一株基因Ⅲ型禽呼肠孤病毒变异株的分离及其灭活疫苗免疫原性初步评价

为了解禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)变异株在我国的流行情况及其生物学特性和致病特点,试验采集黑龙江省某企业送检的病鸡关节组织进行病毒分离,通过RT-PCR、序列分析及常见禽类外源病毒检测鉴定,进一步通过对体外复制能力、致病性、血清交叉中和能力及灭活疫苗免疫抗体水平检测,分析其致病性、抗原性和免疫原性。结果显示:成功从病鸡关节组织中分离到1株ARV,命名为ARV-HLJ21-1690401,该分离株位于基因Ⅲ型分支,与基因Ⅲ型参考株ISR5233和42563-4-2005遗传距离较近,氨基酸序列相似性为83.4%和81.7%,而与其他基因型分离株遗传距离较远;该分离株在LMH细胞上增殖良好,对鸡胚和SPF鸡均具有明显的致病性,可引起接种鸡胚90%死亡,接种6周龄SPF鸡可引起100%发病;该分离株具有良好的免疫原性,其制备的灭活疫苗免疫SPF鸡可诱导产生较好的抗体水平。综上所述,研究成功分离到一株具有致病性和良好免疫原性的基因Ⅲ型ARV变异株,为了解我国ARV变异株的流行及遗传进化特征提供了重要理论依据。

呼肠孤病毒Ⅲ型(Reo3)RT-PCR检测方法的建立

目的建立呼肠孤病毒Ⅲ型(Reo3)RT-PCR检测方法,应用于实验动物及人用动物源性材料及生物制品外源Reo3的检测。方法根据已发表的呼肠孤病毒Ⅲ型(Reo3)M1基因序列,设计合成引物。提取Reo3细胞毒RNA,以其为模板,进行PCR扩增。优化反应条件,进行特异性、敏感性、重复性试验。结果建立的Reo3RT-PCR检测方法特异、敏感、稳定。以Reo3 RNA逆转录产物为模板,所能检测RNA最小模板浓度为0.42pg/μL,可检测病毒最小滴度为10-9/mL。结论建立的呼肠孤病毒Ⅲ型(Reo3)RT-PCR检测方法可用于实验动物及人用动物源性材料及生物制品外源Reo3的检测。

草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP38的表达分析及多克隆抗体制备

为进一步开展草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP38的生物学功能研究准备实验材料,同时探讨并构建一种草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒的免疫学检测方法。实验构建了VP38的原核表达质粒pET28a-VP38,转化至BL21感受态细胞后利用IPTG(Isopropyl β-D-Thiogalactoside)诱导表达,8 mol/L尿素溶解重组蛋白后免疫小鼠,制备鼠抗VP38多克隆抗体;利用制备的抗体探究Grass carp reovirus 104(GCRV-104)感染后VP38在翻译水平的表达动力学;利用Western blot、间接免疫荧光分析(IFA)对抗体进行评估;构建VP38的真核表达载体pEGFP-N1-VP38,转染至草鱼性腺(Grass carp ovary,GCO)细胞内进行亚细胞定位分析。结果显示:重组VP38蛋白在原核表达系统中以包涵体形式存在;制备的鼠抗VP38多克隆抗体既能够识别重组VP38蛋白,也能够识别GCO细胞感染GCRV-104后表达的VP38蛋白;GCRV-104感染后72h VP38主要分布在细胞质中,与亚细胞定位结果一致;VP38在感染的前期微量表达,感染中后期大量表达。本研究制备的鼠抗VP38多克隆抗体具有较高的效价和较好的特异性,为构建草鱼Ⅲ型呼肠孤病毒的免疫学检测方法提供了较好的技术路线。

