呼吸道病毒单克隆抗体快速检测的应用

对310例成人和114例小儿呼吸道感染患者的鼻咽分泌物,应用系列单克隆抗体联接碱性磷酸酶抗碱性磷酸醇桥联技术(APAAP),检测呼吸道病毒抗原和血清病毒抗体的结果表明,成人呼吸道感染患者中33.2％属病毒感染;小儿肺炎和支气管炎患者54.3％是由病毒引起的。本法对临床病毒感染的诊治具有重要意义。

应用呼吸道病毒单克隆抗体快速诊断流感病毒性肺炎

我院于1994年11月～1995年1月应用呼吸道病毒单克隆抗体,对92例支气管肺炎患儿流感病毒抗原进行检测,其结果如下。1 资料与方法1.1 鼻咽部脱落细胞的采取用无菌导尿管抽取鼻咽部分泌物于2毫升PBS液中,经离心、洗涤、再离心后,取沉淀细胞涂片,每张玻片涂二点,每个园点直径4～6mm,用风扇吹干,丙酮固定,-30℃保存备用。

呼吸道病毒单克隆抗体快速检测645例临床分析

为满足临床快速检测呼吸道病毒的需要。应用系列单克隆抗体ＡＰＡＡＰ桥联技术，对６４５例患者进行了流感病毒Ａ（ＦｌｕＡ）、流感病毒Ｂ（ＦｌｕＢ）、副流感病毒２（ＰＩＶ２）、副流感病毒１．３（ＰＩＶ１．３）、腺病毒（ＡｄＶ３．７）以及呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）的检测；其中１０９例同时取鼻部和咽部分泌物作配对检测，５６例确定为ＡｄＶ、ＲＳＶ阳性者，取血清标本用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）作特异性试验。结果，呼吸道感染组４４６例中检出２０８例（４６．６％），非感染性疾病组１９９例中检出２８例（１４．１％）；呼吸道感染组中儿童组检出率（５２．８％）高于成人组（４２．６％），二者感染的病毒种类也不相同；咽部分泌物的检出率（８１．７％）明显高于鼻部分泌物的检出率（３２．１％）。ＡｄＶ、ＲＳＶ抗原及抗体检测的符合率达９２．３％以上，分析表明，单克隆抗体快速检测有较高的特异性，且简便、快捷，能满足临床需要。

半固体培养法制备非洲猪瘟病毒pA104R蛋白的单克隆抗体

为了快速、高效制备非洲猪瘟病毒(ASFV)单克隆抗体,本研究通过大肠杆菌系统表达并纯化了ASFV重组蛋白pA104R。以ASFV重组蛋白pA104R为抗原,分别比较了CpG ODN联合氢氧化铝佐剂和常规弗氏佐剂两种免疫策略,并重点比较半固体培养法和常规有限稀释法来制备ASFV pA104R单克隆抗体的效率。结果显示,本研究获得了相对分子质量为3.5×104的ASFV重组可溶性蛋白pA104R,通过其与CpG ODN联合氢氧化铝佐剂免疫小鼠,在第21 d即可达到融合要求,本试验方法(重组蛋白pA104R与CpG ODN联合氢氧化铝佐剂免疫)较重组蛋白pA104R与常规弗氏佐剂免疫节省14 d时间。通过半固体培养法筛选单克隆的试验周期比有限稀释法缩短28 d,并减少了亚克隆的工作量。半固体培养法获得5株阳性杂交瘤细胞,挑选效价较高的3株(9A4、9H6、11F5)进行鉴定,重链均为IgG,轻链均为KAPPA。纯化后的3株单克隆抗体针对pA104蛋白和全病毒蛋白质的效价分别达1∶160000~1∶320000和1∶200~1∶400。本研究优选了CpG ODN联合氢氧化铝佐剂结合半固体培养法筛选pA104R的单克隆抗体,为单克隆抗体制备提供了快速高效的新策略。

