人原代呼吸道上皮细胞培养及抗呼吸道合胞病毒活性

为建立人原代呼吸道上皮细胞(Human airway epithelial cell,hAEC)的培养方法,并在hAEC体系上探讨3-硫代吲哚类化合物RSV-A-4和免疫抑制剂代谢产物6-MMPr的抗呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)活性及其机制,从而构建可用于RSV药物筛选及药效评价的细胞模型。采集人呼吸道上皮细胞样本,分离细胞后建立hAEC的培养方法,并进行细胞形态和活力鉴定;在hAEC体系上检测小分子化合物RSV-A-4和6-MMPr的抗RSV活性及其细胞毒性;采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)与Time-of-addition assay技术,探讨RSV-A-4和6-MMPr的抑制RSV复制的作用机制。培养的hAEC经鉴定:其体外培养存活率可达93.51%;RSV-A-4和6-MMPr的半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC_(50))分别为(207.30±4.77)μmol/L和(3191.00±6.11)μmol/L,6-MMPr的半数细胞毒性浓度(Half maximal cytotoxic concentration,CC_(50))为(95526.00±10.97)μmol/L,而RSV-A-4对hAEC未见明显细胞毒性;RSV-A-4和6-MMPr均在RSV病毒基因组复制阶段抑制RSV复制。成功建立可用于抗RSV药物筛选及体外评价的hAEC培养体系,RSV-A-4和6-MMPr在细胞水平均能有效抑制RSV复制。

呼吸道合胞病毒对上呼吸道感染儿童呼吸道上皮细胞自噬和mTOR信号通路基因的影响

目的 探讨呼吸道合胞病毒(RSV)对上呼吸道感染儿童呼吸道上皮细胞自噬和mTOR信号通路相关基因的影响。方法 选择2022年11月至2023年12月唐山职业技术学院附属医院收治的145例上呼吸道感染儿童为研究对象,同时纳入同期体检的年龄和性别匹配的健康儿童(n=10)为健康对照组。采集所有儿童鼻咽分泌物标本(NPA),利用RT-PCR进行RSV筛查,通过G(黏附)基因扩增测定RSV毒株的分子特征并进行系统发育分析。利用qRT-PCR检测25例RSV阳性NPA样本(RSV组)和10例健康对照NPA样本(健康对照组)的呼吸道上皮细胞自噬相关基因(BECN1、ATG3、ATG5、NPC1与GABARAP)和mTOR信号通路相关基因(AKT1、mTOR、PDPK1、RICTOR与TSC1)的表达水平。结果 在145份上呼吸道感染儿童NPA样本中,69份(47.6%)为RSV阳性。对31株有代表性的RSV进行循环基因型检测,经BLAST分析,31株RSV均为RSV-A型。通过靶向G基因的胞外域部分,系统发育分析发现31株RSV-A聚类为具有72 bp核苷酸重复的ON1基因型。此外,毒株分别属于谱系1(51.6%),其次是谱系3(29%)和谱系2(19.4%)。RSV组呼吸道上皮细胞中ATG3和NPC1 mRNA表达水平显著高于健康对照组(均P<0.001)。RSV组呼吸道上皮细胞中AKT1、mTOR和TSC1 mRNA表达水平显著低于健康对照组(均P<0.001)。结论 RSV感染可以提高上呼吸道感染儿童呼吸道上皮细胞中自噬相关基因(ATG3和NPC1)的表达,抑制mTOR信号通路相关基因(AKT1、mTOR和TSC1)的表达,进而逃避宿主免疫系统,以实现其在宿主内的生存方式。

