和血柔肝方通过PI3K/Akt/NF-κB信号通路调控自噬相关蛋白改善大鼠肝纤维化机制研究

目的:探讨和血柔肝方通过调控磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/核因子-κB(NF-κB)信号通路调控自噬相关蛋白改善大鼠肝纤维化的作用机制。方法:将40只SPF级SD雄性大鼠随机分为空白对照组、模型组、秋水仙碱组与和血柔肝方最佳剂量组,每组各10只。除空白对照组外,其余各组均以四氯化碳(CCl_(4))构建肝纤维化大鼠模型。造模8周后,空白对照组、模型组采用0.9%氯化钠溶液灌胃;秋水仙碱组采用秋水仙碱灌胃;和血柔肝方最佳剂量组以和血柔肝方灌胃。灌胃结束后,取各组大鼠血清及肝脏组织。生化检测各组大鼠血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平;HE及Masson染色评估大鼠肝纤维化情况。RT-qPCR法检测大鼠肝组织PI3K、Akt、NF-κB以及NF-κB下游自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)、Beclin-1的mRNA的表达水平;蛋白免疫印迹(Western blot)检测大鼠肝组织中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、NF-κB P65、p-NF-κB P65、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达水平。结果:与模型组比较,和血柔肝方最佳剂量组血清ALT、AST水平明显降低(P<0.05)。与模型组比较,和血柔肝方最佳剂量组大鼠肝脏病理受损可见明显缓解。与模型组比较,和血柔肝方最佳剂量组大鼠肝组织PI3K、Akt、NF-κB、LC3-Ⅱ、Beclin-1基因表达水平明显降低(P<0.05)。与模型组比较,和血柔肝方最佳剂量组的PI3K、Akt、p-Akt、NF-κB P65、p-NF-κB P65、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达Western blot结果均显著降低(P<0.05)。结论:和血柔肝方可通过抑制肝纤维化大鼠肝组织PI3K/Akt/NF-κB信号通路的表达以降低自噬相关蛋白活化,从而改善大鼠肝脏炎症,减缓肝脏病理损害,改善肝纤维化。

和血柔肝方对肝纤维化大鼠基质金属蛋白酶及其抑制物表达影响的实验研究

目的:观察和血柔肝方(HXRGF)对肝纤维化(LF)大鼠基质金属蛋白酶(MMPs)及其特异性抑制物(TIMPs)的影响,评估HXRGF对LF的疗效。方法:将80只SPF级雄性SD大鼠随机分为正常对照组(CL,n=10)和肝纤维化模型组(FL,n=70),在大鼠颈背部皮下以60%CCl 4溶液(CCl 4∶Olive oil=3∶2,3 ml/kg体重,每周2次)连续注射12周进行造模。造模成功后,原FL组大鼠被随机分为模型组、秋水仙碱组、HXRGF低剂量组、HXRGF中剂量组和HXRGF高剂量组,每组10只,分别给予相应的受试药液灌胃4周(1次/d)。比较各组大鼠的体质量、肝功能、病理Metavir评分和肝组织中MMP2、MMP13、TIMP1、TIMP2、TGFβ及Lect2的mRNA和蛋白表达量的差异。结果:①与对照组相比,模型组大鼠的肝脏形态、HE染色、免疫组化和羟脯氨酸测定结果提示肝纤维化模型复制成功,其体质量下降、肝功能恶化、病理Metavir评分升高,MMP2、MMP13、TIMP1、TIMP2、TGFβ和Lect2 mRNA水平和蛋白表达量升高(P<0.05)。②与模型组比较,HXRGF高剂量组大鼠ALT、AST水平降低(P<0.05);HXRGF高剂量组、中剂量组病理Metavir评分降低(P<0.01);HXRGF各剂量组MMP-2、TIMP1/2、TGFβ和Lect2 mRNA水平和蛋白表达量降低(P<0.05),HXRGF各剂量组MMP-13 mRNA水平和蛋白表达量升高(P<0.05)。结论:HXRGF可以显著改善CCl 4诱导的大鼠肝脏的炎症及纤维化程度,其机制可能是通过调控MMPs及其抑制物TIMPs的表达,降低Lect2调节血管生成,减少TGFβ的表达,从而减轻肝纤维化。