猪细小病毒4型单克隆抗体制备及抗原表位鉴定

为了制备猪细小病毒(PPV)4型Cap蛋白单克隆抗体(mAb)并鉴定其抗原表位,试验采用原核表达的Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将其脾细胞与SP2/0细胞进行融合,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、血凝抑制(HI)和免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选阳性克隆,最终获得2E7、4D6和5C9这3株特异性杂交瘤细胞株;然后用mAb对Cap蛋白多肽进行ELISA检测,鉴定分析其抗原表位。结果显示:4D6和5C9 mAb识别表位为线性表位,分别为387RRQDN^(391)和578QRKE^(581),而2E7 mAb识别的表位为构象表位;通过对Cap蛋白3D结构定位分析,387RRQDN^(391)和578QRKE^(581)抗原表位位于蛋白表面,且在PPV4亚型中高度保守,而与猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)和猪博卡病毒(PBoV)基因序列同源性低。本研究为PPV4诊断试剂的开发和新型疫苗的研制提供了参考。

抗H7N9流感病毒的单克隆抗体与胃组织的交叉反应研究

目的筛选鉴定与胃组织交叉反应的抗H7N9流感病毒的单克隆抗体,初步探讨流感病毒感染会引发肠道相关疾病的可能致病机制。方法利用H7N9流感病毒制备了大量的单克隆抗体,对制备的单克隆抗体运用ELISA方法进行亚型和效价测定,免疫组化对制备的单克隆抗体与组织的反应性进行筛选,巢式PCR分子生物学技术克隆单克隆抗体轻重链可变区序列。结果制备的单克隆抗体H7N9-71和H7N9-78均能与H7N9抗原特异性结合,抗体效价达1∶10~5,免疫组化结果表明H7N9-71、H7N9-78与人的胃组织能发生特异性反应,进一步的研究发现这两株单抗与小鼠胃组织能特异性结合。轻重链可变区序列结果证实二者为两株不同的单抗。结论H7N9流感病毒可能与胃组织之间存在异嗜性抗原,提示流感病毒感染可能与胃肠道疾病的发生存在某些关联。

抗鸡传染性贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及其应用研究

为制备针对鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)的单克隆抗体,以CIAV的VP2原核表达蛋白作为抗原免疫小鼠,经杂交瘤技术获得3株能稳定分泌抗VP2蛋白特异性抗体的细胞株,进一步经IFA筛选出特异性和灵敏度俱佳的杂交瘤细胞Mab-VP2-4株,制备的小鼠腹水效价达到1∶2000。结果显示,制备的抗VP2蛋白单克隆抗体可与多株CIAV感染的MDCC-MSB1细胞发生特异性反应,而对EDSV、ALV、ILTV、ARV以及空白MDCC-MSB1细胞、CEF细胞等均无交叉反应,特异性良好,且应用于IFA方法时对CIAV感染的最低检出限为5 TCID 50。以该单克隆抗体对市场上10种不同来源的禽活疫苗进行病毒分离结合单克隆抗体IFA检测,同时与《中国兽药典》规定的鸡检查法进行对比检测,结果一致,均未检出CIAV污染。本研究制备了针对CIAV VP2蛋白的特异性单克隆抗体,为该病特异性诊断方法的建立奠定了基础。

