周期性张应变刺激下骨细胞信使RNA差异表达谱的生物信息学分析

骨细胞是骨组织中含量最多的细胞,它在力学载荷作用下的生物学响应,在骨重建和骨形成修复中有重要作用,也影响其它生命活动。方法 本研究向体外培养MLO-Y4骨细胞施加0.25%﹑0.5赫兹的周期性张应变的力学刺激,通过高通量信使RNA(脱氧核糖核酸)测序,检测力学刺激下骨细胞信使RNA差异表达谱,然后针对信使RNA表达谱,进行EggNOG功能注释、GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析。结果 发现力学刺激下,骨细胞有1277个信使RNA差异表达,这些信使RNA参与信号转导、分泌、囊泡运输等功能,涉及生物调节、细胞过程和代谢过程等分子功能,并参与干细胞调节、C型凝集素受体和破骨细胞分化等信号途径。结论 这些结果表明骨细胞在力学刺激下,可调节多种生理生化活动,其中对骨代谢和骨重建的调节尤为显著,为进一步研究骨细胞和骨组织力学生物学奠定了基础。

周期性张应变对破骨前体细胞和破骨细胞增殖和抗酒石酸酸性磷酸酶的影响

目的研究不同强度的力学载荷对破骨细胞及其前体细胞增殖、分化和功能的影响。方法以破骨诱导液培养RAW264.7破骨前体细胞,同时施加3 d的周期性张应变,然后培养4 d;另外一组RAW264.7细胞以破骨诱导液培养4 d,将其诱导为破骨细胞,再施加3 d的周期性张应变。结果在不同张应变下,两组细胞增殖活性的变化大致相同,但细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatage,TRAP)活性和破骨细胞(TRAP阳性多核细胞)数量的变化明显不同。在2 500με的中等强度张应变下,第1组的TRAP活性降幅和破骨细胞数量减幅均最高,而后者TRAP活性降幅和破骨细胞数量减幅均最低。结论不同张应变对分化初期破骨前体细胞和已分化出破骨细胞的破骨前体细胞的破骨分化和功能状态的影响有明显差异。

周期性张应变作用下成骨细胞凋亡的体外研究

目的研究周期性张应变对体外培养的成骨细胞凋亡作用及其与细胞增殖和细胞分化之间的关系。方法酶消化法分离培养新生SD大鼠颅顶骨成骨细胞,P2-P4代成骨细胞培养2d和4d后,用无血清培养法诱导成骨细胞凋亡,同时使用Flexcell4000TM细胞应变加载系统分别对细胞施加72h变形率为6%和13.6%的等轴周期性张应变。根据总培养时间分为5d和7d两组。运用流式细胞技术对成骨细胞凋亡水平进行检测,同时进行细胞记数及碱性磷酸酶(ALP)蛋白含量检测。结果与不加力的对照组相比,6%周期性张应变使成骨细胞凋亡率有不同程度的降低并伴随细胞数量增加;而在13.6%的周期性张应变下,成骨细胞凋亡率增加的同时,细胞数量有不同程度地降低;而相同培养时间下,5d组细胞对6%的周期性张应变更加敏感,而7d组细胞对13.6%的周期性张应变更加敏感。ALP活性在两种张应变刺激作用下均有所下降。结论周期性张应变对成骨细胞的凋亡具有影响,不同力值的周期性张应变可通过促进或抑制细胞凋亡的方式调控成骨细胞的活性。

ERK信号通路参与调控周期性张应变诱导的人牙周膜细胞增殖

目的探讨周期性张应变对人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)增殖的影响及其相关机制。方法应用FX-4000T细胞应变加载系统,对体外培养的hPDLCs施加周期性张应变,幅度分别为10%和20%,加载时间为6h和24h,频率均为0.1Hz,以未加载的静态细胞作为对照组。应用流式细胞术检测人牙周膜细胞细胞周期的变化,并应用Western blot法检测细胞增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞内信号转导分子p-ERK1/2表达的变化。用ERK1/2的特异性抑制剂PD98059预处理细胞后,在0.1Hz,10%幅度条件下,加载6h,检测p-ERK1/2的表达水平变化对细胞PCNA表达的影响。结果与静态组相比,周期性张应变增加了S期人牙周膜细胞的比例,并诱导人牙周膜细胞的PCNA和p-ERK1/2表达增加,10%幅度和20%幅度相比无显著性差异。同一幅度张应变,加载6h和24h对细胞PCNA和p-ERK1/2表达的影响无显著性差异。ERK1/2的抑制剂PD98059不仅可以明显抑制张应变诱导的p-ERK1/2活化,而且张应变诱导的细胞PCNA表达也被明显抑制。结论周期性张应变可激活ERK信号通路,促进体外培养人牙周膜细胞的增殖。