副猪格拉瑟菌5型细胞致死性膨胀毒素CdtB破坏猪呼吸道上皮屏障的机制

旨在探究副猪格拉瑟菌(Glaesserella parasuis,GPS)突破猪呼吸道上皮屏障引起系统性感染的机制。通过超速离心和密度梯度离心提取副猪格拉瑟菌外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs),OMVs经SDS-PAGE显示,蛋白质条带分布在55~100 ku,经透射电子显微镜(TEM)观察,OMVs的粒径在100~200 nm,纳米粒子直径分析(NTA)结果显示,样品在100~200 nm处的粒子数目最多。进而用制备的HbpA及OmpP2多克隆抗体对OMVs及不含OMVs的细菌上清进行Western blot验证,证实所提取的样品为外膜囊泡,且进一步结果证明细胞致死性膨胀毒素(CDT)在GPS培养物中主要以OMVs的形式存在。用OMVs或CdtB处理猪气管上皮细胞(swine tracheal epithelial cells, STEC)36 h,检测STEC中cleaved-caspase3、ZO-1和Occludin的蛋白表达水平,并用FITC-葡聚糖(FD-4)检测STEC单层细胞的细胞旁通透性。结果发现,OMVs与CdtB处理后凋亡相关蛋白cleaved-caspase3表达水平升高,ZO-1和Occludin的表达水平降低,FD-4渗透率升高,同时,乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试验发现,当CdtB与STEC单层细胞共孵育24 h、OMVs与STEC单层细胞共孵育36 h后,STEC存活率显著降低。而Pifithrin-α预处理STEC可抑制OMVs和CdtB引起的细胞凋亡和屏障通透性的增加。另外,用免疫磁珠捕获的方法去除OMVs中的CdtB(OMVs-ΔCdtB),OMVs-ΔCdtB处理STEC 36 h后cleaved-caspase3、ZO-1、Occludin表达水平与对照组相比无显著差异。综上,成功提取并纯化GPS OMVs,且试验证明GPS可通过OMVs转运CdtB诱导STEC凋亡和屏障损伤,为副猪格拉瑟菌突破呼吸道上皮屏障的机制提供新思路。

呼吸上皮细胞在臭氧气液界面暴露后的氧化损伤效应研究

目的探讨臭氧(ozone,O3)对人呼吸上皮细胞(human respiratory epithelial cells,BEAS-2B)的氧化损伤效应及氧化损伤与炎症效应分子分泌的关系。方法利用完全融合并分化完全的人呼吸上皮细胞及petri-PERM透气培养皿建立臭氧体外暴露系统,设立对照(无菌空气)组和高(0.50 mg/m3)、低剂量(0.16 mg/m3)臭氧暴露组以及低剂量(0.16 mg/m3)臭氧暴露+N-乙酰半胱氨酸(NAC,0.01 mol/L)保护组,分别培养1、8 h。测定细胞内GSH、GSSG含量和SOD活力以及细胞培养上清液中IL-2和NO浓度,并观察细胞形态。结果与对照组比较,低剂量和高剂量臭氧暴露组BEAS-2B细胞内GSH/GSSG值较低,细胞内SOD活力以及细胞培养上清中NO和IL-2浓度较高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与低剂量臭氧暴露组比较,低剂量臭氧暴露+NAC保护组BEAS-2B细胞内GSH/GSSG值较高,细胞内SOD活力以及细胞培养上清中NO和IL-2浓度较低,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。低剂量臭氧暴露+NAC保护组与对照组BEAS-2B细胞内GSH/GSSG值和SOD活力以及细胞培养上清液中IL-2和NO浓度间比较,差异均无统计学意义。在细胞形态上,随着臭氧暴露浓度的升高,BEAS-2B死亡细胞数明显增加,细胞变小变圆;而经NAC保护的细胞生长规则,排列紧密,与对照组基本一致。结论臭氧能对支气管上皮细胞造成氧化损伤,改变细胞内氧化还原状态,并可能诱导支气管上皮细胞合成炎症介质参与气道炎症的启动;而抗氧化剂NAC可以抑制低剂量臭氧暴露对支气管上皮细胞的氧化损伤和炎症介质释放。