老年上呼吸道感染患者常见呼吸道病毒免疫球蛋白M抗体检测结果分析

目的分析老年上呼吸道感染患者常见呼吸道病毒免疫球蛋白(Ig)M抗体的检测结果,为临床治疗提供参考。方法选取2023年1月至12月邳州市中医院收诊的1261例老年上呼吸道感染患者为研究对象。检测患者常见呼吸道病毒IgM抗体滴度,结合患者性别、年龄及季节信息比较常见呼吸道病毒IgM抗体阳性结果。结果1261例患者中,IgM检测阳性的患者共311例,其中20例患者为合并感染,总阳性率为24.66%。呼吸道病原体IgM检测结果显示,A型流感病毒检出率为13.16%,B型流感病毒检出率为4.36%,其中A、B型流感检测阳性率均高于其他呼吸道病毒(P<0.05)。657例男性患者样本中,呼吸道病毒IgM阳性177例(26.94%);604例女性患者样本中,呼吸道病毒IgM阳性134例(22.19%)。不同性别患者呼吸道病毒IgM抗体阳性检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。492例60~<70岁年龄段患者中,呼吸道病毒IgM阳性106例(21.54%);416例70~<80岁年龄段患者中,呼吸道病毒IgM阳性101例(24.28%);353例≥80岁年龄段患者中,呼吸道病毒IgM阳性104例(29.46%)。≥70岁年龄段患者阳性检出率高于60~<70岁年龄段(P<0.05)。≥80岁年龄段患者A型流感病毒IgM阳性率显著高于60~<80岁年龄段。530例春夏季患者中,呼吸道病毒IgM阳性132例(24.91%);731例秋冬季患者中,呼吸道病毒IgM阳性179例(24.49%)。不同季节患者呼吸道病毒IgM抗体阳性检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。秋冬季节A型流感IgM阳性率显著高于春夏季节(P<0.05)。结论老年上呼吸道感染症状患者常见呼吸道病毒IgM抗体的阳性检测结果受患者年龄、季节因素的影响,老年人群需警惕秋冬季节A型流感病毒的感染,减少患病风险,保障身体的健康。

2.1亚型猪瘟病毒流行株E2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为获得仅与我国基因2.1亚型猪瘟病毒(CSFV)流行株反应的单克隆抗体(MAb),并揭示疫苗株与流行株E2蛋白抗原氨基酸的差异,本研究利用基因2.1亚型重组质粒p FastBac1-JL23 E2通过杆状病毒表达重组E2蛋白(rE2),并采用Ni柱纯化后经SDS-PAGE检测r E2的表达及纯化效果;采用western blot鉴定r E2的反应原性。SDS-PAGE及western blot结果表明经杆状病毒表达了基因2.1亚型CSFV E2蛋白,且其纯化效果和反应原性均较好。采用杂交瘤技术制备2.1基因亚型CSFV E2蛋白的单克隆抗体(MAb),采用亲和层析法纯化该MAb,采用BCA法测定其浓度及亚类。将79株1.1、2.1、2.2和2.3基因亚型的CSFV及1.1基因亚型的HCLV株和SM株感染PK-15细胞,72 h后采用IFA检测MAb与不同基因型CSFV的反应性;采用western blot鉴定MAb与10个基因亚型共18种CSFV代表株E2蛋白的反应性。采用IFA鉴定MAb与不同基因型CSFV的中和活性。结果显示,经IFA筛选后共获得16株分泌E2蛋白MAb的杂交瘤细胞株。其中仅一株MAb TCH061与所有2.1基因亚型(2.1a、2.1b、2.1c、2.1g、2.1h、2.1i、2.1j、2.1k、2.1l、2.1m、2.1n)CSFV感染的细胞反应后出现绿色荧光,与基因1.1亚型HCLV疫苗株和SM株以及其他基因型CSFV感染的细胞反应后均无绿色荧光;western blot结果显示,该MAb能够识别2.1基因亚型CSFV E2蛋白(2.1a、2.1b、2.1c、2.1g、2.1h、2.1i、2.1j),在90 ku处出现特异性条带,而与其他基因型CSFV E2蛋白均不反应。表明TCH061为2.1基因亚型CSFV E2蛋白特异性的MAb。MAb的纯化结果显示,在50 ku和25 ku处有明显条带,其浓度为1.70μg/μL且该MAb TCH061重链为Ig G2a,轻链为κ链。中和活性结果显示,TCH061对JL^(23)株(2.1b)、GDLF1株(2.1c)有一定的中和活性,但不能中和C株。分别以GD53株E^(24)个不同区域的截短蛋白为抗原通过western blot初步确定MAb识别抗原表位的区域。利用CLC Sequence Viewer比对与MAb反应的CSFV E2蛋白氨基酸序列的差异,通过SWISS-MODEL预测MAb抗原表位的关键氨基酸位点。利用杆状病毒表达CSFV JL^(23)株各位点突变后的E2蛋白,采用western blot鉴定各突变的E2蛋白与MAb TCH061的反应性。Western blot结果显示,TCH061的抗原表位位于E2蛋白的aa1~aa90,且其识别CSFV E2蛋白P^(20)不识别L^(20)的CSFV。通过SWISS-MODEL预测E2蛋白氨基酸序列的I18、G^(19)、P^(20)、L^(21)、G^(22)、A^(23)和E^(24)在空间上比较接近;MAb TCH061与JL^(23)株I18M突变的E2蛋白反应,与G^(19)K、P^(20)L和L^(21)P突变的E2蛋白均不反应,与G^(22)K突变的E2蛋白反应性较弱,与HCLV E2蛋白不反应,但与HCLV L^(20)P突变的E2蛋白反应。证实TCH061的抗原表位为^(19)GPLG^(22),经Py MOL结构模拟确定其为空间构象表位;且除了aa^(20),其他位点在各基因型CSFV中均非常保守,表明P^(20)是2.1基因亚型CSFV流行株E2蛋白抗原表位的关键氨基酸。综上所述,本研究首次获得一株区别于CSFV疫苗株和2.1基因亚型CSFV流行株的MAb TCH061,揭示了疫苗株与流行株E2蛋白氨基酸位点的差异,为研发猪瘟疫苗和CSFV流行株感染的血清学鉴别检测方法的建立提供了重要的MAb资源。

