茶树咖啡碱合成酶CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建

CRISPR/Cas9技术是一门新兴的基因组定点编辑技术,具有操作简单、高效的优点,可轻松实现对目标基因的敲除、替换和定点突变等操作。该技术刚诞生,就受到了全球生命科学领域研究者的关注,不到3年的时间就已经成功应用于多种动、植物当中。然而CRISPR/Cas9技术在茶树中的应用面临载体构建问题,本文以茶树咖啡碱合成酶为例,联合采用常规PCR、Overlapping PCR和Golden Gate Cloning技术,构建了包含茶树咖啡碱合成酶双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,为CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术在茶树中的应用奠定了坚实基础。

茶树咖啡碱合成酶基因mRNA表达的研究

采用原位杂交技术对茶树咖啡碱合成酶基因mRNA的表达进行了研究。结果表明,茶树叶片的表达主要在栅栏组织,该组织的细胞质、细胞核上均有表达,而液泡却没有;叶主脉表达分布在薄壁组织、韧皮部,但韧皮部表达稍弱;幼茎表达分布在韧皮部;不同品种之间的表达位置基本相似、表达信号却有差异。结果还显示,春梢第一片叶比秋梢第一片叶表达信号强;加工技术上绿茶摊青过程0.5 h、1 h、2 h有明显表达信号,而红茶萎凋6 h、8 h、10 h及乌龙茶摇青过程6 h、8 h、10 h的叶子则看不到。

茶树咖啡碱合成酶基因原核表达、及其抗体制备与鉴定

克隆出茶树咖啡碱合成酶基因,对其进行原核表达,并制备TCS1抗体,旨在从蛋白水平研究茶树体内TCS1的表达情况。根据Gen Bank登陆的TCS1基因的全长c DNA序列,找出其完整的ORF(开放阅读框),从茶树叶片c DNA中克隆了TCS1基因的开放阅读框,连接到p GEX-4T-2表达载体,经IPTG诱导表达重组蛋白p GEX-4T-2-TCS1。进行体外酶活检测后,亲和层析纯化重组蛋白,作为抗原免疫家兔,制备TCS1多克隆抗体。用ELISA方法检测抗体效价,Western blot检测抗体的特异性。通过优化诱导条件,得出重组蛋白的最佳表达条件为:30℃、4 h。诱导后的总蛋白、可溶性蛋白与包涵体蛋白均出现一条明显的外源蛋白条带。抗体经ELISA检测,效价为1∶2 000,Western blot检测表明抗体具有相对较好的特异性。构建了TCS1原核表达质粒,同时成功制备了抗TCS1的多克隆抗体。

茶树咖啡碱合成酶基因cDNA在烟草中的表达

为了在烟草中合成咖啡碱,将咖啡碱合成酶(Tea caffeine synthase,TCS)基因cDNA全序列克隆到双元载体pBI121中,通过农杆菌叶盘转化法将TCS基因成功转入烟草,结果得到72株转基因烟草植株。对其中3株转基因植株进行PCR检测和PCR-Southern检测,证实TCS基因已整合到基因组中;RT-PCR和Northern分析显示,TCS在这些植株中均能正常转录。用从转基因植株中提取的粗酶液进行体外酶促反应,能催化7-甲基黄嘌呤和可可碱向咖啡碱的转变,由此表明,转基因烟草植株中能产生具有正常生物学活性的TCS,但从3株转基因烟草中均未检测到咖啡碱。

咖啡碱合成酶基因在特异茶树资源种质创新中的利用

对咖啡碱合成酶基因在特异茶树资源种质创新中利用的基础、主要问题和前景进行了回顾和展望。对茶树中咖啡碱生物合成的了解及已有的茶树种质资源的发掘、保护和评价工作的良好基础与咖啡碱合成酶基因本身的研究成果成为咖啡碱合成酶基因在特异茶树资源种质创新中利用的基础。以茶树再生体系为重点的遗传转化体系的建立是咖啡碱合成酶基因在特异茶树资源种质创新利用中的主要问题。开发这种高科技育种技术体系,将有助于提升茶叶产业的技术水平和综合竞争力。

