猪繁殖与呼吸综合征病毒S1株单克隆抗体的制备及生物学特性研究

通过差速离心和蔗糖密度梯度离心法对猪繁殖与呼吸综合征病毒沪 1(PRRSV_S1)株进行抗原纯化。免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞与SP2 / 0融合 ,用间接ELISA和有限稀释法 ,获得 2株稳定分泌抗PRRSV单抗的杂交瘤细胞株 ,分别命名为AG1、BD3。ELISA交叉试验和阻断试验表明 ,2株单抗具有高度特异性。AG1可与PRRSV_S1,欧洲株LV ,美洲株VR_2 332反应 ,而BD3与美洲株VR_2 332反应较弱 ,2株单抗对猪细小病毒 (PPV)、猪伪狂犬病病毒 (PRV)、猪乙型脑炎病毒 (JEV)均不反应。阳性杂交瘤细胞的上清液效价是 1∶2 5 6～ 1∶5 12 ,腹水效价分别在 1∶10 3 ～ 1∶10 5之间。AG1和BD3各有 10 0条染色体 ,琼脂双扩散试验结果表明AG1属于IgG2b ,BD2属于IgM。

猪繁殖与呼吸综合征病毒S1株单抗AG1的生物学特性及夹心ELISA诊断方法的建立

用纯化的猪繁殖呼吸综合征病毒沪1株（PRRSV-SI）病毒液作抗原,免疫BALB/C小鼠,获得1株稳定分泌抗PRRSV单抗的杂交瘤细胞株,命名为AG1。ELISA交叉试验和阻断试验表明,AGI具有高度特异性。AGI可与PRRSV-S1、美洲株VR-2332、欧洲株LV反应,对猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）均不反应。阳性杂交瘤细胞的上清液效价是1:256～512,腹水效价在1:10-3～10-5之间。AG1有100条染色体,琼脂双扩散试验结果表明AG1属于IgG2b。Western blotting试验表明 AG1是针对 N蛋白抗原表位的特异性单抗。以AG1为捕捉抗原抗体和酶标抗体,建立了快速检测PRRSV抗原的单抗夹心ELISA法,该方法具有快速、灵敏、准确、广谱等特点。

2013—2021年云南省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行与混合感染状况调查

【目的】调查云南省猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的流行规律和混合感染情况。【方法】采用分子生物学方法对2013—2021年间的3112份血液样品进行PRRSV核酸检测,并进一步分析其流行和混合感染情况。【结果】检测样品中,有801份样品为PPRSV阳性,阳性率为25.74%,二重、三重和四重混合感染率分别为41.20%、12.48%和1.87%;不同生长阶段猪群的PRRSV感染程度差异较大,生长育肥猪感染最严重(33.24%);相对于育肥场和散养户,种猪场的感染程度较轻,三者的感染率分别为27.94%、28.94%和14.29%。对不同毒株类型分析发现:高致病性毒株和经典毒株仍是主要的流行毒株,分别占毒株数的58.49%和22.64%,但占比呈逐年下降趋势。于2019年和2021年在云南省内分别发现了类NADC30毒株和类NADC34毒株,分别占毒株数的15.09%和3.77%,其感染率呈逐渐上升趋势。【结论】猪繁殖与呼吸综合征仍是影响云南省生猪产业健康发展最重要的疫病之一,表现形式以和其他疾病混合感染为主。随着新毒株的发现,云南省PRRSV基因更加多样,防控形势愈加复杂。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JL株Nsp10基因生物信息学分析

本研究旨在对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)贵州JL株Nsp10基因(GenBank登录号:EU886322)进行生物信息学分析,了解其生物学特征,为下一步Nsp10的表达和ELISA检测方法的建立奠定基础。应用BioEdit、DNAStar、PsortⅡ、SignalP、TMHMM、ProtFun、Clustal_1.81、Mega等软件对Nsp10蛋白的理化参数、信号肽、跨膜区域、亲水性、表面可及性、抗原性、二级结构、亚细胞定位及与其他PRRSV毒株相应片段同源性等进行分析和预测。该蛋白理论分子质量为26.38ku,pI为8.93,为稳定蛋白,不含信号肽,无跨膜结构,具有良好的形成抗原表位的条件。亚细胞定位结果表明,该蛋白极有可能位于细胞质,其编码氨基酸序列与参考毒株同源性为97.4%～100%。该蛋白保守性较高,是可溶性蛋白,有良好的抗原性,具备作为靶蛋白建立免疫方法的条件。