猪圆环病毒3型Cap蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA检测方法的建立

旨在建立检测猪圆环病毒3型(PCV3)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的PCV3Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得了一株分泌阻断效果良好抗体的杂交瘤细胞株2E6。以重组Cap蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的2E6单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化后建立了一种检测PCV3抗体的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测50份临床阴性血清,计算阻断率(PI)的临界值,以此来确定该方法的判定标准:当PI≤28.30%时,判定结果为阴性;当PI≥35.05%时,判定结果为阳性;当28.30%<PI<35.05%时,判定为可疑,重复一次试验后如果结果仍为可疑,则判定为阳性。特异性试验表明该方法与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及猪瘟病毒(CSFV)的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验表明其检测效价可达到1:128;重复性试验表明批内与批间的变异系数均小于10%;符合性检验表明该方法与PCV检测金标准免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)比对的Kappa值达0.9,具有高度的一致性。综上所述,本研究建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性与较高的符合率,可用于后期进行PCV3抗体的检测,为PCV3的流行病学调查与临床诊断提供技术支持。

抗传染性法氏囊病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infectious bursal bursal virus,IBDV)引起的一种高度传染性疾病,以雏鸡法氏囊萎缩、腿肌出血等为特征性病变,给世界家禽产业造成重大经济损失。目前,由新型变异株引起的IBD在我国呈现流行趋势。为建立基于IBDV VP2蛋白的免疫学诊断技术,本研究以新型变异毒株IBDV-LY21/2为模板,扩增其VP2基因,随后构建重组原核表达质粒pCold-Ⅰ-IBDV-VP2并转化BL21(DE3)大肠杆菌进行诱导表达,通过考马斯亮蓝染色和Western blot检测重组蛋白His-VP2的表达情况,并对其进行纯化和浓度测定。将His-VP2免疫BALB/c小鼠后,采用iELISA检测血清抗体效价,最后制备单克隆抗体并对其鉴定。结果显示,获得的重组蛋白His-VP2分子量约为50 kDa,浓度为8 mg/mL;通过两次亚克隆获得3株杂交瘤细胞株1G10F12、3E3E9、4D12G12,且重链均为IgG1型,轻链均为κ型;其中1G10F12、3E3E9可与重组蛋白Myc-VP2产生Western blot和IFA反应,而4D12G12只能与其产生IFA反应。本研究为IBD诊断方法的建立奠定了基础,同时为深入研究VP2蛋白的功能提供生物学工具。