基于人呼吸道上皮细胞炎症模型的连翘提取物抗炎活性实验研究

通过复制LPS诱导的BEAS-2B炎症模型，探讨连翘提取物对炎症反应中炎性因子分泌的作用。采用MTT法检测BEAS-2B细胞活力，筛选连翘乙醇提取物（FSEE）、60%连翘酯苷A（60% FTA）、90%连翘酯苷A（90% FTA）最佳给药浓度；采用倒置显微镜观察连翘提取物对细胞作用后的细胞形态；采用Griess Reagent法检测细胞培养上清NO含量；流式细胞术检测细胞内活性氧（ROS）的水平。毒性试验结果表明，连翘提取物浓度小于128 μg/mL时，对BEAS-2B细胞没有产生毒性；浓度在128-256 μg/mL时，60% FTA与90% FTA均表现出对细胞的毒性。抗炎结果表明，在给药浓度设置为25、50、100 μg/mL时，三种提取物均表现出减少NO分泌的效果（P〈0.01），90% FTA组存在剂量依赖关系；三种提取物可显著降低LPS诱导的BEAS-2B细胞胞内活性氧的水平（P〈0.05），且呈量效关系。另外，FSEE、60% FTA、90% FTA组间的治疗效果也逐渐增强。由此得出，90% FTA为连翘提取物抗炎作用的主要活性部位，其抗炎活性成分可能为连翘酯苷A，这将为连翘抗炎活性的进一步研究提供基础。

纳米氧化锌对人呼吸道上皮细胞白细胞介素-8表达的影响

目的:探讨纳米氧化锌对人支气管上皮细胞(BEAS-2B)及肺泡上皮细胞(A549)内炎症相关因子白细胞介素-8(IL-8)表达的影响。方法:以BEAS-2B及A549细胞作为靶细胞,应用荧光定量PCR技术及ELISA法检测分析不同剂量纳米氧化锌(0、1、2和4μg/cm2)对细胞内IL-8mRNA和蛋白表达的影响。结果:纳米氧化锌作用2、4h,BEAS-2B细胞中IL-8mRNA及蛋白的表达随纳米氧化锌作用剂量的升高而升高(mRNA:F分别为31.985、54.648,P均<0.001;蛋白:F分别为128.686、65.486,P均<0.001);A549细胞中IL-8mRNA及蛋白的表达亦随纳米氧化锌作用剂量的升高而升高(mRNA:F分别为37.652、9.173,P均<0.01;蛋白:F分别为127.299、76.354,P均<0.001)。结论:纳米氧化锌可提高人支气管和肺泡上皮细胞内IL-8mRNA及蛋白的表达水平。

表皮生长因子受体及PI3K在硫酸锌诱导人呼吸道上皮细胞间粘附分子-1表达过程中的作用

目的探讨硫酸锌对上皮细胞内细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的影响及其分子生物学机制。方法应用PCR与蛋白质免疫印迹试验检测硫酸锌诱导人呼吸道上皮细胞ICAM-1mRNA与蛋白的表达,以及表皮生长因子受体(EGFR)及PI3K的活化。结果硫酸锌可诱导ICAM-1mRNA与蛋白的过量表达。在同一试验条件下,硫酸锌可诱发EGFR及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)下游激酶Akt的磷酸化或活化。用EGFR抑制剂(PD153035)及PI3K抑制剂(LY294002)预处理上皮细胞,可明显抑制硫酸锌对ICAM-1表达的诱导作用。结论硫酸锌可激活EGFR与PI3K/Akt信号传导通路,进而上调ICAM-1的表达。