周期性张应变通过活性氧生成促进膝关节骨关节炎患者的软骨细胞发生凋亡

目的探讨周期性张应变诱导体外培养的膝关节骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者软骨细胞发生凋亡过程中的活性氧(reactive oxygen species,ROS)的作用机制。方法对受力组软骨细胞施加频率0.5 Hz、强度20%延伸率的周期性张应变。对照组细胞的培养条件与受力组细胞一致,但不受力。N-乙酰半胱氨酸(NAC)和丁胱亚磺酰亚胺(BSO)干预组的软骨细胞在受力前分别使用NAC和BSO进行预处理。流式细胞术检测细胞凋亡率,DCFH-DA为荧光探针检测细胞内ROS含量,分光光度法检测软骨细胞内caspase-9活性变化。结果 0.5 Hz、20%延伸率的周期性张应变可以刺激软骨细胞内ROS、caspase-9活性及细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。使用NAC和BSO抑制及升高细胞内ROS含量后,可以明显抑制及促进周期性张应变诱导的软骨细胞的caspase-9活性及细胞凋亡率(P<0.05)。结论周期性张应变通过促进ROS生成,进而激活caspase-9介导膝关节OA患者软骨细胞发生凋亡。抑制ROS的生成可以减轻周期性张应变导致的软骨细胞凋亡。

周期性张应变对椎间盘纤维环细胞内游离钙离子浓度的影响

目的探讨周期性张应变对培养的大鼠椎间盘纤维环细胞内Ca2+浓度([Ca2+])的影响及其可能机制。方法采用激光扫描共聚焦显微镜和F luo-3/AM荧光探针标记技术,测定周期性张应变对纤维环细胞内[Ca2+]的影响,并分析了EGTA、维拉帕米和氯化钆预处理对此作用的影响。结果应变为10%、频率为1 Hz的周期性张应变1 m in使细胞内[Ca2+]增加1.13倍;EGTA可以阻断此作用;而维拉帕米和氯化钆仅可部分阻断。结论周期性张应变使纤维环细胞内[Ca2+]升高,细胞外钙内流起主要作用,且有不同的钙离子通道参与。

周期性张应变对纤维环细胞aggrecan mRNA表达的影响

目的观察周期性张应变对椎间盘纤维环细胞蛋白多糖表达的影响。方法采用自制周期性张应变加载装置,对培养的椎间盘纤维环细胞进行周期性张应变刺激,利用RT-PCR检测椎间盘纤维环中主要蛋白多糖aggrecan mRNA的表达变化情况。结果10%周期性张应变使aggrecan mRNA的表达降低,2h降低20%左右,6、12h降低将近40%。结论10%周期性张应变可以使纤维环细胞aggrecan mRNA的表达降低;周期性张应变可以从转录水平上影响纤维环细胞蛋白多糖的产生。

周期性张应变通过mir-29a-TET1通路调控静脉血管平滑肌细胞表型转化

目的移植静脉内膜增生引起的再狭窄是影响冠状动脉旁路移植术预后的主要原因,机械应力引起移植静脉血管平滑肌细胞(vein smooth muscle cells,VSMCs)异常增殖和迁移是其主要病理基础。VSMCs表型转化是功能改变的起始事件。但是张应力在移植静脉VSMCs表型转化的调控作用和机制尚未阐明。本研究通过高通量测序分析筛选到TET1,并探索了其在应力调控VSMC表型转化中的作用。方法首先应用全转录组测序结合miRNA测序技术检测移植静脉与对照静脉中转录组和miRNA变化。应用生物信息学方法构建TET1共表达基因网络并分析这些基因的功能,并预测可以调控TET1的miRNA。体外应用Flexcell5000细胞张应变加载系统对VSMCs加载10%幅度张应变,应用RT-PCR检测目标RNA表达;应用小RNA干扰技术转染VSMCs,Western blot检测转染后VSMCs收缩表型标志分子。结果测序发现TET1在移植静脉中表达降低,RT-PCR验证了这一结果。与TET1结合的miRNA有12个,测序结果提示mir-29a-3p升高倍数最大。权重基因共表达网络分析186个基因与TET1高度相关(k>0.4),再经过KEGG分析这些基因参与调控VSMC收缩功能,提示TET1可能参与了VSMC收缩表型与合成表型的转化。体外试验显示,张应变促进了mir-29a-3p表达,并抑制了TET1的蛋白水平,同时抑制了VSMCs收缩表型标志分子。转染mir-29a-3p的mimics和inhibitor,能够调控TET1和VSMCs收缩表型标志分子。结论 mir-29a-TET1通路在周期性张应变(应力)调控VSMC表型转化中发挥作用,为抑制移植静脉VSMC功能失调引起的再狭窄提供防治的力学生物学依据。