和血柔肝方对肝纤维化大鼠SphK1/S1P/S1PR信号通路的影响

目的观察和血柔肝方对肝纤维化大鼠SphK1/S1P/S1PR信号通路相关因子表达的影响,探讨其治疗肝纤维化的作用机制。方法SPF级雄性SD大鼠随机分为对照组和造模组,造模组大鼠每周2次颈背部皮下注射60%CCl4溶液(CCl4∶橄榄油=3∶2),剂量3 mL/kg,连续12周,复制肝纤维化大鼠模型。造模成功后,将造模组大鼠随机分为模型组、秋水仙碱组及和血柔肝方低、中、高剂量组,每组10只。各给药组分别予相应药液灌胃,对照组和模型组予等体积蒸馏水,每日1次,连续4周。给药结束后分别检测大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST),HE染色观察大鼠肝组织病理变化,RT-PCR检测大鼠肝组织鞘氨醇激酶1(SphK1)、1-磷酸鞘氨醇受体3(S1PR3)、细胞外信号调节激酶1(ERK1)、第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因(PTEN)、肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)及转化生长因子-β(TGF-β)mRNA表达,Western blot检测大鼠肝组织SphK1、S1PR3、ERK1、PTEN和TGF-β蛋白表达。结果与对照组比较,模型组大鼠体质量、肝质量、肝系数和脾系数显著降低(P<0.01,P<0.05),血清ALT、AST含量显著增加(P<0.01),肝脏呈深褐色、无光泽,肝体缩小,包膜粗糙,散在大小不等的结节,肝小叶结构破坏,汇管区和中央静脉间有明显桥接纤维间隔形成,并伴有少量炎性细胞浸润,肝组织TGF-β、SphK1、TRAF2、PTEN、ERK1和S1PR3 mRNA表达显著升高(P<0.01,P<0.05),TGF-β、SphK1、PTEN、ERK1、S1PR3蛋白表达显著升高(P<0.01,P<0.05);与模型组比较,各给药组大鼠体质量、肝质量、肝系数、脾质量和脾系数差异无统计学意义(P>0.05),和血柔肝方高剂量组大鼠肝脏形态和肝小叶结构改善,纤维间隔明显减少,炎性细胞浸润减少,和血柔肝方各剂量组大鼠肝组织TGF-β、SphK1、TRAF2、PTEN、ERK1和S1PR3 mRNA表达显著降低(P<0.01),TGF-β、SphK1、PTEN、ERK1、S1PR3蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论和血柔肝方可减轻CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝脏炎症及纤维化状态,尤以和血柔肝方高剂量组疗效显著,其可能通过抑制SphK1/S1P/S1PR信号轴活化状态、减少TGF-β产生,发挥治疗肝纤维化的作用。

和血柔肝方治疗慢性乙型肝炎肝纤维化临床研究

目的观察和血柔肝方治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的临床疗效及抗病毒、抗纤维化效果。方法纳入慢性乙型肝炎肝纤维化患者202例,根据患者意愿分为对照组和试验组。对照组予恩替卡韦片,0.5 mg/d,口服;试验组在对照组基础上予和血柔肝方,每日1剂,每日2次,口服。2组均12周为1个疗程,连续治疗2个疗程。比较2组患者治疗前后病毒学应答、中医症状积分、肝脏硬度值(LSM)、天冬氨酸氨基转移酶/血小板比值指数(APRI)、纤维化-4指数(FIB-4),并对肝纤维化疗效进行多因素分析,监测肝、肾功能。结果 2组治疗后乙型肝炎表面抗原(HBsAg)定量、乙肝病毒基因(HBV-DNA)阳性率及丙氨酸氨基转移酶异常率显著降低(P<0.01),但未出现HBsAg转阴。与本组治疗前比较,2组治疗后中医症状积分、LSM、APRI、FIB-4明显改善(P<0.01)。试验组治疗前后中医症状积分差值、LSM差值高于对照组(P<0.001);试验组LSM分期降低发生率高于对照组(P<0.05)。COX比例风险回归模型显示,女性、肝功能正常是肝纤维化疗效的正向影响因素;男性、年龄、肝功能异常是肝纤维化疗效的不利因素。2组肝、肾功能未见异常,未发生不良事件。结论和血柔肝方可改善慢性乙型肝炎肝纤维化程度,改善病毒学应答,安全性良好。

和血柔肝方联合熊去氧胆酸胶囊治疗原发性胆汁性胆管炎的临床疗效

目的探讨和血柔肝方联合熊去氧胆酸胶囊治疗原发性胆汁性胆管炎(Primary biliary cholangitis,PBC)的临床疗效。方法选取2017年1月—2020年1月收治的PBC患者100例,按随机数字表法分为对照组(50例)和治疗组(50例)。两组患者均给予常规保肝治疗,在此基础上对照组口服熊去氧胆酸胶囊,观察组在对照组基础上加用和血柔肝方治疗。对两组患者临床疗效、中医证候症状积分、肝功能指标、肝脏硬度值及安全性进行分析及比较。结果治疗组总有效率与对照组比较明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后治疗组中医症状积分与对照组比较明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后治疗组总胆红素(Total bilirubin,TBil)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、谷氨酰转移酶(Glutamyltransferase,GGT)、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)水平与对照组比较明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后治疗组肝脏硬度值与对照组比较明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组安全性与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论和血柔肝方联合熊去氧胆酸胶囊治疗PBC的效果显著,能明显改善患者临床症状、肝功能,且安全、可靠。

和血柔肝方治疗慢性乙型肝炎肝纤维化肝郁脾虚证的临床研究

目的观察和血柔肝方治疗慢性乙型病毒性肝炎肝纤维化肝郁脾虚证的有效性和安全性。方法纳入慢乙肝肝纤维化患者60例,且瞬时弹性成像肝脏硬度值(LSM)≥F2,中医辨证属肝郁脾虚证,按照患者意愿分为对照组(恩替卡韦单药)和治疗组(恩替卡韦联合和血柔肝方),在治疗24周后,记录患者治疗前后瞬时弹性成像肝脏硬度值(LSM)、天冬氨酸氨基转移酶和血小板比率指数(APRI)、基于4因子的纤维化指数(FIB-4)以及血常规、肝功、肾功等指标的变化,同时进行中医症状评分。结果治疗组和对照组的总有效率分别为86.67%和60.00%,2组比较,有显著性差异(P<0.05);治疗后,2组中医症状总积分较治疗前下降(P<0.05),且治疗组的降低幅度优于对照组(P<0.05);治疗后2组肝纤维化指标LSM、FIB-4、APRI较治疗前降低(P<0.05),其中LSM、APRI的降低幅度显著优于对照组(P<0.05)。结论和血柔肝方治疗肝郁脾虚型慢性乙型肝炎肝纤维化有良好的有效性和安全性。