少,需加大样本量进一步研究。

细胞周期蛋白E1基因在卵巢癌诊治中的作用

肿瘤细胞中基因拷贝数变异可影响细胞稳态,导致细胞恶变。细胞周期蛋白E1基因(CCNE1)编码细胞周期蛋白E1(Cyclin E1),CCNE1扩增或过表达改变Cyclin E1的表达,并影响其他基因的表达,参与多种恶性肿瘤的发生、发展。CCNE1扩增或过表达与卵巢癌的发生、耐药、靶向治疗及预后密切相关。该文综述CCNE1表达在卵巢癌诊治中的作用,以期有助于探寻新的卵巢癌治疗方法。

儿童急性白血病生存素和细胞周期素B1基因表达

目的:探讨基因生存素,细胞周期素B1的表达与儿童急性白血病(AL)的关系.方法:采用RT-PCR对初治或复发AL患儿42例和完全缓解AL(AL-CR)患儿13例及非恶性疾病患儿15例骨髓单个核细胞进行基因生存素,细胞周期素B1表达的检测.结果:初治和复发AL组生存素mRNA表达水平分别为0.472和0.810,细胞周期素B1mRNA为0.609和0.739,均高于AL-CR组(0)和对照组(0)(P<0.01);复发AL组生存素mRNA表达水平高于初治组,有统计学差异(P=0.025).生存素基因的表达与白细胞总数及临床分型有关,与性别、年龄、免疫分型无明显相关性.细胞周期素B1表达与性别、年龄、免疫分型、白细胞总数及临床分型无明显相关关系.儿童AL中生存素与细胞周期素B1的表达呈正相关.生存素mRNA表达水平高者缓解率低.结论:儿童AL中存在生存素,细胞周期素B1异常表达,两者表达存在相关性.生存素是AL复发的高危因素;AL生存素高表达者可以降低AL的化疗敏感性,生存素水平对AL有判断疗效和预后的价值.

沉默细胞周期检测点激酶1基因对肺腺癌顺铂敏感性的影响

目的探讨小干扰核糖核酸(siRNA)沉默Chk1基因表达对肺腺癌A549细胞顺铂敏感性的影响。方法分组培养肺腺癌A549细胞,采用Chk1 siRNA沉默细胞中Chk1表达,Western Blot法检测肺腺癌A549细胞中Chk1蛋白表达,流式细胞术分析沉默Chk1基因对肺腺癌A549细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响。结果Chk1蛋白在肺腺癌A549细胞中高表达,转染siRNA后Chk1蛋白表达水平明显降低。与对照组比较,顺铂组Chk1蛋白表达减少,但差异无统计学意义( P >0.05);Chk1 siRNA组和联合组Chk1蛋白表达明显降低( P 均<0.05);联合组Chk1蛋白表达明显低于顺铂组( P <0.05)。正常培养的肺腺癌A549细胞以G 0/G 1期为主,顺铂组和联合组肺腺癌A549细胞出现明显的G 2/M期阻滞,S期、G 2/M期细胞比例较对照组和Chk1 siRNA组明显增多( P 均<0.05),而联合组S期、G 2/M期细胞比例又低于顺铂组( P 均<0.05)。联合组、Chk1 siRNA组及顺铂组早期凋亡细胞数和晚期凋亡细胞数均高于对照组( P 均<0.05);联合组与Chk1 siRNA组及顺铂组比较,早期凋亡细胞数和晚期凋亡细胞数增多( P 均<0.05)。结论SiRNA沉默Chk1基因可明显消除顺铂引起的肺腺癌A549细胞G2/M期阻滞,促进细胞凋亡,增强肺腺癌对顺铂化疗的敏感性。

茶树细胞周期蛋白基因的克隆与表达

以茶树萌动芽为材料,采用SMART-RACE-PCR技术从茶树萌动芽中获得了茶树细胞周期蛋白基因的全长cDNA序列(命名为CsCYC1),并用实时定量PCR方法(qRT-PCR)研究了该基因在茶树越冬芽休眠到萌发后不同阶段的表达模式。结果显示:(1)该基因全长1 956bp,包含1 320bp的开放阅读框(ORF),编码439个氨基酸残基。(2)CsCYC1预测分子量为49.35kD,具有细胞周期蛋白家族典型的保守cyclin-box结构域和三维结构。(3)系统进化分析结果表明,CsCYC1的氨基酸序列与葡萄、蓖麻、毛果杨、琴叶鼠耳芥、拟南芥等的相似性分别为77%、74%、72%、68%和67%。(4)实时荧光定量PCR分析显示,CsCYC1基因在茶树越冬芽休眠期的表达量远低于恢复生长期,在萌发期表达量最高,说明该基因与茶树越冬芽休眠的解除关系密切。