周期性张应变激活整合素β_1-FAK信号途径调控皮肤成纤维细胞运动

目的探讨周期性张应变对皮肤成纤维细胞的影响,寻找引起细胞运动的最佳张应变幅度及其信号转导机制。方法成纤维细胞培养于预敷胶原蛋白基质的6孔柔性培养板,对柔性培养孔施加10次/min的负压(-135mmHg),每孔柔性板由中心到周边张应变幅度介于0%～24%。倒置显微镜观察细胞旋转角度,细胞免疫染色和激光共聚焦显微镜观察细胞整合素β1在细胞内的改变,免疫印迹观察细胞整合素β1表达和黏着斑激酶(FAK)磷酸化。结果发现15%的张应变幅度是诱导皮肤成纤维细胞运动的最低张应变幅度。机械张应变诱导成纤维细胞整合素β1在细胞再分布和FAK磷酸化,整合素抗体β1部分抑制了FAK磷酸化和细胞运动。结论机械张应变通过整合素β1-FAK途径引起皮肤成纤维细胞运动。

microRNA-214-3p在周期性张应变诱导内皮祖细胞分化和增殖中的作用

目的探讨microRNA-214-3p(miR-214-3p)在周期性张应变诱导内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)分化和增殖中的作用。方法采用FX-5000T细胞周期性张应变加载装置对EPCs施加生理水平的周期性张应变(5%幅度、1.25 Hz频率),加载时间24 h。应用miRNAs芯片筛选周期性张应变调控下差异表达的miRNAs,并挑选miR-214-3p进行深入研究。实时荧光定量PCR方法检测EPCs内平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)相标志分子的表达,BrdU结合酶联免疫吸附ELISA法检测EPCs增殖功能。之后,使用miR-214-3p抑制剂抑制miR-214-3p的表达,检测EPC内VSMC相标志分子表达及EPCs增殖。结果周期性张应变显著抑制miR-214-3p表达,并抑制EPCs向VSMC相分化,同时显著促进EPCs增殖。在静态条件下,使用miR-214-3p抑制剂干扰miR-214-3p的表达,miR-214-3p水平下降同样会抑制EPCs向VSMC相分化,并且诱导EPCs增殖能力显著上升。结论生理水平的周期性张应变能够抑制EPCs内miR-214-3p表达,从而抑制EPCs向VSMC相分化,并且促进EPCs增殖。研究结果为血管损伤的治疗提供新的治疗靶点。

周期性张应变对人牙髓细胞L型钙离子通道基因表达的影响

目的:研究机械张应变对人牙髓细胞L型钙离子通道基因表达的影响。方法:取新鲜拔除的健康恒牙牙髓,采用组织块贴壁法培养原代人牙髓细胞,通过Flexcell细胞应力培养系统,分别施加2%和8%的周期性张应变,加载时间分别为0.5、12、24 h,观察机械牵张力对人牙髓细胞L型钙离子通道不同亚型表达的影响。结果:人牙髓细胞(HDPCs)主要表达L型钙离子通道α1亚基C亚型(L type calcium channelα1 Csubunit,Cav1.2)和L型钙离子通道α1亚基D亚型(Ltype calcium channelα1 D subunit,Cav1.3),未见L型钙离子通道α1亚基S亚型(L type calcium channelα1 S subunit,Cav1.1)和L型钙离子通道α1亚基F亚型(Ltype calcium channelα1 F subunit,Cav1.4)的表达。在2%和8%张应变下,加载0.5 h至12 h Cav1.2和Cav1.3均有上调(P<0.05),而加载24 h后2个亚型与对照组间均无明显差异(P>0.05)。结论:人牙髓细胞主要表达Cav1.2和Cav1.3,应力和作用时间对L型钙离子通道表达量有明显影响。