猪急性腹泻综合征冠状病毒S1蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)S1蛋白抗体的间接ELISA检测方法,本研究通过构建重组真核分泌型表达质粒p CAGGS-S1-His并转染HEK293F悬浮细胞进行可溶性表达S1蛋白。转染重组质粒5 d后的细胞上清利用HisTrapTMExcel亲和层析柱纯化,浓缩后的蛋白经SDS-PAGE、western blot鉴定显示获得了分子量约为130 ku且大于理论大小的重组S1蛋白,表明该蛋白为分泌表达且具有良好的翻译后修饰。利用获得的重组S1蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件,初步建立了SADS-CoV S1蛋白抗体的间接ELISA检测方法。该方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)阳性血清均无交叉反应,仅与SADS-CoV阳性血清反应,表明该方法特异性较强;该方法检测SADS-CoV阳性血清,当稀释至1:3 200时仍为阳性,表明该方法具有较高的敏感性;对4份阳性血清的批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明该方法具有良好的重复性和稳定性;利用该方法和间接免疫荧光试验(IFA)对50份临床样品检测,结果显示该间接ELISA检测到9份阳性样品,41份阴性样品;IFA检出5份阳性样品,45份阴性样品,二者的总符合率为92%。综上表明,本研究建立的间接ELISA检测方法能够特异、灵敏地检测SADS-CoV S1蛋白抗体,可以用于SADS-CoV灭活疫苗的免疫效果评价以及该病原的血清学流行病学调查和免疫水平监测,为SADS-CoV所致疫病的鉴别诊断和防控奠定基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株非结构基因的分子克隆及其基因特征的研究

对猪繁殖与呼吸综合征病毒的非结构基因 (ORF1)和非编码区分别进行了克隆和测序 ,并对其基因特征作了分析。结果表明 ,CH_1a株ORF1全长 11882nt,其中ORF1a长 75 12nt、ORF1b长 4374nt。它们与VR2 332株的核苷酸同源性分别为 89%、92 % ;与LV株的核苷酸同源性分别为 5 4%、6 3.3%。ORF1编码两个聚合蛋白 ,其中ORF1a编码的聚合蛋白经裂解后产生 6个成熟的非结构蛋白 (Nsp1α、Nsp1β、Nsp2_5 ) ,以Nsp2的变异性最为显著 ,它与LV株的氨基酸同源性为 41%。ORF1b编码的聚合蛋白经裂解后 ,产生 4个成熟的非结构蛋白 (RdRpCP2_4) ,其中RdRp为病毒的复制酶 ,CP4表现出较大的变异性 ,与LV株的氨基酸同源性为 48%。在ORF1a_ORF1b的衔接区有保守的庚核苷酸滑动序列和拟节结构 ,它们是核糖体移码翻译所必需的结构。在基因组末端存在非编码区 ,其中 5’NCR长 190nt,比LV株 5’NCR短 31nt,其核苷酸同源性为 6 1%。 3’NCR长 15 1nt,比LV株 3’NCR长 37nt,保守性稍高 ,其与VR2 332株和LV株的核苷酸同源性分别为 95 .4%和 78.2 %。在 3’NCR末端有一个poly(A)尾巴 ,长 2 0nt。在Poly(A)尾上游有保守的八核苷酸序列 ,是复制酶识别并结合的区域。

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核蛋白基因在原核系统中的高效表达与初步应用

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH_1a株核蛋白基因克隆至原核表达载体pET30a的多克隆位点中 ,经鉴定后得到重组质粒pET30a_N ,将此重组质粒转化到受体菌BL2 1中 ,用诱导剂IPTG分别以不同浓度进行诱导 ,并在不同诱导时间进行采样 ,经处理后做SDS_PAGE、Western_blot分析 ,并以此为包被抗原进行ELISA检测 ,结果发现以终浓度为 1mmol/L的IPTG进行诱导 ,4小时后表达可达到高峰 ,其大小约为 2 3kD ,薄层扫描结果表明该蛋白表达量约占菌体蛋白总量的 32 % ,该蛋白不仅与PRRSV阳性血清能发生特异性反应 ,而且可被PRRSV抗N蛋白单抗所识别 ,证实此大量表达的蛋白为核蛋白。将此表达产物应用ProBondTM纯化系统进行纯化 ,其纯度可达到 91% ,纯化后的蛋白以 5 0 μg/孔包被 96孔板 ,检测来自不同地区送检的猪血清 ,同时以全病毒ELISA为对照 ,结果发现二者的符合率高达 93.3% ,而应用该蛋白进行检测其反应更为敏感 ,且背景低 ,制备过程简单 ,这将为今后应用该蛋白作诊断抗原检测PRRSV奠定了基础。