利用噬菌体展示技术筛选草鱼呼肠孤病毒VP39蛋白相互作用多肽

VP39是草鱼呼肠孤Ⅲ型病毒(GCRV GenotypeⅢ,GCRV-Ⅲ)S9基因编码的蛋白,为研究VP39蛋白在GCRV-Ⅲ感染草鱼细胞过程中行使的生物学功能,将克隆VP39基因序列并构建原核表达载体pET32a-VP39,通过原核表达得到VP39-HIS融合蛋白;利用VP39蛋白溶液免疫小鼠,制备鼠抗VP39多克隆抗体,通过Western Blot对抗体进行评估;利用制备的多克隆抗体探究GCRV-Ⅲ感染细胞过程中VP39蛋白表达动力学;利用噬菌体展示技术筛选与VP39蛋白特异性结合的多肽序列并进行分析。SDS-PAGE电泳结果显示,VP39-HIS融合蛋白可良好溶于PBS中,蛋白大小约为39 kD;Western Blot检测表明实验所制备的VP39多克隆抗体在1﹕10000稀释比例下,既能识别原核表达的VP39-HIS融合蛋白,也能识别GCRV-Ⅲ感染CIK细胞后表达的VP39蛋白,具有良好的效价与特异性;在病毒侵染过程中,VP39前期表达量较少,在中后期大量表达;噬菌体展示技术筛选出两条多肽与VP39蛋白有高度亲和性,经过在NCBI上比对后发现草鱼基因组中有7个基因与筛出的多肽具有同源性,表明其可能与VP39存在相互作用。研究制备了鼠抗VP39多克隆抗体,为GCRV-Ⅲ的免疫学检测方法提供了新的路径;结合多肽的筛选也为VP39在GCRV-Ⅲ侵染过程中参与的生物学功能研究奠定了基础。

实验小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型抗体的实验室检测能力验证结果评价

目的通过实验小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型抗体检测能力验证计划,了解实验动物检测机构检验能力,提高实验动物质量检测水平。方法按照CNAS批准的能力验证方案,血清经过标定后,经过稳定性和均匀性检验合格,作为能力验证样品。采用随机编号,发样给参加单位,并附作业指导书。在规定时限提交检验报告和原始记录复印件,其结果与样品预检结果一致的判为满意结果,不一致或未能提交结果的判为不满意结果。结果共有17个省市的27个实验动物检测机构报名参加本次能力验证项目。27个检测机构均提交了满意结果,占总参加机构的100%。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法的有26个检测机构,采用免疫荧光实验(IFA)方法的有1个检测机构。结论实验动物质量检测机构实验小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型抗体检测能力较高,实施能力验证计划能够反映实验室的检测水平。

ICR小鼠感染呼肠孤病毒Ⅲ型的实验研究

目的利用呼肠孤病毒Ⅲ型(Reo-3)感染ICR小鼠,分析小鼠的临床体征、靶器官病毒载量及血清抗体水平的动态变化。方法通过动物体内适应试验增强病毒毒力,利用尾静脉注射与腹腔注射途径建立系统性感染ICR小鼠模型,观察动物临床体征,于感染0d、4 d、7 d、18 d、25 d、35 d、72 d、129 d分别采集小鼠(2~3只小鼠)血液并剖检。47 d、81 d、103 d随机对3只小鼠进行血液采集跟踪。采用实时qPCR方法检测靶器官病毒核酸量,ELISA方法检测血清抗体水平。结果病毒经过4次小鼠体内适应其毒力明显增强。小鼠攻毒后6 d、7 d、9 d、10 d、11d、16d出现死亡,实时qPCR结果显示,肝脏病毒载量最高,其次是心、脾、肺。多数器官病毒载量峰值出现在6~11 d,129 d后,多数靶器官检测阴性。血清抗体最早在18 d达到阳性,25 d达到峰值,并维持高抗体水平至试验结束。结论小鼠体内适应方法可以明显增强Reo-3毒力,该病毒感染可引起小鼠多器官炎症反应,并导致小鼠死亡。本研究为该病毒模型建立及致病机理研究提供了参考数据。

呼肠孤病毒Ⅲ型免疫荧光检测方法的建立及初步应用

目的 建立呼肠孤病毒Ⅲ型(Reo3)免疫荧光(IFA)检测方法,应用于人用动物源性生物材料及生物制品外源Reo3的检测。方法滴定病毒TCID50,筛选Reo3敏感细胞,依据国标IFA法制备抗原片,方阵法滴定免疫荧光素最佳工作浓度。并进行特异性、敏感性和稳定性试验。结果选取BSC-1细胞作为Reo3敏感细胞,病毒感染力滴度(TCID50)为10-5.8/mL;免疫荧光素最佳工作浓度为1∶100;与小鼠鼠痘(Ect)病毒、小鼠肝炎(MHV)病毒均无交叉反应;稳定性和敏感性试验显示,不同时间IFA检测灵敏度均为1∶1280;可检测到的病毒滴度最低为10-4.1/mL。结论建立的IFA法敏感性、特异性强,稳定性好,可用于人用动物源性生物材料及生物制品Reo3的检测。

犬呼肠孤病毒3型(AMMS株)的分离与鉴定

从 １ 只临床表现呼吸道症状的濒死病犬肺脏分离到 １ 株病毒，经理化特性、血凝性、核酸型、血凝抑制试验和电镜观察，鉴定为犬呼肠孤病毒 ３ 型。这是国内首次分离到此病毒。