植物咖啡碱合成酶的生物信息学分析

采用生物信息学分析方法对GenBank中来源于茶树、可可、山茶等植物咖啡碱合成酶的氨基酸序列进行比对分析,就等电点、亚细胞定位、信号肽、跨膜螺旋、保守性功能结构域及基序、二级结构与三级结构等重要参数进行预测与分析。结果表明,植物咖啡碱合成酶主要定位于胞质和胞核中,含有磷酸化、酰基化和糖基化修饰位点,基于基因序列与保守结构域可被分成3种类型,其中I型与II型酶蛋白均属全α型水溶性酶蛋白,III型酶蛋白除二级结构富含无规卷曲构件,还极有可能存在信号肽序列,但3类酶蛋白均无跨膜螺旋,三级结构预测显示,I型、II型酶蛋白极为相似,由α螺旋和横向β-折叠片层组成,III型则α螺旋位于横向两端,中间由纵向β-折叠片层连接。

聚乙二醇胁迫下茶树咖啡碱合成酶基因的差异表达

应用荧光定量PCR的方法对茶树咖啡碱合成酶基因在PEG胁迫下的表达情况进行分析。结果显示,与对照相比,PEG胁迫下咖啡碱合成酶基因表达量随着胁迫时间延长呈现出先升高后降低的变化特点,胁迫的12h内表达量明显上调,胁迫6h表达量最大,之后明显下降,相对表达量变化范围为0.13-10.97。

茶树咖啡碱合成酶基因稀有等位变异TCS1g的筛选、克隆及功能

【目的】茶树咖啡碱合成酶1(TCS1)是山茶属(Camellia)茶组植物咖啡碱合成的关键酶,TCS1具有丰富的等位变异。从我国丰富的茶树种质资源中发掘TCS1稀有等位变异并研究其功能,深入解析茶树咖啡碱合成机制,为低咖啡碱育种提供新的基因资源。【方法】利用特异引物TCS1P InDel F/R对673份茶树资源中的TCS1等位变异进行鉴定;使用引物TCS1cDNAF/R,从含有新稀有等位变异的茶树资源中克隆基因的cDNA全长序列;利用生物信息学、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和原核表达等方法研究新发现稀有等位基因的功能。【结果】在部分大理茶(C.taliensis)资源中鉴定到一个新的TCS1稀有等位变异,命名为TCS1g。从大理茶资源‘龙陵17’(LL17,含有的TCS1等位变异为TCS1a和TCS1g)中克隆了TCS1g。TCS1g的编码区序列全长为1 098 bp,编码365个氨基酸,编码蛋白的分子量和理论等电点分别为40.9 kD和5.1。序列比对结果表明,TCS1g与TCS1a、TCS1b、TCS1c、TCS1d、TCS1e、TCS1f的相似度在94.1%—99.2%;与具有可可碱合成酶活性(TS)的TCS1b和TCS1c编码蛋白序列相似度均大于96.7%,而与同时具有TS和咖啡碱合成酶(CS)活性的TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f相似度都小于95.4%,且TCS1g第221位氨基酸残基与TCS1b、TCS1c同为组氨酸(His),而TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f为精氨酸(Arg)。第221位氨基酸残基位于TCS1g蛋白活性中心,该位点的突变(His突变为Arg),可以导致TCS1g的等电点(5.05变为5.06)和亲水性(-0.119变为-0.123)发生改变。此外,5′上游调控区域的比对结果显示TCS1g、TCS1b、TCS1c起始密码子(ATG)比TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f延后了15 bp。原核表达发现TCS1g具有TS活性,活性为44.3 pkat/mg,但未检测到CS活性。qRT-PCR的结果表明LL17中等位变异TCS1g有表达。LL17的咖啡碱和可可碱的含量分别为40.3 mg·g^(-1)和5.4 mg·g^(-1)。【结论】鉴定并克隆了一个新的TCS1稀有等位变异TCS1g,其在LL17中具有一定的表达水平,且其表达蛋白具有TS活性,而未检测到CS活性;推测决定TCS1g仅具有TS活性的关键位点是第221位氨基酸残基。