猪繁殖与呼吸综合征河南毒株Henan-1的分离及其NSP2、ORF3、ORF5的序列分析

将2007年1月河南省某猪场送检的疑似高热病病料处理后接种于Marc-145细胞，出现细胞聚集、固缩、脱落等特异性细胞病变。根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的基因序列设计并合成针对NSP2、ORF3和ORF5基因的引物，RT-PCR扩增目的基因并将其克隆入pMD18-T载体进行测序。并与国内外已发表的毒株的序列进行比较。结果表明：分离毒株Henan-1是美洲型PRRSV，而且NSP2基因发生30个AA的不连续缺失；Henan-1的NSP2、ORF3和ORF5基因与JXA1、JX0612、HZ-X、HB-1（sh）、CH-1a、HB-2（sh）、SP、ATCC VR-2332、Henan-HN1、Resp PRRS／Repro MLV、PA8、BJ-4等毒株等位基因的核苷酸同源性分别为83．0％～99．0%、88．3％～99．2％、88．6％～99．5％，推导的氨基酸同源性分别为66．7％～97．9％、84．7％～98．8％、87．1％～99．5％；而ORF3和ORF5基因与LV4．2．1等位基因核苷酸同源性分别为64．7％和64．2％，推导的氨基酸同源性分别为56．7％和61．0％。基因系统发育树分析表明：Henan-1与JXA1、JX0612株的亲缘关系很近，与HB-1（sh）亲缘关系较近，与HZ-X、CH-1a、HB-2（sh）、SP、RespPRRS／Repro MLV等毒株处于不同的分支。

猪繁殖呼吸综合征病毒(PRRSV)S_A毒株的分离与鉴定

从仔猪内脏分离到一株猪繁殖呼吸综合征病毒 (PRRSV)毒株 ,该毒株能在Marc 14 5细胞上增殖致细胞病变 ,该病变能被PRRSV美洲型阳性血清所抑制 ,不被乙脑病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒阳性血清所抑制 ,经美洲型PRRSV荧光抗体染色呈阳性反应 ,电镜观察到直径 5 5nm左右的病毒粒子 ,属RNA病毒 ,接种阴性仔猪未见临床症状异常 ,但血清学阳性。命名该分离毒为PRRSV SA 毒株。

2016年我国3株欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其全基因组特征分析

2016年,本实验室共检测到3株基因1型(欧洲型)猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),分别命名为ZD1株、WK14株和WG9株,本研究对3株PRRSV进行了全基因组序列分析。遗传演化分析显示,3株PRRSV均属于基因1型I亚型,与基因1型代表株LV的核苷酸同源性为88.7%~88.9%,与基因2型代表株VR2332的核苷酸同源性为60.7%~60.8%。ORF3与ORF4推导氨基酸序列比对结果显示,ZD1株的ORF3提前26个氨基酸(aa)终止,这是首次报道基因1型PRRSV编码的结构蛋白存在提前终止现象,WK14株与WG9株在ORF3的245位存在1个氨基酸的缺失;3株PRRSV在ORF4的66位皆存在1个氨基酸的缺失。Simplot生物学重组软件分析表明,WK14株为重组病毒,供体病毒株为BJEU06-1,提供重组片段的病毒株为NVDC-FJ,重组位置位于第931~3 379位碱基处。ZD1株和WG9株未发现重组现象。本研究发现我国欧洲型PRRSV基因组在缺失、重组等方面正发生一些新的变化,有必要对该类病毒进行持续监测和深入研究。