BMAL1、CLOCK及其靶基因PER1血浆蛋白水平与高血压的相关性

目的:探讨脑和肌肉芳香烃受体核转运样蛋白1基因(BMAL1)、时钟基因(CLOCK)及其靶基因周期基因1(PER1)外周血中蛋白水平与高血压及其相关临床资料变量间的关系。方法:选取弋矶山医院体检中心2019年7~8月原发性高血压服用降压药患者63例,未服用药者34例,正常血压者54名为对照组。比较3组对象BMAL1、CLOCK、PER1血浆蛋白水平差异以及蛋白与血压之间的关系。结果:与对照组相比,未服用药高血压组的血浆CLOCK蛋白水平下降[4.19(3.97,4.99)ng/mL vs.4.97(4.35,5.37)ng/mL,P=0.008]。血浆PER1水平与BMI水平呈正相关(r=0.225,P=0.036),CLOCK蛋白水平与收缩压水平呈负相关(r=-0.243,P=0.022);多元Logistic回归分析,低CLOCK水平可能是高血压的危险因素(P=0.017)。结论:血浆CLOCK蛋白低水平与高血压存在关联性。

STAT3、cyclinD1、cyclinB1在卵巢上皮性癌的表达及意义

目的:研究STAT3及其下游基因cyclinD1、cyclinB1在卵巢上皮性癌的表达及意义。方法:用Westernblot和RT-PCR方法检测32例卵巢上皮性癌组织和12例正常卵巢组织中STAT3及其下游基因cyclinD1、cyclinB1的表达。结果:STAT3在卵巢癌和正常卵巢组织的蛋白表达阳性率分别为90.6%(29/32)和16.7%(2/12)。卵巢癌组STAT3表达明显高于正常卵巢组,差异有统计学意义(P<0.01);STAT3及其下游基因cyclinD1、cyclinB1mRNA在卵巢癌组织的阳性表达率分别为93.75%、87.5%、71.88%,与正常卵巢组阳性率的差异有统计学意义(P<0.05)。结论:卵巢上皮性癌中STAT3表达升高及活化可能促进了抗凋亡基因cyclinD1、cyclinB1表达,刺激细胞持续异常增殖,导致肿瘤发生。

CCND1表达沉默促进胶质母细胞瘤细胞株对替莫唑胺的敏感性

目的利用已构建的CCND1表达沉默及过表达的人源性胶质母细胞瘤细胞株SHG-44,筛选能够与CCND1协同抑制胶质母细胞瘤细胞增殖的化学治疗药物。方法用蛋白质印迹法检测CCND1表达沉默及过表达的人源性胶质母细胞瘤细胞株SHG-44中多药耐药基因MDR1的表达产物P-糖蛋白(P-gp)及凋亡因子Bcl-2、Caspase-3的表达。使用卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、替莫唑胺(TMZ)3种化学治疗药物分别处理CCND1过表达或表达沉默的SHG-44细胞,筛选能够与CCND1表达沉默协同抑制肿瘤细胞生长的化学治疗药物,并在人源性胶质母细胞瘤细胞株系U251中进一步验证。结果蛋白质印迹结果示CCND1表达沉默能够下调P-gp、Bcl-2的表达,上调Caspase-3的表达(P均<0.01)。BCNU(0.05、0.25μg/mL)、CCNU(20、80μg/mL)处理CCND1过表达或表达沉默的SHG-44细胞的第2、3、4、5天时,细胞生长曲线的差异均无统计学意义;而在药物处理后细胞培养的第4、5天,CCND1表达沉默SHG-44细胞的生长受到TMZ(9.1μg/mL)的抑制作用较亲代SHG-44细胞强(P<0.05)。U251细胞实验证实CCND1表达沉默促进TMZ的化学治疗敏感性。结论 CCND1表达沉默联合TMZ较两者单独作用能更有效地抑制人源性胶质母细胞瘤细胞株SHG-44的增殖,提示CCND1可能参与TMZ化学治疗耐药机制。

CCND1和myc的mRNA联合检测在乳腺癌诊断中的临床研究

目的建立荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）法检测细胞周期蛋白D1（CCND1）基因和核内原癌（myc）基因表达水平，探讨其联合检测在乳腺癌诊断和治疗监测中的应用。方法建立FQ—PCR法，并以β2-微球蛋白为内对照测定15名健康女性体检者、30例良性乳腺疾病患者和151例乳腺癌患者外周血中CCND1和myc的表达量。结果CCND1和myc表达水平在健康女性体检者、良性乳腺疾病扣乳腺癌患者中分别为（1．45±0．12）×10^-3，（1．45±0．11）×10^-3，（4．15±1．02）×10^-3；（1．15±0．07）×10^-3，（1．15±0．08）×10^-3，（2．86±1．51）×10^-3，它们在正常对照组和良性乳腺疾病组间差异无统计学显著性意义（P〉0．05），乳腺癌组均高于前两组（P〈0．05），β2-微球蛋白在三组间差异无统计学显著性意义（P〉O．05）。CCND1和myc联合检测的灵敏度高于单个基因的检测。结论FQ—PCR技术是高灵敏度、高特异度的快速定量检测CCND1和myc的方法，两者联合检测可有效提高乳腺癌的诊断灵敏度。