周期性张应变调控血管平滑肌细胞黏附血小板微体及其在自噬中的作用

目的探讨周期性张应变力学刺激对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)与血小板微体(platelet-derived microparticles,PMPs)黏附能力的影响,以及黏附的PMPs对VSMCs自噬的调控作用。方法应用FX-5000T张应变加载系统,对体外培养VSMCs施加5%幅度的生理性张应变和15%幅度的高张应变;应用流式细胞术检测不同张应变作用的VSMCs与PMPs的黏附;免疫荧光检测PMPs刺激24 h后自噬标志分子微管相关蛋白轻链3(autophagy microtubule associated protein light chain 3,LC3)的表达水平;Western blotting检测PMPs刺激24 h后VSMCs自噬相关蛋白(autophagy related protein,Atg)的表达水平。结果与5%生理性张应变加载相比,15%高张应变加载24 h能显著增强VSMCs与PMPs的黏附水平,提示高张应变促进PMPs与VSMCs的黏附。免疫荧光和Western blotting结果显示,PMPs刺激可显著上升VSMCs中自噬标志蛋白LC3表达,同时Western blotting检测到PMPs刺激后Atg5、Atg7、Atg12蛋白表达水平显著上升。结论高张应变可以促进VSMCs黏附PMPs,黏附的PMPs可能通过增加Atg5、Atg7、Atg12、LC3表达,从而增强VSMCs自噬。

生理性周期性张应变通过激活AMPK磷酸化抑制血管平滑肌细胞迁移

目的探讨细胞能量代谢的关键调节因子AMP激活的蛋白激酶AMPK在血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)响应生理性周期性张应变力学刺激后对VSMCs迁移的影响。方法采用Flexcell-5000T体外细胞张应变加载系统,对大鼠原代培养的VSMCs施加10%幅度、1.25 Hz频率的周期性张应变,模拟VSMCs在体内的生理性力学环境;以未加载周期性张应变的静态细胞为对照组,Western blotting检测VSMCs的p-AMPK蛋白表达;划痕实验检测VSMCs迁移功能。结果与静态组的细胞相比,生理性周期性张应变加载24 h后显著减少划痕愈合面积,提示生理性周期性张应变抑制VSMCs迁移;生理性周期性张应变加载3 h后,VSMCs的p-AMPK蛋白表达显著升高,而加载24 h后p-AMPK蛋白表达显著降低。在生理性周期性张应变加载条件下,孵育AMPK抑制剂可以在张应变加载3 h后显著降低p-AMPK蛋白表达,而在张应变加载24 h后显著促进VSMCs迁移;在静态条件下孵育AMPK激活剂AICAR 3 h后显著诱导p-AMPK蛋白表达,孵育24 h后显著抑制VSMCs迁移;提示p-AMPK蛋白表达参与调控VSMCs迁移。结论生理性周期性张应变能通过激活p-AMPK蛋白表达,进而抑制VSMCs迁移,提示生理性周期性张应变调控VSMCs迁移对维持血管稳态具有重要意义。

心肌素在周期性张应变调控血管平滑肌细胞表型转化中的作用

目的探讨周期性张应变条件下诱导血管平滑肌细胞(VSMC)表型转换时,心肌素在其中可能的作用。方法应用FX-5000T体外周期性张应变加载系统,分别对体外培养的VSMC施加频率为1.25 Hz、加载幅度为5%(正常张应变状态)、15%(高张应变状态)的周期性张应变力学刺激,加载时间为24 h。采用蛋白免疫印迹法和实时荧光定量PCR技术检测心肌素、肌肉萎缩相关基因1(atrogin-1)及相关收缩蛋白SMA、SM22的蛋白表达水平和mRNA水平;敲除atrogin-1后测心肌素及相关收缩蛋白SMA、SM22的变化;用蛋白酶体抑制剂MG132处理后测心肌素和atrogin-1的表达水平。结果与5%正常张应变组比较,15%高张应变促进平滑肌细胞的去分化。15%高张应变下调心肌素和SMA、SM22蛋白水平;上调atrogin-1蛋白表达水平;下调心肌素和SMA、SM22的mRNA水平,上调atrogin-1 mRNA水平。应用siRNA特异性下调atrogin-1后,心肌素、SMA、SM22蛋白水平均上升。用1μmol/L MG132处理细胞后,心肌素、SMA、SM22的蛋白水平上升,atrogin-1蛋白水平下降。结论周期性高张应变可以通过调节血管平滑肌细胞中atrogin-1/心肌素轴来调控血管平滑肌表型转换,进而影响VSMC的分化增殖。