猪繁殖呼吸综合征病毒S3毒株的分离及其免疫特性研究

从某猪场仔猪体内分离到一株 PPRSV毒株 ,该毒株能在 Marc-1 4 5细胞上增殖产生致细胞病变 ,该病变能被 PPRSV美洲型阳性血清所抑制 ,不被乙脑病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒阳性血清所抑制 ,经美洲型 PPRSV荧光抗体染色呈阳性反应 ,电镜观察到直径 55～ 60 nm的病毒粒子 ,接种阴性仔猪未见临床症状异常 ,但抗体检测阳性。命名该分离毒为 PPRSV-S3毒株。在 S3弱毒株分离鉴定的基础上 ,进一步在猪体上对其致病性和免疫力进行研究。S3毒株接种仔猪后 ,仔猪不表现任何症状 ,也不向外排毒。4～ 5周龄的仔猪接种 S3株后可产生坚强的免疫力 ,免疫后 4～ 6个月能抵抗强毒攻击。后备母猪配种前 2～ 3周免疫接种 S3株 ,怀孕 90～95d攻强毒 ,未发生流产、死胎、木乃伊胎、产弱仔等繁殖障碍现象。结果表明 ,S3是一株自然分离的弱毒株 ,且具有良好的安全性和免疫力。

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1R株致弱过程中ORF5基因遗传变异分析

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株在Marc-145细胞上传代,用85代(S85)病毒对35日龄的仔猪进行人工感染试验,证实该毒株已经被致弱,将其命名为CH-1R株。利用RT-PCR扩增10个不同代次的CH-1a株和CH-1R株病毒的ORF5基因,并与9株参考毒株进行RFLP分析,发现了一个特异性的内切酶酶切位点-TspEⅠ。根据该酶切位点,可以区分CH-1R株、CH-1a株、其它野生型毒株和参考毒株。ORF5基因的变异分析显示,该致弱毒株与CH-1a株以及其它8株参考毒株存在着差异,并且它们的氨基酸同源性在88.5%～97.0%之间。系统进化树研究表明该弱毒株仍属于CH-1a亚支。

焦磷酸测序技术在确认北京严重急性呼吸综合征(SARS)病毒株并检测基因突变中的应用

结合严重急性呼吸综合征(SARS)病毒株序列信息分析和高通量测序技术,建立一种快速、简单地确定SARS病毒株并筛查SARS病毒突变位点和突变频率的方法。从感染人SARS病毒的Vero-6细胞中提取病毒RNA,反转录为cDNA后,PCR扩增目的基因片段,采用焦磷酸测序技术(PyrosequencingTechnology,PSQ)进行第2601、79199、4791、9838多个碱基突变位点测序和突变频率分析。通过测序分析多个可能出现突变的位点,确定了该病毒为北京流行株,同时发现第7919位碱基发生了A/G突变。PSQ技术对于高通量筛选研究病毒基因的突变和确定病毒株型别有着简单、快速、灵敏的特点。利用生物信息学分析核酸多态性,结合实验验证,可以确定SARS病毒流行株的特征,有利于对突发事件及早确定传染来源。

猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲株与NSP2变异株二重PCR诊断方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型标准株VR2332保守序列与近年PRRSV自然变异株序列分析研究,设计合成了2对特异引物,分别扩增出225、427bp两条特异型基因片段,通过优化RT-PCR条件,建立了可同时检测PRRSV标准株和NSP2变异株的二重PCR诊断方法。应用该方法分别对广西不同地区的16份病、死猪的血液、肺等组织进行检测,结果15份PRRSV阳性,其中1份为标准株,14份为变异株。试验结果表明,PRRSV标准株与变异株二重PCR诊断方法具有高度特异性、敏感性和实用性,可用于临床诊断,为目前流行的猪高热病病原研究及广西PRRS的防制提供了一定科学依据。

猪繁殖与呼吸综合征病毒JX0708株的分离鉴定及其Nsp2基因的遗传变异分析

采集江西省某猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,RT-PCR检测可扩增出PRRSV ORF7特异性片段,序列分析发现其与美洲型毒株序列一致性达93.9%以上,与欧洲型毒株仅为69.8%。将采集的脑和肺脏处理后接种Marc-145细胞盲传,在盲传的细胞中可扩增到PRRSV ORF7特异性片段,传至第6代时出现明显的细胞病变;将该毒株NSP2非结构蛋白基因测序分析,发现其编码的氨基酸与国内近年来分离的高致病性PRRSV毒株有较高的同源性,与美洲型代表株VR-2332相比缺失第482位和533-561位共30个氨基酸;纯化病毒并进行电镜观察,可见典型的PRRSV病毒粒子。第8代的细胞毒回归30日龄仔猪,可观察到猪繁殖与呼吸综合征典型症状和病理变化。这表明已成功地分离到1株美洲型PRRSV变异株,命名为JX0708株。