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

【目的】获得可溶性非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)p54蛋白和抗p54蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibodies, mAb),并分析其识别的线性抗原表位,为p54蛋白结构和功能的研究及血清学诊断试剂的研发奠定基础。【方法】构建了重组原核表达质粒pET-21a-E183L,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,表达并利用Ni2+柱和分子筛纯化得到p54重组蛋白。以该蛋白为抗原免疫5周龄SPF级BALB/c小鼠,每两周免疫一次,共免疫3次,首免时将p54蛋白与弗氏完全佐剂混匀乳化(150μg/只),二免、三免使用弗氏不完全佐剂。三免7 d后对小鼠进行尾部采血,使用ELISA方法测定小鼠血清抗体效价,选取效价高的小鼠进行加强免疫。3 d后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合,利用重组p54蛋白作为包被抗原,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆纯化,直至筛出能够稳定分泌抗体的mAb细胞株,并制备腹水。以pCAGGS-Flag-E183L质粒转染的HEK293T细胞和ASFV Pig/HLJ/18株感染的猪肺泡巨噬细胞(PAMs)为抗原,以筛选得到的mAb为一抗,进行Western blot鉴定和间接免疫荧光试验(IFA)。使用单抗亚类鉴定试剂盒检测该mAb重链和轻链类型。随后,将p54蛋白逐步截短并与GST标签融合表达后进行Western blot检测,鉴定该mAb识别的抗原表位。【结果】将构建的原核表达质粒pET-21a-E183L(54-183aa)转化至BL21(DE3)感受态细胞中,使用IPTG进行诱导后,p54重组蛋白大部分以可溶的形式在上清中表达,分子量约为17 kDa。以纯化得到p54重组蛋白免疫小鼠,三免后7 d的血清效价为1:409 600,可进行细胞融合,经四次筛选和亚克隆后,获得能够稳定分泌p54蛋白mAb的细胞株,命名为5B11,成功制备腹水并纯化。Western blot和IFA试验结果显示,制备的mAb能够特异性识别HEK293T细胞中表达及ASFV感染PAMs中的p54蛋白。mAb亚类鉴定结果显示重链类型为IgG1型,轻链类型为κ链。该mAb识别的抗原表位序列为^(80)VTPQPGTSKPA^(90)。【结论】利用原核表达体系可溶性表达了ASFV p54蛋白的第54-183位氨基酸,并以纯化的蛋白为抗原制备了抗p54蛋白的mAb,并对其识别的抗原表位进行鉴定,丰富了p54蛋白的抗原表位信息,为ASFV血清学检测提供了基本材料。

大口黑鲈虹彩病毒主衣壳蛋白单克隆抗体制备与抗原表位鉴定

以大口黑鲈虹彩病毒(Largemouth bass iridovirus,LMBV)主衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)为检测靶蛋白,利用原核表达系统表达MCP重组蛋白并免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP/20)融合,经亚克隆筛选、小鼠腹腔接种、收集腹水等过程获得单克隆抗体;利用免疫印迹技术对所制备的单克隆抗体免疫识别的特异性以及其识别的抗原表位进行研究分析,为研制适于养殖现场快速检测LMBV的胶体金检测试纸条奠定基础。结果表明,获得了1株单克隆抗体2C9-6。特异性分析结果显示,单克隆抗体2C9-6可以特异性识别真核表达的LMBV-MCP和LMBV病毒颗粒。抗原表位分析结果表明,单克隆抗体2C9-6识别LMBV-MCP的抗原表位位于LMBV-MCP蛋白N端第1—20位氨基酸。

基因Ⅳ型禽呼肠孤病毒σC蛋白单克隆抗体的制备及功能鉴定

为制备基因Ⅳ型(GCⅣ)禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)σC蛋白单克隆抗体,构建了重组原核表达质粒pCold-I-ARV-GCⅣ-σC,将重组质粒导入感受态细胞BL21(DE3)中进行蛋白诱导表达;随后将纯化后的σC蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术制备杂交瘤细胞,利用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选获得阳性杂交瘤细胞;以间接免疫荧光(IFA)和蛋白免疫印迹(Western blot)试验鉴定杂交瘤细胞后,将杂交瘤细胞株通过腹腔注射小鼠制备单克隆抗体腹水,以ELISA测定腹水效价。结果显示:成功筛选出一株分泌ARV GCⅣσC蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株(1H4);制备的单克隆抗体能与ARV GCⅣσC蛋白发生反应,同时与感染不同基因型ARV的鸡肝癌细胞(LMH)均有良好的反应性;该单克隆抗体识别重链为IgG1,其腹水ELISA效价为1:256000。结果表明,成功制备ARV GCⅣσC蛋白单克隆抗体,其效价高,反应性良好,为进一步研究σC蛋白功能、ARV致病机理以及建立临床诊断方法奠定了基础。