周期性张应变对人牙髓细胞形态、存活率和增殖活性的影响

目的:研究周期性张应变对人牙髓细胞形态、存活率和增殖活性的影响。方法:取新鲜拔除的健康恒牙牙髓,采用组织块贴壁法培养原代人牙髓细胞,通过Flexcell细胞应力培养系统,分别加载2%和8%的周期性张应变,加载频率为1Hz,加载时间分别为0.5h、12h及24h,以未加载的静态细胞作为对照组。应用倒置相差显微镜、台盼蓝法及MTT法分别检测细胞形态、存活率和增殖活性的变化。数据采用SPSS16.0软件包进行单因素方差分析。结果:张应变加载后,贴壁的牙髓细胞形态为长梭形,有明显的极性突起,并且排列趋向一致,加载24h变化更明显。2%、8%加载组细胞的存活率显著大于对照组,12h加载组细胞存活率最高,24h加载组略有下降。2%、8%加载组细胞的增殖能力与对照组相比增加,2%组加载24h增加最明显(P<0.01)。结论:周期性张应变对离体培养的人牙髓细胞形态、存活率和增殖活性有明显影响,并呈应变大小和时间依赖性。

动脉周期性张应变阻滞平滑肌细胞自噬流在静脉移植后血管重建中的作用

目的动脉力学环境诱导静脉平滑肌细胞(VSMCs)异常增殖与迁移是临床冠状动脉搭桥术后桥血管再狭窄和堵塞的重要病理原因。自噬是真核生物进化上高度保守,对于维持细胞稳态至关重要的生物过程。动脉力学环境对于移植静脉VSMCs自噬的影响目前仍不清楚。方法应用"套管"法构建大鼠静脉移植模型,FX5000系统对体外培养VSMCs施加10%、1.25 Hz周期性张应变以模拟移植术后VSMCs受到的动脉张应变力学刺激,mCherry-GFP-LC3、氯喹(CQ)。

PGC1a参与周期性张应变调控的血管平滑肌细胞线粒体功能

目的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的线粒体功能障碍与心血管疾病密切相关;体内的力学环境中,VSMCs主要受周期性张应变的作用。PGC1参与激活线粒体的生物合成。探讨周期性张应变条件下VSMCs的PGC1参与调控线粒体功能的机制。

周期性张应变通过miRNA-214-3p调控LaminA/C表达参与血管重建

目的实验室前期研究发现,高张应变抑制核骨架蛋白LaminA/C表达在高血压血管重建中发挥重要作用。探讨高张应变是否通过微小RNA(miRNA)调控LaminA/C表达,及其在血管平滑肌细胞(VSMCs)迁移中的作用。方法利用miRDB、miRWalk和Targetscan联合预测可能调控LaminA/C的miRNA。

周期性张应变调控血管平滑肌细胞能量代谢功能初探

目的周期性张应变是影响血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)功能的重要力学因素。VSMCs的功能与其能量代谢方式直接相关。蛋白激酶C(PKC)是一类丝氨酸/苏氨酸激酶,参与细胞的多种代谢过程,能够通过控制氧化还原稳态、电子传递链通量来控制线粒体活性氧。PKC的异常表达是细胞功能改变的特征。

血清对周期性张应变作用下成骨细胞凋亡的作用及机制研究

目的研究血清对周期性张应变作用下体外培养的成骨细胞凋亡的影响。方法酶消化法分离培养新生SD大鼠颅顶骨成骨细胞,P2-P4代成骨细胞培养4 d后,使用Flexcell 4000TM细胞应变加载系统分别对细胞施加72 h变形率为6%和12%的等轴周期性张应变,总培养时间为7 d。根据应变加载时培养液中血清加载情况分为血清组和无血清组。运用流式细胞技术对成骨细胞凋亡水平进行检测,运用ELISA技术检测caspase-3表达,运用real time RT-PCR技术检测caspase-8和caspase-9的表达。结果不加力时,血清组成骨细胞凋亡率、caspase-3活性及caspase-9的表达显著低于无血清组,caspase-8表达无显著差异。6%的周期性张应变作用下,无血清组成骨细胞凋亡水平、caspase-3活性和caspase-8表达降低,caspase-9表达无明显改变,而血清组成骨细胞凋亡水平、caspase-3活性及caspase-9表达明显低于无血清组相应细胞的各项指标。12%的周期性张应变作用下,无血清组成骨细胞凋亡水平、caspase-3活性和caspase-8表达增高,caspase-9表达无明显改变,而血清组成骨细胞凋亡水平、caspase-3活性及caspase-9表达明显低于无血清组。周期性张应变作用下,血清组和无血清组caspase-8的表达无显著差异。结论无血清状态下周期性张应变对成骨细胞的凋亡有影响。血清通过caspase-9/caspase-3途径减弱周期性张应变对成骨细胞凋亡的影响。