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白1α(nsp1α)的N端锌指结构是其抑制NLRP3炎症小体活性所必需

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是严重危害养猪业的病毒性传染病之一,其致病原猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抑制宿主的天然免疫和特异性免疫反应,引起机体免疫抑制,造成持续性感染,从而给该病的防控带来困难。NLRP3炎症小体作为先天性免疫的重要组分在机体抗病毒中发挥重要作用。前期研究发现PRRSV能够激活NLRP3炎症小体,但PRRSV是否存在拮抗NLRP3炎症小体的组分还未见报道。本研究首先在缺失内源性炎症小体的HEK293T细胞中,共转染NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β四个真核表达质粒,建立NLRP3炎症小体的体外研究模型。然后,在该炎症小体模型细胞和猪肺泡巨噬细胞中,转染PRRSV nsp1α的真核表达质粒,结果表明nsp1α能够明显拮抗炎症小体的活化,而进一步的突变试验表明缺失N端锌指(ZF)结构或者突变ZF结构的nsp1α均不能抑制NLRP3炎症小体活化。本研究不仅首次发现了拮抗NLRP3炎症小体活化的PRRSV蛋白——nsp1α,而且发现nsp1α的N端锌指结构是其抑制NLRP3炎症小体活性所必需。本研究进一步发现了PRRSV拮抗天然免疫的新机制,并为PRRSV的防控提供了潜在的分子靶点和理论指导。

11株猪繁殖与呼吸综合征病毒中国分离株NSP2、ORF5、ORF7基因的序列分析

2008年1月至2012年12月在中国进行的猪繁殖与呼吸综合征的跟踪调查中,从辽宁、吉林、河北、山东、河南、上海、浙江和广西8个省收集到的病料中分离到11株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)分离株,分别扩增、克隆及用RT-PCR检测这11株猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株的NSP2、ORF5和ORF7基因的全序列,然后与其他分离株的已登录序列进行比对。结果表明,所有分离株的基因分型均属于美国株,但是与JXA1同源性很高,高致病性毒株为中国所特有。11株分离株均在NSP2基因含有90个核苷酸的缺失,这表明2008年流行的PRRSV为该基因缺失分离株。在这11株分离株的ORF5和ORF7基因的特定区域发现更多一致的突变,如GP5的信号肽和跨膜区及N蛋白的Pat7修饰区。这些突变是否影响PRRSV的核定位,还有待于进一步的研究来验证。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)免疫后病毒血症和抗体消长规律

应用高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)对28-30日龄的仔猪进行免疫,前8周每周采血,8周后每2周采血进行疫苗毒核酸检测和抗体水平检测,直至免疫后第16周。结果表明,高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)在血清中存在的最长时间大约为6周;抗体从免疫后第2周开始转阳,至第3周时全部为阳性,并且抗体水平不断上升,至免疫后第10周时平均抗体水平达到最高。

2008年-2015年我国猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株遗传进化分析

对2008年-2015年分离的56个PRRSV毒株进行全基因测序和序列比对,并对主要易变区Nsp2、GP5和非编码区进行分析。全基因分析结果显示,56个PRRSV均为美洲型PRRSV,其中54个毒株为高致病性PRRSV变异株,另外2个为类NADC30 PRRSV。54个高致病性PRRSV变异株之间的同源性为95.2%~99.9%,与高致病性PRRSV变异株代表毒株JXA1的同源性为97.2%~99.3%。2个类NADC30分离株之间的同源性为99.9%,与NADC30 PRRSV代表毒株NADC30的同源性为95.4%。主要易变基因分析结果显示,非结构蛋白Nsp2和结构蛋白GP5仍在不断变异中。54个PRRSV变异毒株中有48个PRRSV变异株在非结构蛋白Nsp2发生30aa的不连续缺失,此外有6个高致病性PRRSV变异株在Nsp2区域还发生了其他缺失(其中1株多缺失12个核苷酸,1株多缺失19个核苷酸,2株多缺失29个核苷酸,1株多缺失48个核苷酸,1株多缺失120个核苷酸)。2个类NADC30 PRRSV非结构蛋白Nsp2存在131个核苷酸的不连续缺失。大部分分离株在重要结构蛋白GP5发生aa突变,尤其是糖基化位点的位置和数量发生了不同程度的变化。