绿脓菌素激活MAPKs、NF-κB信号通路诱导呼吸道上皮细胞IL-8表达

采用绿脓杆菌培养上清及绿脓菌素刺激人呼吸道上皮细胞株A5 4 9和SPC A 1,用ELISA方法检测细胞IL 8分泌水平 ,并使用免疫印迹 (Westernblot)方法观察绿脓菌素对细胞内重要的炎症信号传导途径NF κB及丝裂原激活蛋白激酶 (MAPKs)的激活作用。实验发现 ,绿脓杆菌培养上清及绿脓菌素可诱导呼吸道上皮细胞株IL 8分泌增加 ,且具有剂量依赖效应。绿脓菌素刺激细胞可使细胞内IκB α发生降解 ,同时使MAPK家族蛋白分子 (ERK1 2、p38、JNK)发生磷酸化。MEK1 2 (ERK1 2激酶 )抑制剂U0 12 6 (10 μmol L)和p38MAPK抑制剂SB2 0 35 80 (10 μmol L)可降低绿脓菌素诱导A5 4 9细胞IL 8的合成。以上结果显示绿脓菌素通过MAPK信号传导通路增强呼吸道上皮细胞IL 8的表达 ;NF κB通路也参与了绿脓菌素调控细胞IL

肝素阻断呼吸道合胞病毒与呼吸道上皮细胞黏附作用

目的探讨呼吸道合胞病毒(RSV)与呼吸道上皮细胞的黏附机制。方法采用流式细胞仪定量检测RSV A2原型株与来自囊性纤维化患者的呼吸道上皮细胞株(CFBE)间的黏附效率,观察肝素及多种RSV抗体对黏附效应的影响。结果RSV与CFBE的黏附效率不及人喉淋状细胞癌细胞株(HEp-2)细胞,多种RSV抗体与RSV预孵后未能阻断其与CFBE黏附,但肝素却以剂量-效应依赖模式有效阻断黏附反应。结论CFBE细胞表面糖胺聚糖分子可能介导RSV与呼吸道上皮的黏附,采用流式细胞仪可直接定量评估RSV与靶细胞的黏附效率,优于病毒在靶细胞内繁殖的检测手段。

烟曲霉菌对呼吸道上皮细胞的作用

目的研究烟曲霉菌菌丝片段和孢子对气道上皮细胞的作用。方法烟曲霉菌菌丝片段和照射灭活的孢子分别与气道上皮细胞系A549共培养,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测A549细胞释放到培养液内的白细胞介素(IL)-6和IL-8。结果菌丝片段刺激A549细胞产生有限的IL-6、IL-8;孢子抑制A549释放IL-6。结论烟曲霉菌菌丝片段和孢子被吸入气道后,致少量细胞因子甚至抑制细胞因子产生,不能使足够的炎症细胞向局部趋化,逃避吞噬,长期存活、芽生、释放大量过敏原。

丙酸氟替卡松对呼吸道上皮细胞基因表达的不同作用

目的呼吸道上皮细胞在固有免疫和炎症反应中都扮演重要角色。本文旨在研究强效吸入型糖皮质激素丙酸氟替卡松(FP)对双链RNA(dsRNA,Toll样受体3的配体)刺激的呼吸道粘膜上皮细胞BEAS-2B产生的某些固有免疫相关蛋白和炎性细胞因子的作用。方法FP(10-7mol.L-1)作用于BEAS-2B 2 h后,加入dsRNA 25 mg.L-1继续培养18 h,提取细胞RNA和收集细胞培养上清液。实时定量PCR测定炎性细胞因子IL-8、GM-CSF、IL-1β和固有免疫蛋白血清淀粉样蛋白(SAA)、补体B因子、分泌性白细胞蛋白酶抑制物(SLPI)的mRNA含量;ELISA分析上清液中IL-8、GM-CSF、SAA蛋白水平。结果BEAS-2B细胞在dsRNA刺激后,IL-8、GM-CSF、IL-1β、SAA、补体B因子、SLPI的mRNA均增高。FP预处理的细胞,在dsRNA刺激后,SAA、补体B因子、SLPI的mRNA水平不降低,IL-8、GM-CSF、IL-1β的mRNA水平明显降低。IL-8、GM-CSF、SAA的ELISA分析证实了mRNA的试验结果。结论FP在强效抗炎的同时,并不损伤呼吸道上皮局部的固有免疫。