19份茶树资源鲜叶中咖啡碱合成酶的活性

【目的】比较七舍古茶等19份茶树资源的咖啡碱合成酶活性,为选育低咖啡碱茶树品种奠定基础。【方法】以19份茶树资源的鲜叶为试材,粗提咖啡碱合成酶,体外进行咖啡碱合成的酶促反应并用高效液相检测各反应体系的咖啡碱含量,比较不同茶树嫩叶的咖啡碱合成酶的活性。【结果】七舍古茶的咖啡碱合成酶活性最高,为0.386 U/mL;其次是保靖黄金茶、黄金叶,分别为0.661和0.090 U/mL;盘县古茶的咖啡碱合成酶活性最低,为0.038 U/mL;龙井长叶等其余15份茶树资源的咖啡碱合成酶活性差异不大,在0.043~0.07 U/mL。【结论】盘县古茶树可以作为低咖啡碱品种选育的基础材料。

南昆山毛叶茶咖啡碱合成酶的空间结构与活性位点分析

咖啡碱合成酶是茶叶中咖啡碱生物合成途径的关键酶,目前尚无对茶叶咖啡碱合成酶分子结构和催化机制的报道。预测和分析其空间结构和活性位点具有重要意义。本研究以高咖啡碱南昆山毛叶茶为材料构建c DNA文库,采用同源探针筛选c DNA文库的方法获得咖啡碱合成酶基因,通过体外原核表达对其功能进行验证,并用Modeller9.10、Autodock4.0等软件预测其编码蛋白的空间结构和活性位点,结果是:克隆得到南昆山毛叶茶咖啡碱合成酶基因MYCS1,其ORF全长1 100 bp,编码369个氨基酸,原核表达蛋白具有咖啡碱合成酶的功能;MYCS1编码蛋白的三维模型由9个α-螺旋、7个β-折叠组成,整个蛋白有一个包含β-折叠链的球形结构域和一个由独特螺旋帽组成顶盖的活性空腔。该蛋白经多氢键与甲基供体SAM结合,结合域由Asp63、Gly65、Asp103、Ser138、Phe139、Ser155等氨基酸残基构成,与甲基受体(7-m X、Tb)的结合主要通过氢键作用,并受氨基酸残基π-π堆积作用和强疏水作用的影响。结合域主要包括Phe30、Thr31、Tyr156、Trp160、Phe321等氨基酸残基。结论:南昆山毛叶茶咖啡碱合成酶具有依赖S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶家族的结构特征,底物结合位点在保守结构域,与该家族酶存在共性,特异底物识别位点存在差异,该结果为深入研究茶叶咖啡碱合成酶的催化机制奠定了基础。

茶树功能候选基因电子克隆的可行性分析

为验证电子克隆技术获取茶树功能候选基因的可行性,本研究以可可的咖啡碱合成酶基因BCS1为探针,对构建的茶树EST数据库进行本地BLAST检索,获得与BCS1具有高度同源性的茶树EST序列26条。将26条茶树EST序列经程序CAP(contig assembly program)拼接,得到2条含有独立ORF的EST簇(Contig),分别命名为基因TCSnew1和TCSnew2。将这2个基因与GenBank中由实验方法克隆得到的茶树咖啡机合成酶基因TCS的cDNA进行核酸序列、推导氨基酸序列比对,及构建系统发育树进行3个基因推导氨基酸序列间的同源性分析。结果发现,茶树远缘物种的兴趣序列作为探针用于电子克隆获取茶树功能候选基因与实验克隆技术相同,是一条可行的技术途径。