β-细辛醚对抑郁模型大鼠昼夜节律周期基因Per1表达的影响

目的:探讨β-细辛醚对抑郁模型大鼠昼夜节律周期基因Per1(period1)表达的影响。方法:将雄性SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、阿戈美拉汀组(40 mg·kg-1·d-1)、β-细辛醚低剂量组(12.5 mg·kg-1·d-1)、β-细辛醚高剂量组(25 mg·kg-1·d-1)共5组,每组20只。通过28 d慢性不可预见性应激刺激复制大鼠抑郁模型,于给药前及造模后对大鼠进行敞箱实验与糖水偏爱度行为学评估,应用实时定量PCR和Western blot检测各组大鼠脑中昼夜节律基因Per的表达。结果:行为学检测结果显示,与空白对照组相比,模型组的水平活动次数和糖水偏爱度均显著减少;与模型组相比,3个给药组的水平活动次数和糖水偏爱度均显著增加。PCR和Western blot检测检测结果显示,与空白对照组比较,模型组昼夜节律基因Per1的mRNA与蛋白表达均明显增高(P<0.05),而与模型组相比,阿戈美拉汀组和β-细辛醚高低剂量组昼夜节律基因Per1的mRNA与蛋白表达水平明显低于模型组(P<0.05)。结论:β-细辛醚可能通过影响抑郁大鼠昼夜节律基因Per1的脑表达进而改善大鼠的抑郁状态。

髓母细胞瘤周期蛋白基因D1、p16的表达及其与临床病理特点的关系

目的 通过检测髓母细胞瘤周期蛋白基因 (cyclin)D1和 p16的表达 ,探讨它们与传统临床病理特点之间以及cyclinD1和 p16之间的相互关系。 方法 应用免疫组织化学方法并用图像分析系统测定染色的积分吸光度 (IOD)检测cyclinD1和p16在髓母细胞瘤和正常小脑组织中的表达情况 ;应用统计学方法分析它们与临床病理特点的相互关系 ,以及cyclinD1和 p16之间的相互关系。结果 (1)正常小脑组织cyclinD1表达较低 ,髓母细胞瘤表达较高 (IOD值分别为 0 .2 93 1、1.0 712 ) ;p16在正常小脑组织中则呈现高表达 ,而髓母细胞瘤出现降低 (IOD值分别为 1.6815、1.0 10 9) ;(2 )髓母细胞瘤cyclinD1和 p16表达情况与肿瘤年龄、部位、病理类型、是否伴坏死、分化程度及分化方向有关 ;(3 )在纤维增生型髓母细胞瘤中cyclinD1和p16呈正相关关系 (r =0 .5 3 4,P <0 .0 5 ) ,而在经典型髓母细胞瘤中呈负相关关系 (r =-0 .40 7,P <0 .0 1)。结论 髓母细胞瘤临床病理特点的不同更深层次的原因之一是肿瘤细胞cyclinD1和

氧化应激对肺泡Ⅱ型上皮细胞中促凋亡基因细胞周期和凋亡调控蛋白1表达的影响

目的探讨氧化应激对肺泡Ⅱ型上皮细胞中促凋亡基因细胞周期和凋亡调控蛋白1(CCAR1)表达的影响。方法常规培养人肺泡Ⅱ型上皮细胞系A549细胞。分为正常对照组(无过氧化氢处理的A549细胞)、0.1mmol/L过氧化氢处理的A549细胞组、0.5mmol/L过氧化氢处理的A549细胞组和1.0mmol/L过氧化氢处理的A549细胞组。利用DNA梯状电泳检测细胞凋亡。免疫荧光细胞化学检测CCAR1蛋白在A549细胞中的表达和分布。Western blot检测过氧化氢对A549细胞中CCAR1蛋白表达的影响。比色法测定半胱氨酸蛋白水解酶(Caspase-3)的活性。结果DNA梯状电泳检测显示,1.0mmol/L过氧化氢处理A549细胞24h,电泳出现反映细胞凋亡的梯形条带。免疫荧光细胞化学检测显示CCAR1主要定位在细胞核,但胞质中也有分布。Western blot结果显示过氧化氢呈剂量依赖性地诱导A549细胞中CCAR1蛋白表达上调(Pa<0.05)。CCAR1蛋白的表达与促凋亡的Caspase-3的活性呈显著正相关(r=0.7212P<0.05)。结论氧化应激诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞中促凋亡基因CCAR1蛋白表达上调。CCAR1可能参与了氧化应激诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的调控,其机制可能涉及到Caspase-3活性改变。

VHL综合征遗传学研究

VHL综合征(von Hippel-Lindau syndrome,VHL;MIM 193300)是一种常染色体显性遗传的多系统肿瘤综合征,最常见临床表现是视网膜或中枢神经系统(central nervous system,CNS)血管母细胞瘤.CNS血管母细胞瘤和肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)的并发症是VHL患者最主要的死因.VHL综合征主要因VHL基因(the vonHipple-Lindau gene,VHL)突变所致,细胞周期素D1基因(the cyclin D1 gene,CCND1)突变和蛋白异常也可能参与其发生.目前已建立了多个VHL基因缺陷动物模型.在此就VHL综合征的遗传学研究进展作一概述.