伪狂犬病病毒VP22蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

为制备伪狂犬病病毒(PRV)VP22蛋白单克隆抗体,将目的基因克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建pET-28a-VP22原核表达质粒,并利用大肠杆菌表达系统,获得重组VP22蛋白。将纯化后的蛋白免疫6~8周龄BALB/c雌鼠,通过杂交瘤细胞融合技术及间接ELISA方法筛选,经3次亚克隆后获得4株PRV VP22蛋白的单克隆抗体1D6、1D9、1B12和2C10。间接ELISA检测4株杂交瘤细胞传至15代均能稳定分泌抗体,且细胞上清液抗体效价均为1∶6400。经亚型鉴定,4株单克隆抗体的重链均是IgG1亚类,轻链皆属于κ型。Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)结果表明,制备的单克隆抗体均可与PRV发生特异性反应,并鉴定出2个抗原表位;Western blot和共聚焦试验结果表明,VP22蛋白是病毒早期蛋白,且早期存在于细胞质,晚期移位至细胞核并在核中积累。本研究制备的单克隆抗体将为后续探索PRV VP22蛋白的功能提供材料支撑。

猪德尔塔冠状病毒N蛋白单克隆抗体2D7的制备与生物学特性鉴定

为获得猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白的特异性单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并鉴定其生物学特性,本研究利用RT-PCR方法扩增PDCoV-N基因,构建表达质粒,转化BL21感受态细胞获得重组大肠杆菌,诱导表达后获得PDCoV-N重组蛋白,将其进行纯化后再免疫小鼠,制备针对PDCoV-N蛋白的mAb,并进行了抗体的效价测定、免疫荧光(IFA)、Western blot、亚类的鉴定、mAb特异性的鉴定。结果,成功构建pColdⅡ-PDCoV-N重组原核表达质粒,SDS-PAGE显示重组N蛋白成功表达,分子质量约为38 kDa;经小鼠免疫、细胞融合、亚克隆筛选获得1株分泌PDCoV-N蛋白抗体的阳性杂交瘤细胞株;制备的腹水经间接ELISA方法测定抗体的效价为2.048×10^(6)。IFA、Western blot试验表明该mAb可以与PDCoV-N蛋白及全病毒特异性结合,亚类鉴定其亚型为IgG1,轻链为κ链。该mAb只与PDCoV反应,而与其他猪肠道病毒无交叉反应,表明本研究制备的mAb具有良好的特异性。本研究成功制备了PDCoV-N蛋白的mAb,为进一步研究PDCoV的生物学特性和诊断试剂的开发提供技术支持。

非洲猪瘟病毒D1133 L蛋白单克隆抗体抑制其复制

旨在探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)D1133L单克隆抗体对病毒复制的调控效应。在制备了ASFV D1133L单克隆抗体的基础上,将ASFV和不同浓度的单克隆抗体同时接种于PAMs,通过红细胞吸附试验(HAD 50)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白质印迹(Western blot)和荧光观察分析D1133L单克隆抗体对病毒复制的影响。结果显示:不同浓度的单克隆抗体在不同的感染时间对ASFV的病毒效价(P<0.01),蛋白表达水平,基因转录水平(P<0.01),ASFV-GFP绿色荧光蛋白的表达水平(P<0.05)均有显著抑制,且这种抑制作用具有剂量依赖性。综上所述,D1133L单克隆抗体可显著抑制ASFV的复制,试验结果在ASFV药物靶点的选择上具有一定的参考意义。