呼吸道立方形上皮细胞分泌蛋白对呼吸道合胞病毒肺部感染和免疫调节的作用

目的探讨呼吸道立方形上皮细胞分泌蛋白(CCSP)对呼吸道合胞病毒(RSV)肺部感染和免疫调节的作用。方法以CCSP基因剔除小鼠[CCSP(-/-)]和野生型小鼠(129J,WT)为模型,通过呼吸道接种感染RSV,然后对肺部的炎症和免疫学反应进行研究。结果与WT小鼠比较,CCSP(-/-)小鼠RSV病毒的清除率下降,肺部炎症增强,Th2细胞因子和中性粒细胞趋化因子水平增加。结论CCSP缺乏可促进RSV感染所引起的肺部炎症和Th2免疫反应。

氧化锌对人呼吸道上皮细胞IL-8表达作用

目的探讨氧化锌对人呼吸道上皮细胞白细胞介素-8(IL-8)表达的影响及其分子生物学机制。方法以人呼吸道上皮细胞作为体外模型,应用PCR与ELISA方法测定氧化锌诱导IL-8mRNA的表达及蛋门的释放,以及表皮生长因子(EGF)受体的磷酸化。结果氧化锌可诱导呼吸道上皮细胞过量表达IL-8mRNA。在同一试验条件下,氧化锌可诱发EGF受体磷酸化。结论EGF受体及细胞吞噬作用在氧化锌诱导呼吸道上皮细胞IL-8表达过程中起重要作用。

结核分支杆菌培养上清诱导呼吸道上皮细胞IL-8表达

目的 :观察呼吸道上皮细胞对结核杆菌产物产生的炎症反应 ,探讨炎症反应信号传递的机制。方法 :制备结核分枝杆菌强毒力H37RV株培养上清 ,用培养上清刺激肺上皮细胞株SPC A 1和A5 49,酶联免疫吸附实验检测细胞IL 8表达量。用突变MyD88表达重组质粒转染SPC A 1细胞 ,观察MyD88与结核杆菌培养上清诱导上皮细胞炎症反应信号传递的关系。结果 :结核分枝杆菌强毒力H37RV株培养上清明显增加SPC A 1和A5 49细胞IL 8的表达。用突变MyD88表达重组质粒 pcDNA3 .1 mMyD88转染SPC A 1 ,结果显著抑制了结核杆菌培养上清对SPC A 1细胞的炎症刺激作用。结论 :结核杆菌培养上清能够诱导呼吸道上皮细胞IL 8表达 ,Toll/IL 1受体信号通路及MyD88分子与细胞炎症反应的信号传递相关 ,提示在肺结核病发病过程中 ,结核杆菌的代谢产物可能刺激肺上皮细胞产生炎症细胞因子 。

流感嗜血杆菌对呼吸道上皮细胞的作用研究进展

流感嗜血杆菌常定植于呼吸道 ,诱发气道局部炎症 ,导致上皮受损 ,它与慢支急性加重有关 ,现就该菌诱导呼吸道黏膜上皮细胞分泌和表达前炎症细胞因子及其合成的有关分子机制、生物学效应及对呼吸道黏膜上皮细胞形态结构影响作一综述。

呼吸道上皮细胞与致病菌相互作用——上皮细胞内吞细菌实验研究

目的:呼吸道上皮细胞在防御这类机会致病菌感染时发挥了重要的作用.本研究旨在探讨上皮细胞能否清除胞内的绿脓杆菌,胞内模式识别受体Nods蛋白家族是否参与胞内杀菌,防御素是否能通过促经克雷伯杆菌粘附到上皮细胞而被上皮细胞内在化而清除.