呼肠孤病毒3型S1基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

采用RT-PCR方法从呼肠孤病毒3型(Reo-3)中扩增S1基因的主要抗原片段SR,并将其克隆到原核表达载体pQE-31中诱导表达,融合蛋白SR-δ1纯化后被用作包被抗原,建立了检测呼肠孤病毒3型抗体的间接ELISA。对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析的结果表明,表达蛋白SR-δ1的分子质量约为32ku,具有很好的抗原性。建立的ELISA与鼠痘病毒、仙台病毒、小鼠肝炎病毒、小鼠肺炎病毒均无交叉试验,具有良好的特异性、重复性和敏感性,与国家实验动物检测中心的ELISA检测试剂盒的符合率为98.7%,证实该方法可用于Reo-3抗体的检测。

呼肠孤病毒3型S1基因在Sf9昆虫细胞中的表达

利用杆状病毒表达系统对呼肠孤病毒3型S1在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究Reo-3σ1蛋白功能及建立呼肠孤病毒3型血清学诊断方法奠定基础。采用PCR方法扩增全长为1 416bp的Reo-3S1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFastBacHTA-S1再转化到DH10Bac感受态细胞中,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-S1,用脂质体介导法转染昆虫细胞获得重组病毒rBS。免疫荧光法(IFA)和western-blotting检测结果表明,S1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约为50 kD的重组蛋白,且具有免疫原性。这是国内首次通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达出了具有免疫原性的Reo-3σ1蛋白,为进一步研究单克隆抗体的制备和血清学抗体水平检测研究奠定了基础。

人脐带来源的间充质干细胞运载3型呼肠孤病毒在杀伤K562细胞过程中相关细胞因子表达分析

目的选择具有肿瘤归巢能力的人脐带来源的间充质干细胞(MSCs)作为细胞载体运载溶瘤病毒3型呼肠孤病毒(Reovirus3),并与慢性粒细胞白血病K562细胞共同培养,探讨细胞培养体系中相关细胞因子对MSCs运载Reovirus3杀伤K562细胞的影响,为利用细胞因子治疗或者辅助MSCs运载Reovirus3治疗慢性粒细胞白血病提供依据。方法通过体外试验从脐带中分离培养出MSCs,选用对数生长期的MSCs荷载Reovirus3,与对数生长期的K562细胞进行体外细胞培养,分为对照组:K562细胞;MSCs组:K562细胞+MSCs;Reovirus3组(阳性对照组):K562细胞+Reovirus3;实验组:K562细胞+Reovirus3+MSCs。细胞共培养24、48、72 h,收集各组细胞培养上清液,采用ELISA双抗体夹心法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、转化生长因子-β(TGF-β)、白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-5、IL-6和IL-17水平。结果培养24、48、72 h时MSCs组和实验组TGF-β、IL-6水平与对照组比较均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05),Reovirus3组比对照组TGF-β、IL-6水平虽有所升高,但差异均无统计学意义(P>0.05);培养48 h时MSCs组、Reovirus3组和实验组TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4水平虽然均高于对照组,但差异均无统计学意义(P>0.05),培养48 h时4组细胞培养上清液均未检测出IL-5和IL-17;培养24、72 h时4组细胞培养上清液均未检测出TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5及IL-17。结论MSCs运载Reovirus3在体外试验的细胞培养体系中可有效抑制K562细胞,除了溶瘤病毒Reovirus3的溶瘤作用外,可能还与培养体系中的细胞因子促进细胞凋亡从而抑制K562细胞的增殖有关。

鼠呼肠孤病毒3型荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据呼肠孤病毒3型(Reo3)M1基因序列保守区设计一对特异性引物,作者建立了一种快速、敏感、特异的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了评价试验。试验结果显示,标准品浓度在1.0×10^2~1.0×10^10copy/μL之间时,其浓度的对数值与荧光定量R T-PCR实验中的Ct值之间有良好的线性相关性(相关系数R^2=0.9990),且该标准品检出限为1.0×10^2个copy/μL。特异性方面,该方法除对Reo3有扩增反应外,对其它相关病毒均无扩增反应,引物具有良好的特异性。同时,该方法实验间的变异系数为0.54%~1.04%之间,均小于2%,表明该方法扩增稳定性高、重复性强。以上研究结果表明,此研究检测方法建立的Reo3荧光R T-PCR检测方法特异、敏感、稳定,可用于实验动物中Reo3的监测以及流行病学研究。