鸡减蛋综合征病毒中和性单克隆抗体的制备、鉴定及在双抗体夹心ELISA中的应用

为了制备针对鸡减蛋综合征病毒(EDSV)的中和性单克隆抗体,首先纯化得到重组EDSV纤维蛋白,经血凝试验(HA)鉴定纤维蛋白的血凝活性,HA效价为1∶2~7。之后将纤维蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,免疫4次后,小鼠血清的间接酶联免疫吸附试验(iELISA)效价最高达到1∶409 600,间接免疫荧光试验(IFA)效价最高达到1∶12 800。取效价最高免疫小鼠脾细胞进行细胞融合制备杂交瘤细胞,结合iELISA和IFA检测,经过多轮亚克隆,最终成功获得了2株稳定分泌中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株9G12和10E11。iELISA结果显示,单克隆抗体9G12和10E11的腹水效价分别为1∶128 000和1∶1 020 000;IFA效价分别为1∶2 000和1∶8 000。Western blot检测结果显示,单克隆抗体9G12和10E11均不能识别变性的EDSV纤维蛋白,表明二者识别纤维蛋白的构象型表位。病毒中和试验结果表明,单克隆抗体9G12和10E11均具有中和活性,中和效价分别为1∶2~7和1∶2~4。亚型鉴定表明,这2种单克隆抗体的轻链均为Kappa型,重链均为IgG1亚型。将基于单克隆抗体9G12和10E11建立的双抗体夹心ELISA方法应用于临床检测EDSV抗原,与荧光定量PCR检测结果的符合率为91.7%。综上,成功筛选出9G12和10E11杂交瘤细胞株,二者分泌抗EDSV特异性抗体,且这2种抗体具有中和EDSV感染活性,可应用于EDSV的临床检测。

血清1型马立克氏病病毒单克隆抗体的制备及其特异性鉴定

为制备血清1型马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)单克隆抗体,以超速离心浓缩的血清1型MDV CVI988/Rispens毒株免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术制备单克隆抗体。通过亚克隆、间接ELISA和间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)筛选,获得3株分泌特异性抗血清1型MDV单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为4D9、1C5和1F10,并对其进行特异性分析。间接ELISA结果显示,4D9、1C5和1F10制备的腹水ELISA效价分别达5.1×10^(4)、82×10^(5)、4.1×10^(5),可用于后续建立ELISA检测方法;IFA结果显示,4D9、1C5和1F10制备的腹水与不同血清1型MDV毒株具有良好的反应性,效价可分别达1∶12800、1∶25600和1∶12800,与血清3型MDV毒株和其他常见禽源病毒均没有交叉反应,特异性良好;亚型检测结果显示,4D9抗体为IgG2a/κ型,1C5抗体为IgG2b/κ型、1F10抗体为IgG1/κ型;应用1C5建立的IFA方法能检出至少5PFU CVI988/Rispens毒株感染,适用于血清1型MDV的检测。综上,制备的单克隆抗体可用于血清1型MDV的检测,为MDV致病机制研究及诊断试剂研发提供基础。

小反刍兽疫病毒非结构蛋白C单克隆抗体的制备与鉴定

为制备小反刍兽疫病毒(PPRV)非结构蛋白C单克隆抗体,根据PPRV C基因编码多肽链氨基酸序列抗原性分析,设计合成一条含20个氨基酸的抗原肽(CRSGKPRGETPGPLLPEIMQ)和一条含21个氨基酸的筛选抗原多肽(PLRAGERGLAPQAVQHRTLIK),将它们分别与钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)和生物素羧基蛋白(biotin carboxyl carrier protein, Biotin)交联,制备获得免疫原和筛选抗原。用免疫原肌肉注射5只8~12周龄、体重约20 g的无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级BALB/c雌性小鼠,第1次免疫后分别间隔7 d进行第2次免疫和第3次免疫,三免后21 d进行冲击免疫,冲击免疫后第3天采集血液分离血清,采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)测得1只免疫小鼠血清抗体效价为1∶312 500,2只为1∶62 500。取3只小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0经聚乙二醇(PEG)融合制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA筛选出26株阳性淋巴杂交瘤细胞,进一步经克隆化培养筛选出46株单克隆细胞株。通过Western blot(WB)筛选获得2株能稳定分泌特异性抗PPRV C蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,WB、间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay, IFA)鉴定显示,制备的单克隆抗体具有较好的灵敏性和病毒反应性。研究结果为进一步阐明C蛋白在PPRV生命周期中的作用奠定了基础,也为小反刍兽疫(PPR)诊断提供了有效的诊断试剂。