MBL在绵羊呼吸道上皮细胞抗肺炎支原体感染过程中的机制探讨

为了探究甘露糖结合凝集素(MBL)对绵羊呼吸道黏膜上皮细胞抵御绵羊肺炎支原体(MO)感染的作用,本研究从绵羊血清中提取天然MBL蛋白,将绵羊呼吸道黏膜上皮细胞分4组,分别处理为:接种MO前细胞培养基中添加MBL蛋白;接种MO后细胞培养基中添加MBL蛋白;接种MO后继续细胞培养;正常培养。采用荧光定量PCR的方法,对各组细胞MBL、C3、ICAM-1、IL-6、SBD-1基因的表达量进行研究。结果显示:与对照组相比,其他组细胞密度均减少,且MBL、C3基因的表达量显著下降(P<0.05),同时ICAM-1、IL-6基因的表达量显著升高(P<0.05);接种MO前加入MBL的细胞ICAM-1基因的表达量相对其他组显著升高(P<0.05),且其SBD-1基因表达量极显著升高(P<0.01)。被MO感染的各组细胞均产生免疫应答,在感染前加入MBL组细胞的免疫应答更强烈,该过程或有ICAM-1和SBD-1参与。

TNF及铜绿假单胞菌刺激呼吸道上皮细胞表达NOD2蛋白

目的:通过对TNF及铜绿假单胞菌(PAO1)刺激肺上皮细胞株(A549)表达胞浆蛋白NOD2的研究,进一步了解NOD2在机体天然免疫病原体识别过程中的作用。方法:培养呼吸道肺癌上皮细胞株A549,以TNF、铜绿假单胞菌PAO1刺激细胞,并以未刺激组做对照,通过半定量RT-PCR技术观察胞浆蛋白NOD2的表达变化。结果:与未刺激组比较,TNF、铜绿假单胞菌PAO1都能够上调A549细胞NOD2蛋白的表达。结论:TNFα与铜绿假单胞菌PAO1刺激能增强A549细胞胞浆蛋白NOD2的表达,提示细胞内受体NOD2在呼吸道天然免疫病原体识别过程中可能起重要作用。

HNP对肺炎克雷伯杆菌粘附呼吸道上皮细胞的影响

目的:探讨呼吸道抗感染防御机制,观察人中性粒细胞α-防御素(HNP)对肺炎克雷伯杆菌粘附呼吸道上皮细胞的影响。方法:从人中性粒细胞分离纯化HNP。A549细胞与HNP(20μg.ml-1)及两株肺炎克雷伯杆菌临床分离株共同孵育4小时,用平板培养菌落计数法测定与细胞粘附的活菌数。结果:在HNP存在的情况下,Kp03183株细菌对肺上皮细胞的粘附提高了12倍(P<0.01),Kp03116株细菌对上皮细胞的粘附提高了5倍(p<0.01)结论:HNP显著增强肺炎克雷伯杆菌粘附于呼吸道上皮细胞,可能有利于呼吸道清除细菌。

不同类型呼吸道上皮细胞感染金黄色葡萄球菌的基因表达差异研究

目的从分子水平研究不同呼吸道上皮细胞感染金黄色葡萄球菌的机制,为临床诊治提供数据依据。方法在GEO基因芯片数据库中得到不同呼吸道上皮细胞感染金黄色葡萄球菌后的表达谱数据,筛选出前50个最显著的差异基因。对差异基因进行GO和Pathway分析,筛选出在不同气道感染情况中金黄色葡萄球菌最显著的信号通路。结果在16HBE14o-和S9细胞株感染表达/非表达Hla毒素金黄色葡萄球菌中,分别筛选1164个和201个显著差异基因(差异大于1.5倍)。差异基因相关的信号通路中,主要是MAPK、JAK/STAT及Toll样受体通路等与免疫反应关系密切。S9细胞株中,主要是FOS蛋白、EGR1蛋白、DUSP1蛋白、ATF3蛋白互作联系紧密;而16HBE14o-细胞株中,蛋白互作不大。结论16HBE14o-和S9细胞株中,表达/非表达Hla毒素金黄色葡萄球菌感染时的基因表达差异显著,S9细胞株的蛋白互作联系紧密。