犬呼肠孤病毒3型(AMMS株)的分离与鉴定

从 １ 只临床表现呼吸道症状的濒死病犬肺脏分离到 １ 株病毒，经理化特性、血凝性、核酸型、血凝抑制试验和电镜观察，鉴定为犬呼肠孤病毒 ３ 型。这是国内首次分离到此病毒。

呼肠孤病毒3型S1基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

采用RT-PCR方法从呼肠孤病毒3型(Reo-3)中扩增S1基因的主要抗原片段SR,并将其克隆到原核表达载体pQE-31中诱导表达,融合蛋白SR-δ1纯化后被用作包被抗原,建立了检测呼肠孤病毒3型抗体的间接ELISA。对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析的结果表明,表达蛋白SR-δ1的分子质量约为32ku,具有很好的抗原性。建立的ELISA与鼠痘病毒、仙台病毒、小鼠肝炎病毒、小鼠肺炎病毒均无交叉试验,具有良好的特异性、重复性和敏感性,与国家实验动物检测中心的ELISA检测试剂盒的符合率为98.7%,证实该方法可用于Reo-3抗体的检测。

呼肠孤病毒3型S1基因在Sf9昆虫细胞中的表达

利用杆状病毒表达系统对呼肠孤病毒3型S1在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究Reo-3σ1蛋白功能及建立呼肠孤病毒3型血清学诊断方法奠定基础。采用PCR方法扩增全长为1 416bp的Reo-3S1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFastBacHTA-S1再转化到DH10Bac感受态细胞中,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-S1,用脂质体介导法转染昆虫细胞获得重组病毒rBS。免疫荧光法(IFA)和western-blotting检测结果表明,S1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约为50 kD的重组蛋白,且具有免疫原性。这是国内首次通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达出了具有免疫原性的Reo-3σ1蛋白,为进一步研究单克隆抗体的制备和血清学抗体水平检测研究奠定了基础。

人脐带来源的间充质干细胞运载3型呼肠孤病毒在杀伤K562细胞过程中相关细胞因子表达分析

目的选择具有肿瘤归巢能力的人脐带来源的间充质干细胞(MSCs)作为细胞载体运载溶瘤病毒3型呼肠孤病毒(Reovirus3),并与慢性粒细胞白血病K562细胞共同培养,探讨细胞培养体系中相关细胞因子对MSCs运载Reovirus3杀伤K562细胞的影响,为利用细胞因子治疗或者辅助MSCs运载Reovirus3治疗慢性粒细胞白血病提供依据。方法通过体外试验从脐带中分离培养出MSCs,选用对数生长期的MSCs荷载Reovirus3,与对数生长期的K562细胞进行体外细胞培养,分为对照组:K562细胞;MSCs组:K562细胞+MSCs;Reovirus3组(阳性对照组):K562细胞+Reovirus3;实验组:K562细胞+Reovirus3+MSCs。细胞共培养24、48、72 h,收集各组细胞培养上清液,采用ELISA双抗体夹心法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、转化生长因子-β(TGF-β)、白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-5、IL-6和IL-17水平。结果培养24、48、72 h时MSCs组和实验组TGF-β、IL-6水平与对照组比较均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05),Reovirus3组比对照组TGF-β、IL-6水平虽有所升高,但差异均无统计学意义(P>0.05);培养48 h时MSCs组、Reovirus3组和实验组TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4水平虽然均高于对照组,但差异均无统计学意义(P>0.05),培养48 h时4组细胞培养上清液均未检测出IL-5和IL-17;培养24、72 h时4组细胞培养上清液均未检测出TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5及IL-17。结论MSCs运载Reovirus3在体外试验的细胞培养体系中可有效抑制K562细胞,除了溶瘤病毒Reovirus3的溶瘤作用外,可能还与培养体系中的细胞因子促进细胞凋亡从而抑制K562细胞的增殖有关。

鼠呼肠孤病毒3型荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据呼肠孤病毒3型(Reo3)M1基因序列保守区设计一对特异性引物,作者建立了一种快速、敏感、特异的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了评价试验。试验结果显示,标准品浓度在1.0×10^2~1.0×10^10copy/μL之间时,其浓度的对数值与荧光定量R T-PCR实验中的Ct值之间有良好的线性相关性(相关系数R^2=0.9990),且该标准品检出限为1.0×10^2个copy/μL。特异性方面,该方法除对Reo3有扩增反应外,对其它相关病毒均无扩增反应,引物具有良好的特异性。同时,该方法实验间的变异系数为0.54%~1.04%之间,均小于2%,表明该方法扩增稳定性高、重复性强。以上研究结果表明,此研究检测方法建立的Reo3荧光R T-PCR检测方法特异、敏感、稳定,可用于实验动物中Reo3的监测以及流行病学研究。

从腹泻病犬分离出呼肠病毒3型

从用腹泻犬粪样接种的犬原代肾细胞培养中分离出的３株病毒，经理化特性鉴定为呼肠病毒，以呼肠病毒标准株进行血凝抑制和中和试验发现它们具有呼肠病毒３型的抗原特性，因此认为腹泻犬的分离呼肠病毒。

ICR小鼠感染呼肠孤病毒Ⅲ型的实验研究

目的利用呼肠孤病毒Ⅲ型(Reo-3)感染ICR小鼠,分析小鼠的临床体征、靶器官病毒载量及血清抗体水平的动态变化。方法通过动物体内适应试验增强病毒毒力,利用尾静脉注射与腹腔注射途径建立系统性感染ICR小鼠模型,观察动物临床体征,于感染0d、4 d、7 d、18 d、25 d、35 d、72 d、129 d分别采集小鼠(2~3只小鼠)血液并剖检。47 d、81 d、103 d随机对3只小鼠进行血液采集跟踪。采用实时qPCR方法检测靶器官病毒核酸量,ELISA方法检测血清抗体水平。结果病毒经过4次小鼠体内适应其毒力明显增强。小鼠攻毒后6 d、7 d、9 d、10 d、11d、16d出现死亡,实时qPCR结果显示,肝脏病毒载量最高,其次是心、脾、肺。多数器官病毒载量峰值出现在6~11 d,129 d后,多数靶器官检测阴性。血清抗体最早在18 d达到阳性,25 d达到峰值,并维持高抗体水平至试验结束。结论小鼠体内适应方法可以明显增强Reo-3毒力,该病毒感染可引起小鼠多器官炎症反应,并导致小鼠死亡。本研究为该病毒模型建立及致病机理研究提供了参考数据。

高滴度呼肠孤病毒3型的制备及滴度检测

目的 制备高滴度呼肠孤病毒3型（reovirus 3,Reo-3）病毒液,并检测Reo-3滴度.方法 以幼仓鼠肾细胞（BHK-21）为病毒培养基质和滴度测定细胞.将Reo-3按10^0至10^-5感染复数（MOI）接种BHK-21,再分别用细胞病变法和蚀斑形成法检测病毒,用Karber法计算病毒滴度.结果 BHK-21感染Reo-3后能产生明显病变.以10^-4 MOI的Reo-3接种后48 h,收获液中病毒滴度最高,细胞病变法检测为9.625 lgTCID50/ml,蚀斑形成法检测为8.671 lgPFU/ml.结论 制备了高滴度Reo-3,为开展该病毒去除灭活研究奠定了基础.

胆道闭锁病因学研究进展

胆道闭锁是一种常见的胆管闭塞性病变，病因不明。本文从免疫和／或炎症反应异常、病毒感染、胆道形成异常等几个方面综述其可能的原因，为进一步明确胆道闭锁的病因提供一定的帮助。